黃 芳，張 彪，李繡菊，付仕婭，周漢華*

(1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 銅仁 554300；2.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002)

傳統(tǒng)中藥金錢草是報春花科珍珠菜屬植物過路黃LysimachiachristinaeHance的干燥全草，具有利濕退黃、利尿通淋、解毒消腫的功效[1]。金錢草自入藥以來，以其利濕通淋、清熱解毒及顯著的利膽排石作用而聞名，是治療肝膽結(jié)石的著名中藥，其化學(xué)成分已有報道，主要為黃酮苷類和苷類等成分[2]，臨床上多用于治療黃疸、肝膽結(jié)石、泌尿系統(tǒng)結(jié)石、濕熱淋癥、毒蛇咬傷等病癥，是治療結(jié)石的臨床常用中藥之一[3]。金錢草具有很高的藥用價值，且分布較廣，具有資源豐富、價格低廉、安全性好等特點(diǎn)，有著巨大的開發(fā)利用價值和廣闊的應(yīng)用前景。

近幾年發(fā)現(xiàn)市售金錢草中常有其同屬易品混入或混用的情況[4-5]，本文采用高效液相色譜法，探索金錢草及其同屬易混品的化學(xué)綜合鑒別方法，旨在為金錢草的真?zhèn)舞b別、用藥安全及質(zhì)量控制提供科學(xué)參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀，安捷倫液相色譜系統(tǒng)化學(xué)工作站(美國安捷倫公司)；AG135型電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；水浴鍋(天津市太斯特儀器有限公司)；中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版、2004B版)。

1.2 試藥

1.2.1 試劑 甲醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純；天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純)；乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純)；甲酸(天津市巴斯夫化工有限公司，分析純)；實(shí)驗(yàn)用水為重蒸餾水。

1.2.2 樣品來源 所有實(shí)驗(yàn)材料均是野外采集，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院周漢華教授鑒定，憑證標(biāo)本存放于貴陽中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定教研室。樣品來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.1%甲酸水，梯度洗脫；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：275 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 樣品來源

2.2 供試品溶液的制備

取S4號藥材(貴州省湄潭縣)粉末約1 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，加入80%甲醇-0.7 mL鹽酸25 mL密塞，稱定重量，加熱回流提取60 min，用80%甲醇補(bǔ)足失重，過濾，收集續(xù)濾液，用0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過濾，取過濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 空白試驗(yàn) 為考察樣品溶液中提取溶劑、流動相的干擾，進(jìn)行空白試驗(yàn)。將80%甲醇用0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過濾，按“2.1.”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。由空白試驗(yàn)色譜圖可知，空白試驗(yàn)色譜圖的基線平穩(wěn)，表明提取溶劑及流動相對金錢草藥材的HPLC特征圖譜檢測無干擾。

2.3.2 完整性試驗(yàn) 取S4號藥材粉末，約1 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。為考察特征圖譜記錄的完整性，記錄185 min后，以甲醇：0.1%甲酸水溶液(100∶0)流動相比例繼續(xù)洗脫至200 min。結(jié)果為色譜圖中185 min后無色譜峰信息，表明采集185 min色譜圖即可基本記錄完整金錢草藥材的化學(xué)成分信息。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取S4號藥材粉末，約1 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，所得圖譜導(dǎo)入指紋圖譜軟件進(jìn)行分析，相似度計算結(jié)果均大于0.90，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取S4號藥材粉末6份，每份約1 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，所得圖譜導(dǎo)入指紋圖譜軟件進(jìn)行分析，相似度計算結(jié)果均大于0.90，表明本法測定的重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S4號藥材粉末，約1 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、3、6、12、24 h依法測定，所得圖譜導(dǎo)入指紋圖譜軟件進(jìn)行分析，相似度計算結(jié)果均大于0.90，表明供試品溶液測定在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.4 樣品測定

將10批金錢草藥材樣品粉末分別按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取供試品溶液各10 μL分別注入高效液相色譜儀中，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄185 min的色譜，即得。

2.5 特征圖譜的建立及共有峰的確定

根據(jù)10批不同產(chǎn)地的金錢草藥材供試品溶液的測定結(jié)果，HPLC色譜共分離出約60個峰。將10批不同產(chǎn)地金錢草藥材的HPLC圖譜導(dǎo)入指紋圖譜軟件進(jìn)行分析處理，根據(jù)其峰數(shù)、峰值(積分值)、峰位(相對保留時間)等相關(guān)參數(shù)進(jìn)行分析、比較，制定優(yōu)化的特征圖譜，金錢草藥材的特征圖譜中共有7個特征峰。圖中5號峰達(dá)到了基線分離，分離度好，峰面積較大，保留時間居中且相對保留時間比較穩(wěn)定，設(shè)定5號峰為參照峰(S)。10批不同產(chǎn)地金錢草藥材的共有模式以及對照特征圖譜R見圖1、圖2。

圖1 10批金錢草藥材供試品的特征圖譜共有模式(時間窗寬度為1.5中位數(shù)法)

圖2 金錢草藥材的對照特征圖譜R

2.6 共有特征峰相對保留時間和峰面積比值計算

以5號峰為參照峰(S)，分別計算金錢草藥材對照特征圖譜及10批金錢草藥材7個特征峰的相對保留時間及峰面積比值，結(jié)果為：10批金錢草藥材7個特征峰的相對保留時間的RSD為1.1%～5.6%，峰面積比值的RSD為3.1%～71.7%。

2.7 相似度評價計算結(jié)果

將10批金錢草藥材樣品的HPLC圖譜導(dǎo)入指紋圖譜軟件，相似度計算評價結(jié)果表明，各地金錢草藥材特征圖譜的相似度計算結(jié)果在0.603～1.00之間，說明各地金錢草之間既有較好的相關(guān)性，也存在一定區(qū)別，建立的金錢草藥材對照特征圖譜具有一定代表性。見圖1、圖2。

2.8 同屬易混偽品與金錢草的特征圖譜比較

取L1至L4號易混偽品按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取供試品溶液各10 μL分別注入高效液相色譜儀，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄185min內(nèi)的色譜，得到與金錢草特征圖譜相同測定條件下的易混偽品指紋圖譜，采用“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004B版)”軟件進(jìn)行分析，將4個偽品樣品指紋圖譜與對照特征圖譜一起導(dǎo)入軟件，以金錢草特征圖譜R為對照，進(jìn)行相似性分析及相似度計算，結(jié)果顯示，4個易混偽品指紋圖譜與金錢草特征圖譜主要區(qū)別在于整個圖譜的中間部分，即在保留時間為55～130min的色譜峰差異，相似度計算結(jié)果為0.001～0.008，均在0.1以下，說明4個易混偽品與正品金錢草的化學(xué)成分信息存在較大的差異，與金錢草特征圖譜比較可以有效區(qū)別正品和易混偽品。結(jié)果見圖3和表2。

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過指紋圖譜整體圖形、共有特征峰、相對保留時間、相似度等參數(shù)可對藥材進(jìn)行鑒定。10批不同來源的金錢草藥材指紋相似度在0.603～1.000之間，且各峰相對峰面積有一定的差異，說明藥材之間的內(nèi)在質(zhì)量是有差異的，提示藥材應(yīng)在定產(chǎn)地的前提下才能保證藥品內(nèi)在質(zhì)量的一致性。上述HPLC特征圖譜研究結(jié)果表明，正品金錢草與其同屬4個偽品的化學(xué)成分確實(shí)存在明顯的差異，但個別又有一定的相似性，說明本文所建立的金錢草藥材對照特征圖譜具有較強(qiáng)的專屬性，能有效鑒別金錢草與其同屬易混偽品。

圖3 金錢草特征圖譜與同屬4個偽品藥材指紋圖譜疊加圖(漂移時間 0.5)

表2 金錢草藥材特征圖譜與同屬4個偽品指紋圖譜 相似度比較結(jié)果

從10批不同來源的金錢草藥材指紋圖譜比較結(jié)果顯示，不同批次金錢草藥材質(zhì)量有較大差別，所以不僅需要對金錢草及其混淆品區(qū)分，還需對金錢草藥材進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，或制備金錢草的標(biāo)準(zhǔn)提取物，才可保證穩(wěn)定的臨床療效。本文采集的試驗(yàn)樣品的代表性還存在不足之處，如作為有效鑒別金錢草藥材的方法應(yīng)用，尚需收集全國不同產(chǎn)地的藥材樣品，通過大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證和統(tǒng)計分析，使之更能有效地反映金錢草藥材的內(nèi)在品質(zhì)，為藥材的質(zhì)量監(jiān)控提供有效信息。

金錢草混淆品繁多，本試驗(yàn)采用指紋圖譜對其同屬偽品進(jìn)行鑒別，用整體圖形的直觀形式及運(yùn)用中藥指紋圖譜形似度評價系統(tǒng)(2004A、2004B)分析對其進(jìn)行了鑒別。單以一個或幾個成分作為鑒別標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量控制方法已不能真正反映中藥材質(zhì)量，而利用指紋圖譜對藥材進(jìn)行綜合、宏觀的評價可獲得全面反映藥材特性的色譜分離圖，制定出系統(tǒng)性、特征性和穩(wěn)定性均較好的藥材指紋圖譜，為中藥材的質(zhì)量評價提供全面的分析方法。