王阿妮 盧慧芳 王梁 危小良 彭湖 李志輝 金莉子

利拉魯肽(Liraglutite)是一種新型抗糖尿病藥，通過增加葡萄糖依賴性胰島素分泌、抑制胰高血糖素分泌、延緩胃排空以及抑制食欲來降低血糖。它是一種人工合成的胰高血糖素樣肽-1受體(glucagon-like peptide-1 receptor，GLP-1R)激動(dòng)劑的類似物。研究已經(jīng)證明利拉魯肽對(duì)心肌梗死后以及糖尿病伴心房顫動(dòng)后的心肌具有保護(hù)作用，包括減少梗死面積、改善左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和抑制心室重塑[1-3]。此外，利拉魯肽在體外培養(yǎng)的鼠心肌細(xì)胞可增加cAMP同時(shí)減少細(xì)胞凋亡。因此，利拉魯肽不僅是一種有效的抗糖尿病藥物[4]，還可延緩病理性的心肌重構(gòu)。然而，利拉魯肽對(duì)急性心肌梗死(AMI)后心臟電活動(dòng)穩(wěn)定性的影響仍不清楚。

在我們前期實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)證實(shí)利拉魯肽可促進(jìn)AMI大鼠血管新生，并可減少膠原沉積，從而改善左室收縮功能，發(fā)揮心肌保護(hù)作用[5]。筆者通過制作AMI的大鼠模型，觀察Liraglutite對(duì)左室電活動(dòng)穩(wěn)定性及心肌重構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1材料

SPF級(jí)雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠，體重220～250 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將健康成年雄性大鼠24只隨機(jī)分為三組：正常對(duì)照組(NC組，n=8)、安慰劑組(PB組，n=8)、利拉魯肽組(LIR組，n=8)。NC組不做處理；PB組、LIR組分別給予腹腔皮下注射生理鹽水、利拉魯肽200 μg/(kg·d-1)，一天兩次，連續(xù)注射7天。

1.2AMI模型建立

三組大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉( 30 mg/kg)腹腔注射麻醉(戊巴比妥鈉購自上海西唐科技有限公司)。用剃毛器剃除小鼠胸部及腋下毛發(fā)(充分暴露手術(shù)區(qū))，用碘酒和75%乙醇手術(shù)區(qū)消毒。氣管插管，設(shè)置好呼吸機(jī)各參數(shù)(呼吸頻率設(shè)定為12次/分)，將氣管插管沿聲門插入氣管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)(TKR-200C)，觀察小鼠呼吸狀況，胸廓起伏與呼吸機(jī)頻率一致表示插管成功。連接心電監(jiān)護(hù)儀。建立上肢靜脈通道。進(jìn)行術(shù)中補(bǔ)液、給藥。在無菌條件下，經(jīng)胸骨正中開胸，剪開心包，充分暴露心臟。

外科開胸手術(shù)后，剪開心包，NC組只做觀察，PB組和LIR組通過結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支動(dòng)脈(LAD)制備AMI模型，大鼠采用右側(cè)臥位，充分暴露LAD及所在區(qū)域。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈：找到LAD走向或可能所在位置,利用縫線完全阻斷LAD血流。結(jié)扎后可見梗死區(qū)心外膜變?yōu)榘导t色或者蒼白、搏動(dòng)減弱，以心電圖相應(yīng)導(dǎo)聯(lián)ST段抬高作為AMI模型制備成功的標(biāo)志(圖1)。

圖1 急性ST抬高型心肌梗死心電監(jiān)護(hù)顯示

1.3心臟超聲測(cè)定

大鼠在戊巴比妥鈉麻醉狀態(tài)下，AMI建模后，縫合胸腔，行超聲心動(dòng)圖(飛利浦 IE33，12 MHz探頭)檢查，以胸骨旁短軸切面，測(cè)量左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)和LVEF。心肌收縮力參數(shù)根據(jù)同一水平短軸切面獲取，每個(gè)切面記錄兩個(gè)圖像，每個(gè)參數(shù)參量記錄連續(xù)3個(gè)心臟搏動(dòng)。

1.4電生理檢查

超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)束后，剪開縫合的胸腔，將起搏電極置于左室心尖部，以S1S2起搏刺激法測(cè)定左室有效不應(yīng)期(LVERP)，8個(gè)S1刺激(周長150 ms，脈寬2 ms)后，進(jìn)行額外S2刺激(從145 ms周長開始，以5 ms遞減，脈寬2 ms)。 LVERP定義為未能捕獲心室的最長S1S2間期。

實(shí)驗(yàn)最后所有存活的動(dòng)物以右室心尖部為起搏部位，采用S1S1程序刺激測(cè)定心室顫動(dòng)閾值(VFT)。刺激周長100 ms，脈寬5 ms，每次刺激持續(xù)10 s，間斷30 s進(jìn)行下一次刺激。刺激電壓從起搏閾值開始，每次以1 V遞增直至誘發(fā)心室顫動(dòng)。VFT定義為能誘發(fā)持續(xù)性室顫的最小刺激電壓。

1.5組織病理檢查

1.5.1標(biāo)本選取及處理 電生理檢查結(jié)束后，迅速在心臟梗死邊緣區(qū)取材，4°C生理鹽水反復(fù)沖洗殘余血液，濾紙吸干，除去右室、心房和大血管。在左室長軸中點(diǎn)處垂直于長軸將左室一分為二，心尖側(cè)的一半心肌組織經(jīng)4%甲醛溶液中固定24 h后，常規(guī)脫水、石蠟包埋，制備厚度5 μm的組織切片。蘇木精-伊紅染色(HE染色)光鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化；Masson染色觀察膠原沉積情況，判斷纖維化程度。

1.5.2HE染色 將制作好的組織切片經(jīng)過脫蠟、脫水處理后用蘇木精染液,伊紅染液進(jìn)行HE染色，取HE染色切片，在100倍視野下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。

1.5.3Masson染色 將制作好的組織切片經(jīng)過脫蠟、脫水處理后用Weigiet鐵蘇木素、麗春紅酸性品紅、磷鉬酸溶液1%冰醋酸進(jìn)行Masson膠原染色。膠原纖維染呈藍(lán)色，肌肉呈紅色，400 倍光鏡下在心肌梗死邊緣區(qū)隨機(jī)拍取5個(gè)視野。Image Pro Plus 6.0 軟件測(cè)定膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)，即 CVF=心肌膠原面積 / 所測(cè)同視野組織總面積×100%。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1三組心功能指標(biāo)的比較

與NC組相比，PB、LIR組的LVEDD 、LVESD均增加(P<0.05)，而LVEF均降低(P<0.05)；與PB組相比，LIR組的LVEDD 、LVESD有所減小(P<0.05)，LVEF增加(P<0.05)(表1)。

表1 三組超聲心動(dòng)圖參數(shù)

注：與NC組比較，*P<0.05；與PB組比較，#P<0.05

2.2三組電生理指標(biāo)的比較

與NC組相比，PB組的LVERP明顯縮短(P<0.01)，LIR組的LVERP縮短，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.08)；與PB組相比，LIR組的LVERP增加(P<0.01)。與NC組相比，PB、LIR組的VFT均明顯降低(P<0.01)；與PB組相比，LIR組的VFT有所升高(P<0.01)(表2)。

表2 三組電生理檢查參數(shù)

注：與NC組比較，*P<0.01；與PB組比較，#P<0.01

2.3三組心肌組織病理比較

2.3.1HE染色 NC組心肌排列規(guī)整，染色均勻；PB組染色深淺不均一，大量炎癥細(xì)胞浸潤，肌纖維交叉錯(cuò)構(gòu)，間隙增寬，部分肌溶灶; 與PB組相比，LIR著色深淺略不均勻，較少炎癥細(xì)胞浸潤，肌纖維排列尚規(guī)則，極少肌溶灶(圖2)。

2.3.2Masson染色 與NC組相比，PB左室CVF均明顯增加(29.77%±3.86% vs 43.75%±2.89%，P<0.05)，LIR組左室CVF有所增加(29.77%±3.86% vs 36.73%±3.59%，P<0.05)；然而與PB組相比，LIR組的左室CVF明顯減小(43.75%±2.89% vs 36.73%±3.59%，P<0.05)(圖2)。

圖2 三組大鼠的左室組織HE染色(×100)和 Masson染色(×400)

3 討論

Liraglutite可顯著改善心肌梗死后心臟結(jié)構(gòu)重塑，然而其對(duì)電重構(gòu)的影響尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，Liraglutite通過減少AMI后心臟梗死區(qū)域炎癥細(xì)胞浸潤及心肌纖維化,改善了AMI后的心臟舒縮功能、抑制心臟結(jié)構(gòu)重塑;通過延長AMI后LVERP，提高了心室電活動(dòng)的穩(wěn)定性，進(jìn)而改善了心臟的電重構(gòu)。

Liraglutite不僅是一種有效的抗糖尿病藥物，還可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中cAMP水平升高，進(jìn)而激活蛋白激酶A，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用[6-7]。同時(shí)促進(jìn)心肌葡萄糖能量代謝，降低心肌耗氧量，減少AMI時(shí)心肌細(xì)胞內(nèi)的乳酸堆積，抑制心肌細(xì)胞酸中毒，改善了梗死心肌周圍區(qū)域的炎癥反應(yīng)[4, 8]。AMI后梗死區(qū)及邊緣區(qū)的心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體缺氧性損傷，導(dǎo)致線粒體代謝速率下降，進(jìn)而增加內(nèi)源性活性氧，從而出現(xiàn)持續(xù)性損傷效應(yīng)，促進(jìn)了心肌纖維化，進(jìn)一步加重了心功能的損害。而Liraglutite可減少內(nèi)源性活性氧產(chǎn)生，并促進(jìn)心肌細(xì)胞中線粒體ATP的代謝，提高了線粒體代謝速率，減少乳酸脫氫酶，降低了心肌細(xì)胞的缺氧性損傷，減少了心肌纖維化，進(jìn)而減少了AMI心臟中的心肌梗死的面積，從而達(dá)到抑制心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)的作用[9-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在AMI后，Liraglutite可減少心臟梗死區(qū)域炎癥細(xì)胞浸潤，改善心肌纖維化,提高了AMI后的心臟舒縮功能，從而抑制心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)。

AMI后不僅可導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)，還會(huì)導(dǎo)致心臟電重構(gòu)，主要表現(xiàn)為瘢痕區(qū)形成，導(dǎo)致電傳播受阻，在心臟局部形成渦流、轉(zhuǎn)子等，出現(xiàn)波碎裂、電震蕩，降低了心臟電活動(dòng)的穩(wěn)定性，而這些因素已證實(shí)是導(dǎo)致惡性心律失常發(fā)生的主要因素[12]。一些研究發(fā)現(xiàn)，AMI后心臟的有效不應(yīng)期縮短，VFT下降，而且神經(jīng)纖維紊亂增生，這些因素促進(jìn)了心臟電活動(dòng)的不穩(wěn)定性的增加。進(jìn)而促進(jìn)了惡性心律失常的發(fā)生[13]。本研究結(jié)果表明，Liraglutite能夠延長AMI后LVERP，提高VFT，增加了左室電活動(dòng)穩(wěn)定性。然而Liraglutite對(duì)心臟神經(jīng)纖維的影響機(jī)制還需要進(jìn)一步闡明。