李麗芳，陳露西，賈順姬，顏光玗

(1. 南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，發(fā)育生物學(xué)教研室，廣州 510515； 2. 清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，膜生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100084)

TGF-β超家族參與調(diào)控細胞的生長、增殖、分化、凋亡，在胚胎發(fā)生以及組織器官穩(wěn)態(tài)維持的過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[1]。TGF-β信號傳遞可以通過SMAD信號通路[2]和/或DAXX信號通路[3]。SMAD信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)主要是通過膜外的TGF-β 配體結(jié)合位于膜上的TGF-βII 型受體，活化的TGF-βII型受體招募、結(jié)合并磷酸化TGF-βI型受體，激活的TGF-βI型受體磷酸化下游的受體調(diào)控型Smads(R-Smads)，磷酸化的R-Smads與Smad4形成復(fù)合體進入細胞核，與各種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合來調(diào)節(jié)下游目的基因的表達[4]。哺乳動物中，R-Smads包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5和Smad8，這些蛋白包含兩個保守的結(jié)構(gòu)域，MH1和MH2。N端的MH1結(jié)構(gòu)域主要與DNA結(jié)合，C端的MH2結(jié)構(gòu)域?qū)τ诨プ鞯鞍椎慕Y(jié)合至關(guān)重要[5]。TGF-β 超家族包括TGFβ1、TGFβ12、TGFβ13、激活素(activins)、抑制素(inhibins)、Nodal、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)和生長分化因子(GDFs)等[1]，其中Nodal信號在脊椎動物中內(nèi)胚層誘導(dǎo)、神經(jīng)誘導(dǎo)和神經(jīng)板的前后分化、左右不對稱以及背腹軸的形成過程中具有非常重要的作用[6]。Nodal信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴于下游效應(yīng)因子Smad2和Smad3。在小鼠中，Smad2缺失的小鼠不能形成前端內(nèi)臟內(nèi)胚層(AVE)[7]，不能形成A-P軸[8]。smad3突變小鼠體型偏小，有前肢畸形的表型[9]，存在黏膜免疫缺陷，但仍可存活至成年[10]。小鼠胚胎成纖維細胞中smad3缺失導(dǎo)致其不能形成Smad-DNA復(fù)合物，進而不能響應(yīng)TGF-β信號，從而調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄[9]。smad2和smad3雙純合突變體不能形成中胚層和進行原腸作用[11]。在斑馬魚中，目前沒有smad2/3純合突變體，但表達其顯性抑制形式(dnsmad2、dnsmad3a和dnsmad3b)會導(dǎo)致中內(nèi)胚層發(fā)育缺陷，過表達smad3會促進神經(jīng)誘導(dǎo)以及神經(jīng)外胚層的后部化[12]。目前這些研究主要集中在Smad2和Smad3在中內(nèi)胚層誘導(dǎo)以及前后軸線形成中的作用，但Smad2/3是否在神經(jīng)嵴的發(fā)育過程中起作用，目前尚無相關(guān)報道。

神經(jīng)嵴起源于神經(jīng)外胚層和表皮外胚層交界的雙側(cè)結(jié)構(gòu)域。當(dāng)神經(jīng)外胚層匯聚到中線形成神經(jīng)管后，神經(jīng)嵴細胞經(jīng)歷上皮-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)換，在沿著神經(jīng)管的背外側(cè)形成一個離散的間充質(zhì)細胞群，隨后以固定的時間和空間模式向特定組織部位遷移，最終形成多種分化的細胞類型，包括周圍神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞、色素細胞和顱面骨骼細胞等[13]。神經(jīng)嵴細胞的誘導(dǎo)發(fā)生主要受到BMP、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、Wnt、Notch等多種信號的調(diào)節(jié)[14]。這些信號以及其他轉(zhuǎn)錄因子，共同組成基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控神經(jīng)嵴的早期誘導(dǎo)發(fā)生、神經(jīng)嵴祖細胞的維持、神經(jīng)嵴祖細胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換以及通過不同通路向特定細胞的分化過程等。其中，F(xiàn)oxd3和Snail在早期誘導(dǎo)完成到神經(jīng)嵴邊界祖細胞確定過程中發(fā)揮了重要作用，同時其與Sox9共同在神經(jīng)嵴祖細胞多能性維持以及祖細胞從神經(jīng)管分離過程有一定的功能。此外，Sox9還與Sox10在神經(jīng)嵴細胞終末分化過程中有作用[15]。這些轉(zhuǎn)錄因子是神經(jīng)嵴細胞的標(biāo)記基因，僅在遷移前神經(jīng)嵴細胞中表達[16]。與這些基因不同，crestin在神經(jīng)嵴前體細胞以及分化細胞中均有表達，其可以被用來較靈敏地評估神經(jīng)嵴細胞或多或少的變化[13]。

目前，有一些研究結(jié)果提示Smad2以及Smad3可能在神經(jīng)嵴細胞的發(fā)育中存在一定的功能，如：斑馬魚胚胎中smad3a在遷移的軀干神經(jīng)嵴細胞中表達[17]，小鼠胚胎中smad2雜合突變可導(dǎo)致顱面缺損[18]等。本研究以斑馬魚作為模式動物，利用嗎啉環(huán)修飾的反義寡核苷酸(antisense morpholino oligonucleotide，MO)技術(shù)敲降斑馬魚smad2和smad3基因的表達,通過原位雜交檢測神經(jīng)嵴細胞標(biāo)記基因的表達來初步探究Smad2/3在神經(jīng)嵴細胞發(fā)育過程中的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

實驗中所用到的斑馬魚品系為Tuebingen(TU)。野生型胚胎置于Holtfreter水(0.025 g/L 碳酸氫鈉，0.1 g/L 無水氯化鈣，0.05 g/L 氯化鉀，3.5 g/L 氯化鈉，pH 值 6.8～7.2)中，于28.5℃培養(yǎng)至特定時期。

1.1.2 主要試劑和儀器

RNeasy Mini純化回收試劑盒(Qiagen，# 74104，美國)，DNA純化回收試劑盒(# DP214，天跟生化科技有限公司，北京)，GoScript 隨機引物反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega，# A2790，北京照生萊博商貿(mào)有限公司)，mMESSAGE mMACHINE T7/SP6轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Ambion，# AM1345/AM1340，美國)，地高辛標(biāo)記RNA試劑盒(Roche，# 11175025910，美國)，BamH Ι(NEB，# R3136S，美國)，Not Ι(NEB，# R3189S，美國), 封閉劑(Roche，# 11096176001美國)，左旋咪唑(Sigma，# 16595-80-5，美國)，地高辛抗體(Roche，# 11093274910)，BM Purple AP(Roche，# 11442074001，美國)，徠卡體視顯微鏡(M125 C，德國)。

1.2 方法

1.2.1 反義寡核苷酸的設(shè)計與合成

根據(jù)smad2的前體mRNA序列設(shè)計2個反義寡核苷酸，其中MO1序列位于第4個外顯子和第4個內(nèi)含子的交接處，MO2序列位于第4個內(nèi)含子和第5個外顯子交接處。序列分別為smad2-MO1(簡稱smad2 SM1)：5’-CAATTTCCATACCTGGTG TCTCCAC-3’，smad2-MO2(簡稱smad2 SM2)：5’-AAGAACTACAGGAGAGAAGATTAAA-3’。MO由GeneTools公司合成，合成好的MO粉末用無核酸酶的純水溶解成20 μg/μL的貯液，-80℃凍存。使用時將MO稀釋到合適濃度進行顯微注射。smad3a/bMO和p53 MO的序列和信息詳見已報道的文獻[12]。

1.2.2 檢測MO效率的引物設(shè)計

根據(jù)斑馬魚smad2基因的核酸序列，分別在MO所在區(qū)域的上下游約150 bp處設(shè)計檢測引物。同時為了確定smad2 SM1和smad2 SM2共同注射是否會使得敲降效率更高，上游引物設(shè)計在第3個外顯子，下游引物位于第6個外顯子。陽性對照引物位于第2個外顯子上。序列信息如表1所示。

1.2.3 胚胎總RNA的提取和cDNA的合成

本研究使用RNeasy Mini試劑盒提取胚胎總RNA，其后使用隨機引物反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA。提取總RNA需取15～30枚處于6體節(jié)時期經(jīng)過不同處理的胚胎，用蛋白酶脫去絨毛膜，再用DEPC水清洗兩次后，加入600 μL 裂解液RLT和 24 μL 二硫蘇糖醇(DTT，1 mol/L)，渦旋振蕩使細胞充分裂解，直至無肉眼明顯可見的顆粒。后續(xù)的詳細步驟以及cDNA合成步驟參見產(chǎn)品說明書。

表1 smad2 MO有效性驗證的引物名稱及序列Table 1 Primer names and sequences for smad2 MO validity detection

1.2.4 體外合成mRNA及純化回收

用于體外合成casmad2 mRNA和smad3amRNA的質(zhì)粒信息詳見之前的報道[12, 19]。提取12 μg質(zhì)粒用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割，純化后獲得線性化DNA模板，然后體外合成mRNA，并將mRNA純化回收，于-80℃保存。體外合成mRNA及mRNA的純化回收的具體步驟參見產(chǎn)品說明書。

1.2.5 MO和mRNA的顯微注射

smad2 SM1的注射劑量為5 ng，SM2的注射劑量為5 ng；smad3a/bMO的注射劑量均為5 ng；p53 MO的注射劑量為5 ng；casmad2 mRNA的注射劑量為5 pg；smad3amRNA的注射劑量為20 pg。將合成的MO及mRNA注射到斑馬魚單細胞時期的受精卵中，待胚胎發(fā)育至6體節(jié)時，用蛋白酶脫去絨毛膜，甲醛固定過夜后，梯度脫水(25%，50%，100%，100%)于甲醇中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 斑馬魚整胚原位雜交

選取crestin，snail1b和foxd3基因靠近3’UTR區(qū)域的一段cDNA序列作為探針的模板。設(shè)計引物用于模板的擴增，其中下游引物5’端有T7啟動子序列，序列信息如表2所示。擴增后的產(chǎn)物經(jīng)回收后可直接用于合成地高辛標(biāo)記的反義RNA探針。合成的探針用原位雜交液HYB+(50%甲酰胺，5 × SSC，0.1% Tween-20，0.5 mg/mL酵母RNA，0.05 mg/mL肝素)稀釋到1.5%使用。探針使用之前，需于72℃變性處理10 min。sox10探針的序列信息詳見已報道的文獻[20]。

雜交第1天，取大約30枚胚胎到無核酸酶的EP管中，用配制在DEPC水中的PBST溶液梯度水化，水化后置換成 1 mL 4%多聚甲醛，室溫固定20 min。然后用1 mL PBST溶液洗滌二次，每次5 min。吸走PBST溶液，加入300 μL 65℃預(yù)熱的HYB-(50%甲酰胺，5 × SSC，0.1% Tween-20)溶液，65℃放置5 min；再置換成300 μL HYB+溶液，65℃預(yù)雜交3～4 h。將探針稀釋，于72℃變性10 min后，立即置于冰上，用100 μL探針稀釋液置換HYB+溶液，65℃水浴雜交12～16 h。第2天吸出探針，-20℃保存并可重復(fù)使用。胚胎用洗液I(50%甲酰胺，2× SSC，0.1% Tween-20)65℃洗2次，每次30 min，之后置換成2× SSCT溶液于65℃洗滌胚胎15 min。然后依次用0.2× SSCT溶液和0.02× SSCT溶液洗滌胚胎4次，每個濃度兩次，每次30 min。然后置換成MABT溶液，室溫放置5 min，重復(fù)一次后，換成封閉液(滅活山羊血清、10%封閉劑和MABT按照1∶2∶7比例混合)，室溫孵育1 h。之后，置換成抗體孵育液(堿性磷酸酶標(biāo)記的地高辛抗體按1∶3000的比例稀釋于封閉液中)，4℃孵育12～16 h。第3天，吸走抗體孵育液，加入含10%滅活山羊血清的MABT溶液，室溫搖動30 min；置換成MABT溶液，搖動30 min，再重復(fù)2次，時間依次為1 h和30 min。之后置換成染色緩沖液(100 mmol/L氯化鈉，50 mmol/L氯化鎂，100 mmol/L Tris-Cl，1 mmol/L左旋咪唑和 0.1% Tween-20)，室溫放置 5 min，重復(fù)3次。然后將胚胎轉(zhuǎn)移至48孔板中，除去染色緩沖液，加入200 μL底物，用錫箔紙包裹后于室溫反應(yīng)。每30 min取出觀察顯色結(jié)果。待顯色充分后，吸走底物，用PBST溶液洗滌兩次，然后置換成4%多聚甲醛，4℃放置過夜以終止反應(yīng)。用PBST 溶液洗滌胚胎兩次后，置換成甘油，待胚胎完全浸潤后在徠卡體式顯微鏡下進行拍照。

表2 合成探針模板的引物名稱及序列Table 2 Primer names and sequences of the synthetic probe templates

2 結(jié)果

2.1 利用MO抑制smad2的表達

根據(jù)smad2的基因結(jié)構(gòu)，本研究設(shè)計了兩條針對性干擾smad2第4、5外顯子剪接的MO，分別命名為SM1和SM2。為了確定smad2 SM1和SM2是否可以干擾其正確剪接過程，從而下調(diào)smad2基因的表達，我們提取了未注射和不同注射組胚胎的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并通過不同位置的檢測引物對目的片段擴增(引物位置如圖1A所示)。

核酸凝膠電泳顯示注射SM1和SM2后，smad2前體mRNA的剪接被破壞。其中，actin引物擴增的目的條帶大小和亮度在各個樣品中一致，表明各樣品間總RNA的量一致；陽性對照引物擴增的條帶在各處理組間基本一致，表明smad2 mRNA的總量變化不大；與未注射組相比，在不同MO注射組中，MO引物擴增的目的條帶相對較少，表明smad2第4和5號外顯子正確剪接的比率降低，其中SM1的效率高于SM2，并且SM1與SM2共注幾乎可以阻止smad2進行正確剪接；在MO注射組中，SM1與SM2引物擴增出非正確剪接的條帶，表明4號內(nèi)含子被保留下來，從而干擾正常smad2 mRNA的表達(如圖1B所示)。

注：A. smad2 SM1/2有效性驗證引物設(shè)計示意圖。青色引物和紫色引物分別用于檢測單獨注射SM1和SM2的有效性，綠色引物用于檢測SM1和SM2共同注射的有效性，藍色引物作為陽性對照。紅色短線標(biāo)明SM1和SM2的結(jié)合位置。B. DNA電泳結(jié)果顯示SM1/2對smad2 mRNA剪接正確性的影響。箭頭表示目的條帶，三角箭頭表示新出現(xiàn)的剪接體。圖1 smad2 SM1和SM2有效性檢測Note. A. Schematic design of the smad2 SM1/2 primer validation. Cyan primers and purple primers were used to detect the effectiveness of SM1 and SM2 injection alone, green primers were used to detect the effectiveness of SM1 and SM2 injection together, and blue primers were used as positive control. The red short line indicated the combination position of SM1 and SM2. B. DNA electrophoresis results showed that SM1/2 affected the splicing accuracy of smad2 mRNA. The arrow represented the target band, and the triangular arrow showed the emerging splice.Figure 1 Validity detection of the smad2 SM1 and SM2

2.2 p53 MO不會影響神經(jīng)嵴細胞的發(fā)育

由于注射MO可能會引起p53信號通路的激活，進而導(dǎo)致細胞凋亡等非特異性表型的出現(xiàn)[21]。并且之前的文獻表明與p53 MO共同注射可以挽救smad3 MO引起的凋亡表型[12]。為此，我們注射p53 MO至單細胞受精卵中，通過原位雜交檢測神經(jīng)嵴細胞標(biāo)記基因snail1b，sox10，foxd3及crestin的表達情況。結(jié)果顯示，與野生型胚胎相比，注射p53 MO的胚胎snail1b，sox10，foxd3和crestin的表達量均無明顯變化(圖2)，表明p53的敲低并不會影響神經(jīng)嵴細胞的發(fā)育。因此，在接下來的研究中，為了避免非特異的調(diào)亡現(xiàn)象，我們注射smad2 MO以及smad3a/bMO的同時，均會與同濃度的p53 MO共注射。

注：6體節(jié)時期神經(jīng)嵴細胞標(biāo)記基因的原位雜交結(jié)果(bar=200 μm)。(下圖同)圖2 p53 MO不會影響神經(jīng)嵴細胞的發(fā)育Note. In situ hybridization of marker genes of neural crest cells at 6-somite stage (bar=200 μm). (The same in the following figures)Figure 2 p53 MO does not affect the development of neural crest cells

2.3 敲低smad2/3對不同神經(jīng)嵴細胞標(biāo)記基因的影響

為了探究Smad2/3對神經(jīng)嵴細胞發(fā)育的影響，我們分別將smad2 SM1、smad2 SM2、smad3aMO和smad3bMO注射到野生型斑馬魚單細胞期的受精卵中，待胚胎發(fā)育至6體節(jié)時通過原位雜交檢測神經(jīng)嵴細胞標(biāo)記基因snail1b、sox10、foxd3和crestin的表達情況。原位雜交結(jié)果顯示，smad2/3a被敲低后，crestin的表達量顯著降低，snail1b、sox10和foxd3的表達量無明顯變化；smad3b被敲低后，snail1b、sox10、foxd3和crestin的表達量均無明顯變化(圖3)。crestin是斑馬魚中特異標(biāo)記所有神經(jīng)嵴細胞的標(biāo)志基因，其表達量的顯著降低預(yù)示smad2/3a敲低使得神經(jīng)嵴細胞發(fā)育異常。因此，在接下來的實驗中，我們選擇神經(jīng)嵴細胞標(biāo)記基因crestin作為研究對象探究Smad2/3a對神經(jīng)嵴細胞發(fā)育的影響。

圖3 敲低smad2/3a對不同神經(jīng)嵴細胞標(biāo)記基因的影響Figure 3 Effect of smad2/3 knockdown on the expression of marker genes in different neural crest cells

2.4 敲低smad2/3a會特異抑制crestin表達

為了探究Smad2和Smad3a對神經(jīng)嵴細胞發(fā)育的影響，我們分別將smad2 SM1/SM2和smad3aMO注射到野生型斑馬魚單細胞期的受精卵中，待胚胎發(fā)育至6體節(jié)時檢測crestin的表達情況。原位雜交結(jié)果表明smad2/3a敲低使crestin表達下降，與前面的結(jié)果保持一致(圖4)。為了進一步確定Smad2和Smad3a對crestin的影響是否特異，本研究通過體外合成了casmad2 mRNA和smad3amRNA，分別在單細胞時期注入野生型胚胎，6體節(jié)時通過原位雜交檢測crestin的表達情況。caSmad2是持續(xù)激活形式的Smad2，該突變體不含有MH1結(jié)構(gòu)域，其位于羧基端的絲氨酸-甲硫氨酸-絲氨酸(SMS)基序被突變?yōu)樘於彼?甲硫氨酸-天冬氨酸(DMD)基序，以此來模擬Smad2被受體激活的磷酸化狀態(tài)。之前的研究表明在斑馬魚中，過表達全長的smad2不會對胚胎造成任何影響，但過表達casmad2則導(dǎo)致嚴(yán)重的背部化和第二體軸的形成[17]，表明caSmad2是Smad2的持續(xù)激活形式，可以更有效的激活下游信號傳導(dǎo)。結(jié)果顯示，注射了casmad2 mRNA和smad3amRNA后，crestin的表達量升高(圖4)。敲低和過表達smad2/3a對crestin的表達產(chǎn)生相反的結(jié)果，由此我們推測Smad2/3a特異性地調(diào)控crestin的表達。

圖4 smad2/3a特異性地調(diào)控crestin的表達Figure 4 smad2/3a specifically regulates the expression of crestin

2.5 過表達casmad2和smad3a可拯救smad2/3a敲降所導(dǎo)致crestin的低表達

為了確定crestin的低表達是由smad2及smad3a基因敲降直接造成的，我們分別將smad2 SM1/SM2和casmad2 mRNA及smad3aMO和smad3amRNA共注射到野生型斑馬魚單細胞期的受精卵中。待胚胎發(fā)育到6體節(jié)時，通過原位雜交檢測crestin的表達是否被挽救。結(jié)果顯示，與單獨注射MO的胚胎相比，MO和mRNA共注射胚胎中crestin的表達量基本可以回歸到野生型胚胎的水平(圖5)，進一步表明Smad2和Smad3a在神經(jīng)嵴細胞的發(fā)育過程中特異性地調(diào)控crestin的表達。

圖5 過表達casmad2和smad3a可拯救smad2/3a敲降所導(dǎo)致crestin的低表達Figure 5 Overexpression of casmad2 and smad3a rescues the down-regulation of crestin caused by smad2/3a MO injection

3 討論

神經(jīng)嵴起源于神經(jīng)板的邊界，其誘導(dǎo)發(fā)生、分化和遷移受到一系列轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，如Snail，Sox9，Sox10，F(xiàn)oxd3等[16]。Foxd3在維持神經(jīng)嵴細胞祖細胞未分化狀態(tài)發(fā)揮了重要作用，foxd3突變體胚胎存在嚴(yán)重的顱面畸形、色素較少的表型，其缺失導(dǎo)致sox10，sox9b，snail1b和crestin的表達均下調(diào)[22]。Sox9b對顱骨神經(jīng)嵴細胞遷移過程有影響，缺失sox9b導(dǎo)致胚胎僅有較少的軟骨細胞，而且sox9b的表達減少或增加都會影響sox10，snail1b，foxd3和crestin的正常表達[23]。Sox10在軀干和迷走神經(jīng)嵴細胞分化遷移過程中有一定的作用，缺失sox10的突變體胚胎缺乏色素，神經(jīng)嵴細胞在遷移過程中凋亡[24]。Snail1b表達量的增加或減少導(dǎo)致神經(jīng)嵴區(qū)域增加或神經(jīng)嵴細胞分化遷移受阻，同時snail1b可直接調(diào)控神經(jīng)嵴細胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換過程，進而影響神經(jīng)嵴細胞的發(fā)育[25]。本研究結(jié)果顯示敲低smad2/3a后，6體節(jié)時期胚胎中foxd3，snail1b和sox10的表達量變化并不明顯，可能是因為Smad2/3a對于這些轉(zhuǎn)錄因子并沒有直接調(diào)控作用，或者是需要其他信號通路的協(xié)同作用，單一信號通路的抑制并不會使這些轉(zhuǎn)錄因子的表達受到明顯影響。而crestin有可能可以受到smad2/3a的直接調(diào)控。當(dāng)然，要更進一步探究Smad2/3a對神經(jīng)嵴細胞發(fā)育的影響，如對色素細胞、軟骨細胞等形成的調(diào)控，我們需收集10～12體節(jié)甚至更晚時期smad2/3a敲低、甚至是相應(yīng)基因敲除的胚胎，檢測上述神經(jīng)嵴細胞標(biāo)記基因及下游分化細胞標(biāo)記基因的表達，確定Smad2/3a在神經(jīng)嵴細胞發(fā)育中的功能。

smad2/3a的表達被敲低后，crestin的表達顯著降低，而且這種低表達可以被smad2/3a的過表達所挽救，意味著smad2/3a調(diào)控crestin的表達是特異地，為此我們通過生物信息學(xué)手段分析了crestin的啟動子序列，發(fā)現(xiàn)crestin啟動子序列中存在著Smad2/3a的潛在結(jié)合區(qū)，說明Smad2/3a可能通過與crestin啟動子直接相互作用，從而調(diào)控crestin的表達，這種相互作用需要進一步的ChIP實驗來驗證。此外，之前的研究結(jié)果表明在crestin的啟動子區(qū)域存在包含sox10在內(nèi)的多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，突變sox10結(jié)合位點導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因魚Tg(crestin:EGFP) 的綠色熒光表達顯著降低，說明crestin受到sox10等多種神經(jīng)嵴轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[26]。經(jīng)過分析，我們確實發(fā)現(xiàn)在crestin啟動子區(qū)還存在Sox家族蛋白的潛在結(jié)合位點，說明Sox可能作為上游調(diào)控因子參與調(diào)控crestin的表達。在爪蟾中，Smad3與含有高遷移率(HMG)結(jié)構(gòu)域的淋巴增強劑結(jié)合因子1/T細胞特異性因子(LEF1/TCF)存在物理相互作用[27]，而Sox9是含有HMG域的轉(zhuǎn)錄因子，提示Smad3a可能與Sox9b存在相互作用，共同調(diào)控crestin的表達，但這需要通過免疫共沉淀實驗來證明。

斑馬魚胚胎神經(jīng)嵴細胞的發(fā)育受一系列信號通路和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，其中任何一因子功能的缺失都會導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常。本研究首次證實Smad2/3a對神經(jīng)嵴細胞特異性標(biāo)記基因crestin的表達有調(diào)控作用，這為后續(xù)進一步研究Smad2/3a或其介導(dǎo)的TGF-β信號通路在神經(jīng)嵴細胞發(fā)育過程中的功能奠定了基礎(chǔ)。