蔣學(xué)泉，張文云*，李娜，何武書，和麗佳，袁艷波

(1. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二〇醫(yī)院口腔科 昆明 650032；2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心，昆明 650118)

因外傷、腫瘤、牙周病及長期缺失牙等原因造成的頜面部骨缺損，嚴(yán)重影響患者的功能、外形和生活質(zhì)量，需要通過植骨術(shù)來修復(fù)重建骨缺損[1]。然而常常因植骨術(shù)后繼發(fā)感染而導(dǎo)致失敗，如何在徹底控制感染的同時促進(jìn)骨質(zhì)的生長愈合，成為目前研究的熱點[2]。Ripamonti等[3]發(fā)現(xiàn)Ca.P生物材料植入實驗動物非骨部位的HA表面形成了類骨質(zhì)，但以樹鼩作為人工骨材料的實驗動物目前還未見報道。本課題組前期制備得到多孔復(fù)合材料HAPw/n-ZnO，實驗證明該復(fù)合材料有優(yōu)良的抗菌能力和一定的成骨能力。本實驗將多孔復(fù)合材料HAPw/n-ZnO植入樹鼩背部肌肉內(nèi)并通過大體觀察、組織病理學(xué)等檢測分析多孔復(fù)合材料HAPw/n-ZnO的生物學(xué)性能，為構(gòu)建新型抗菌骨修復(fù)材料提供部分實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

選用12月齡清潔級樹鼩15只，雌雄不限，體重120～140 g，無背部疾患，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所【SCXK(滇)K2013-0001】提供，在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心【SYXK(滇)K2013-0001】完成動物實驗。實驗方案獲得中國人民解放軍第九二〇醫(yī)院倫理委員會通過(2016009)。

1.1.2 試劑與儀器

多孔復(fù)合材料HAPw/n-ZnO(自制于昆明理工大學(xué)生物工程材料實驗室)、Bio-Oss骨粉(瑞士 Geistlich集團(tuán))、法國ATLANTIK人工骨(法國)，金氏植骨靈(中國)ALP試劑盒、Masson染色試劑及蘇木精-伊紅染液均來自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型的構(gòu)建

將所有骨修復(fù)材料用60Co照射消毒，手術(shù)器械進(jìn)行高溫高壓消毒，備用。樹鼩術(shù)前12 h常規(guī)禁食，背部術(shù)區(qū)備皮，用質(zhì)量濃度為6 g/L的戊巴比妥鈉經(jīng)肌肉注射0.1 mL麻醉，背部棘突正中5 cm長皮膚切口，切開皮膚及皮下組織，暴露肌肉組織，于背部肌間隙內(nèi)以止血鉗鈍性分離，制成雙側(cè)背部肌袋模型，每側(cè)兩個肌袋，前后共四個肌袋，每個肌袋間前后距離6 cm，左右距離2.5 cm。分別植入多孔復(fù)合材料HAPw/n-ZnO、Bio-Oss骨粉、ATLANTIK人工骨和金世植骨靈各0.1 mL。人工骨材料植入后逐層縫合肌層及皮膚，縫合皮膚后碘伏消毒，術(shù)后常規(guī)分籠飼養(yǎng)。術(shù)后處理：(1)每只樹鼩肌肉注射青霉素(10萬U/d)，1次/d，共3 d；(2)術(shù)后進(jìn)軟食，10 d后拆線；(3)定期觀察動物狀態(tài)及傷口愈合情況。

1.2.2 實驗分組

以四個不同的植入位點分為四組，多孔復(fù)合材料HAPw/n-ZnO組為實驗組，其余三組為平行對照組。

1.2.3 標(biāo)本處理

分別于術(shù)后4、8、12 周行質(zhì)量濃度為6 g/L戊巴比妥鈉1 mL麻醉后犧牲4 只樹鼩。待樹鼩心跳停止后，將其固定在手術(shù)臺上，沿原手術(shù)入路切開皮膚，將植入材料及包裹材料的肌肉組織一并取出，取出部位肌肉大小為邊長1 cm方形，厚度約0.5 cm。取出后行大體觀察，剖開后一部分置入4%的甲醛中固定48 h，一部分行堿性磷酸活性及鈣含量測定，行堿性磷酸活性及鈣含量測定時隨機(jī)取一塊大小相同的大腿部正常肌肉組織作為空白對照組。剩余樹鼩繼續(xù)按同等條件飼養(yǎng)。

1.2.4 組織學(xué)觀察

不同時期處死的標(biāo)本固定完成并修整標(biāo)本塊后通過脫鈣、 流水沖洗、 脫水透明、 浸蠟包埋。然后以植入材料區(qū)域為中心做矢狀面組織切片， 切片厚 5 μm，分別行HE染色和Masson三色染色，二甲苯透明中性樹膠封固，光鏡下觀察。

1.2.5 堿性磷酸酶活性測定

取約0.2 g標(biāo)本組織稱重后，加入l mL去離子水研磨成勻漿，吸入離心管中，用l mL去離子水洗勻漿2次，均吸入同離心管，4℃下離心30 min (12 000 r/min)，加細(xì)胞裂解液破膜。按ALP試劑盒進(jìn)行檢測，于520 nm波長處測定吸光度，并按其提供公式計算各管中計算單位質(zhì)量標(biāo)本組織ALP活性(kat/g)。

1.2.6 鈣含量測定

將植入物周圍組織的去上清離心沉淀物用鹽酸消化，用原子吸收分光光度儀測定鈣含量，以標(biāo)本濕重(mg)為除數(shù)，得出單位重量標(biāo)本含鈣量(μg/mg濕重組織)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大體觀察結(jié)果

所有實驗動物術(shù)后同一條件下分籠飼養(yǎng)， 其活動、 進(jìn)食、 精神狀態(tài)良好，背部創(chuàng)口均為一期愈合，無明顯感染、無材料脫落現(xiàn)象。術(shù)后 1～5 d，背部術(shù)區(qū)創(chuàng)面黏膜略充血發(fā)紅，術(shù)后 10 d所有動物背部術(shù)區(qū)創(chuàng)面愈合，可拆線。

2.2 組織學(xué)結(jié)果

2.2.1 大體觀察

術(shù)后4周，可見植入材料分散在肌肉內(nèi)，材料硬度高,骨修復(fù)材料顆粒棱角分明，骨材料表面部分肌肉附著；術(shù)后8周，植入骨材料在肌肉內(nèi)呈分散狀態(tài)，骨修復(fù)材料顆粒棱角較4周時明顯變圓鈍，骨修復(fù)材料已被肌肉完全包裹；術(shù)后12周，可見植入材料在肌肉內(nèi)更加分散，骨修復(fù)材料表面圓鈍，表面完全被肌肉附著，材料較大的空隙內(nèi)可見有軟組織生長。

2.2.2 HE染色的組織學(xué)改變

(1)術(shù)后4周：各組植入材料均較硬,且材料顆粒與顆粒之間呈分散狀，無法行常規(guī)組織切片。

(2)術(shù)后8周：由圖1可見：實驗組植入材料局部可見鈣化灶(約5%)，植入材料周邊可見纖維組織增生(5%～10%)，實驗組較多異物巨細(xì)胞，明顯聚集，無其他炎癥細(xì)胞，表明多孔HAPw/n-ZnO復(fù)合材料引起了機(jī)體炎癥反應(yīng)；ATLANTIK人工骨組植入材料局部可見鈣化灶(約5%)，植入材料周邊可見纖維組織增生(5%～10%)；Bio-Oss組：植入材料局部和肌間質(zhì)內(nèi)可見鈣化灶(5%～10%)，植入材料周邊可見纖維組織增生；金世植骨靈組植入材料局部和肌間質(zhì)內(nèi)可見鈣化灶(5%～10%)，植入材料周邊可見纖維組織增生。

(3)術(shù)后12周：圖2可見：實驗組植入材料局部可見鈣化灶(5%～10%)，植入材料周邊可見較多纖維組織增生(10%～15%)，實驗組較多異物巨細(xì)胞，明顯聚集； ATLANTIK人工骨組植入材料局部可見鈣化灶(5%～10%)，植入材料周邊可見纖維組織增生(5%～10%)；Bio-Oss組：植入材料局部和肌間質(zhì)內(nèi)可見鈣化灶(約10%)，植入材料周邊可見纖維組織增生；金世植骨靈組植入材料局部和肌間質(zhì)內(nèi)可見鈣化灶(約10%)，植入材料周邊可見纖維組織增生。

2.2.3 Masson三色染色觀察膠原纖維分布

(1)術(shù)后4周：植入材料過硬，無法行常規(guī)組織切片。

(2)術(shù)后8周：由圖3可見，實驗組植入材料周邊少量綠染的骨膠原纖維，肌肉間質(zhì)內(nèi)未發(fā)現(xiàn)骨膠原纖維； ATLANTIK人工骨組：植入材料周邊出現(xiàn)少量綠染的骨膠原纖維，肌肉間質(zhì)內(nèi)未發(fā)現(xiàn)骨膠原纖維，但顏色較實驗組深；Bio-Oss組：植入材料周邊和肌肉間質(zhì)內(nèi)均發(fā)現(xiàn)少量綠染的骨膠原纖維，顏色較實驗組深；金世植骨靈組：結(jié)果與Bio-Oss組基本一致。

Masson三色染色結(jié)果綠染的骨膠原纖維說明有少量不成熟的骨組織，Bio-Oss組與金世植骨靈組綠染的范圍與深度均優(yōu)于實驗組。ATLANTIK人工骨組則略優(yōu)于實驗組。

圖1 術(shù)后8周植入材料周圍的肌肉組織的病理改變(HE染色,×400)Figure 1 Histology of the muscle tissues around implant material at 8 weeks after surgery(HE staining，×400)

圖2 術(shù)后12周植入材料周圍肌肉組織的組織學(xué)改變(HE染色，×400)Figure 2 Histological changes in the muscle tissues aound the implant material at 12 weeks after surgery(HE staining，×400)

圖3 術(shù)后8周肌肉組織中的骨膠原分布(Masson三色染色，×400)Figure 3 Distribution of collagen fibers in the bone tissues at 8 weeks after surgery(Masson trichrome staining，×400)

(3)術(shù)后12周：由圖4可見：各組植入材料周邊出現(xiàn)綠染的范圍較8周時并無明顯變化，但色澤較8周時略深，各組均沒有出現(xiàn)藍(lán)染和紅染。

實驗組和ATLANTIK人工骨組依然只有植入材料周邊出現(xiàn)少量綠染的骨膠原纖維，肌肉間質(zhì)內(nèi)未發(fā)現(xiàn)骨膠原纖維； Bio-Oss組與金世植骨靈組：植入材料周邊和肌肉間質(zhì)內(nèi)均發(fā)現(xiàn)少量綠染的骨膠原纖維，顏色較實驗組和8周時變深。

Masson三色染色有綠、藍(lán)、紅三色，由綠至紅說明骨質(zhì)變得更為成熟。Bio-Oss組與金世植骨靈組綠染的范圍與深度均優(yōu)于實驗組，ATLANTIK人工骨組則略優(yōu)于實驗組，但均未在8周時在樹鼩背部肌肉內(nèi)誘導(dǎo)出較為成熟的骨組織，但均體現(xiàn)出較強(qiáng)的體內(nèi)生物活性。

2.3 堿性磷酸酶活性檢測結(jié)果

在三個不同的時間段，實驗組較Bio-Oss組、金世植骨靈組和正常肌肉組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)，Bio-Oss組與金世植骨靈組優(yōu)于實驗組，實驗組優(yōu)于正常肌肉組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與ATLANTIK人工骨組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。見表1。

圖4 術(shù)后12周肌肉組織內(nèi)的膠原纖維分布(Masson三色染色，×400)Figure 4 Distribution of collagen fibers in the bone tissues at 12 weeks after surgery(Masson trichrome staining，×400)

組別Groups4周4 weeks8周8 weeks12周12 weeksATLANTIK人工骨ATLANTIK artificial bone0.60 ± 0.150.72 ± 0.250.85 ± 0.30實驗組Experimental group0.58 ± 0.700.68 ± 0.300.80 ± 0.31Bio-Oss Bio-Oss1.10 ± 0.181.30 ± 0.301.50 ± 0.36金世植骨靈Jinshi Zhiguling artificial bone1.15 ± 0.211.52 ± 0.351.68 ± 0.42正常肌肉Normal muscle0.18 ± 0.040.18 ± 0.040.18 ± 0.04

表2 各組肌肉組織中鈣含量在不同時間點的變化Table 2 Calcium content in the muscle tissues in each group at different time points s, μg/mg)

2.4 鈣含量檢測結(jié)果

在三個不同的時間段，實驗組較Bio-Oss組、金世植骨靈組和正常肌肉組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)，Bio-Oss組與金世植骨靈組優(yōu)于實驗組，實驗組優(yōu)于正常肌肉組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與ATLANTIK人工骨組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。鈣含量檢測結(jié)果見表2。

3 討論

選擇合適的動物作為骨修復(fù)材料肌肉植入是研究的前提及基礎(chǔ)[4-5]。很多研究報道鈣磷陶瓷植入狒狒、犬、羊、豬、兔、鼠的非骨性部位(如肌肉和皮下)有骨誘導(dǎo)出現(xiàn)[6-7]，不同的結(jié)果可能是因為動物種屬間的差異和植入物差異造成。但以樹鼩作為人工骨材料肌肉植入實驗的實驗動物還未見報道。

在本實驗中的四種人工骨，除本課題組自制的多孔復(fù)合材料HAPw/n-ZnO外其余三種均已用于臨床，ATLANTIK人工骨主要成分為70%的羥基磷灰石與30%的磷酸三鈣；Bio-Oss為脫鈣牛骨；金世植骨靈為經(jīng)過特殊處理并復(fù)合BMP的牛骨。將四種人工骨材料植入樹鼩背部肌肉中，最長為12周。通過組織學(xué)觀察，均未發(fā)現(xiàn)成熟的新生骨組織出現(xiàn)，但出現(xiàn)一些鈣化灶和幼稚的骨膠原纖維即本研究制備的多孔HAPw/n-ZnO復(fù)合材料與植入樹鼩背部肌肉12周后并未誘導(dǎo)出成熟的骨質(zhì)，尚不能說明多孔復(fù)合材料HAPw/n-ZnO是否具有異位成骨能力，但體現(xiàn)出一定的成骨活性。種植體植入部位，也同樣影響種植體內(nèi)骨形成。為了順利誘導(dǎo)出骨細(xì)胞產(chǎn)生，脫鈣骨基質(zhì)通常種植部位是在小鼠的后肢股部肌肉陷窩內(nèi)，大鼠及兔子的腹部肌肉內(nèi)及狗頸背部肌肉內(nèi)。因而，種植體植入部位選擇不當(dāng)可能無法誘導(dǎo)骨形成[8-9]。樹鼩作為人工骨材料軟組織植入實驗動物目前在國內(nèi)外還未見報道，樹鼩在生理解剖、神經(jīng)發(fā)育、肝炎病毒感染特性及心理應(yīng)激模式等方面與靈長類，甚至與人類高度相似[10-11]，且樹鼩具有較強(qiáng)的抗感染能力，其大腿部肌肉和背部肌肉可作為口腔科填充類骨材料肌肉植入模型的選擇，但因為樹鼩個體較小，肌肉較薄，如果是塊狀骨材料植入時不易操作。本研究結(jié)果顯示，樹鼩可成功構(gòu)建骨材料肌肉植入動物模型。與非人靈長類動物相比，樹鼩來源廣泛、價格低廉，可預(yù)測樹鼩在口腔骨材料相關(guān)研究中具有良好的應(yīng)用前景。

本研究通過ALP及鈣含量活性檢測發(fā)現(xiàn)Bio-Oss組與金世植骨靈組優(yōu)于實驗組，實驗組優(yōu)于正常肌肉組，與ATLANTIK人工骨組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。ALP是成骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化的代表性酶，ALP作為成骨細(xì)胞表型特征之一，在體內(nèi)外鈣化中起關(guān)鍵性作用，隨著ALP升高的同時出現(xiàn)大量鈣鹽的沉積，ALP活性越高，表明成骨前體細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化越明顯[12-13]。本實驗中組織學(xué)發(fā)現(xiàn)實驗組與ATLANTIK人工骨組植入材料表面有鈣化灶，Bio-Oss組與金氏植骨靈組在植入材料表面與肌肉間質(zhì)內(nèi)均發(fā)現(xiàn)有鈣化灶，表明植入材料表現(xiàn)出生物活性，為骨組織形成提供了部分條件。

本實驗不足之處：首先樹鼩用量較少，其次觀察時間較短，不能更好的了解骨材料的異位成骨能力。

本實驗中，實驗組中機(jī)體出現(xiàn)了炎癥反應(yīng)且長時間存在，該結(jié)果與國內(nèi)外的一些研究符合。國外研究認(rèn)為，n-ZnO導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生過量的活性氧，使細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化狀態(tài)失去平衡，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷。如何在發(fā)揮n-ZnO優(yōu)異的抗菌性能的同時避免其引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[14-17]，本課題組將進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

多孔復(fù)合材料HAPw/n-ZnO植入到樹鼩背部肌肉中12周后未異位成骨，對照組骨修復(fù)材料也未異位成骨，但均體現(xiàn)出異位成骨潛力；多孔復(fù)合材料HAPw/n-ZnO植入機(jī)體后引起炎癥反應(yīng)。