都盼盼，白宗利，樂智勇,,*，董婧婧,，陳江鵬，許冬瑾

(1.康美藥業(yè)股份有限公司，廣東 普寧 5153001；2.康美(北京)藥物研究院有限公司，北京 102600；3.廣東康美藥物研究院有限公司，廣東 廣州 510000)

草果為姜科植物草果(Amomumtsao-koCrevost et Lemaire) 的干燥成熟果實(shí)，秋季果實(shí)成熟時(shí)采收，除去雜質(zhì)，曬干或低溫干燥。其味辛，性溫，歸脾、胃經(jīng)，具有燥濕溫中、截瘧除痰的功效，臨床用于寒濕內(nèi)阻、脘腹脹痛、痞滿嘔吐、瘧疾寒熱、瘟疫發(fā)熱的治療[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，草果具有抗氧化[2]、抗菌[3]、抗腫瘤[4]、調(diào)節(jié)胃腸功能[5]等藥理活性。草果是藥食兩用大宗藥材，作為辛香料的用量遠(yuǎn)大于藥用?！吨袊?guó)藥典》2015年版一部規(guī)定以揮發(fā)油總量作為評(píng)價(jià)草果品質(zhì)的重要指標(biāo)，《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[6]以揮發(fā)油總量、指紋圖譜及桉油精含量控制草果質(zhì)量。此外，有學(xué)者[7-10]對(duì)草果揮發(fā)油中的主要成分1,8-桉油素含量進(jìn)行了研究，建立氣相色譜法對(duì)草果所含單體成分進(jìn)行質(zhì)量控制。目前有關(guān)草果藥材商品規(guī)格等級(jí)劃分的研究少有文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)前藥材市場(chǎng)上草果按個(gè)子大小、梗的長(zhǎng)短劃分等級(jí)。以外觀性狀為指標(biāo)，缺乏對(duì)藥材內(nèi)在品質(zhì)的描述，現(xiàn)有等級(jí)劃分是否體現(xiàn)出草果藥材內(nèi)在質(zhì)量尚缺乏深入研究。本研究收集39批草果藥材，采用GC法測(cè)定草果中桉油精的含量，并通過揮發(fā)油、水分、總灰分、重金屬及有害元素的檢測(cè)，探討草果藥材商品規(guī)格與藥材質(zhì)量的相關(guān)性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

7890B型氣相色譜儀，配有7697A型氫火焰離子檢測(cè)器(Agilent)；ETHOS UP型消解儀(MILESTONE)；7900型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(Agilent)；XPE205型電子分析天平(METTLER TOLEDO)；TC-15型套式恒溫器(上海安亭科學(xué)儀器廠)；KQ-500DE型(昆山市超聲儀器有限公司)；揮發(fā)油提取器。

1.2 試劑

65%硝酸(分析純，K48901356713，默克股份兩合公司)；乙酸乙酯(分析純，20180310，北京化工廠)；正己烷(分析純，20180302，天津市福晨化學(xué)試劑有限公司)；鉛、鎘、汞、砷、銅混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(31-Oct-2018，Agilent)，鍺、銦、鉍內(nèi)標(biāo)溶液(23-169VYY2，Agilent)，金單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(17D2317，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心)；桉油精對(duì)照品(110788-201606，98.4%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)。

1.3 樣品收集與規(guī)格等級(jí)劃分

從草果云南、廣西主產(chǎn)區(qū)及藥材交易市場(chǎng)收集39批草果藥材。當(dāng)前藥材市場(chǎng)草果規(guī)格按個(gè)子大小、梗的長(zhǎng)短進(jìn)行劃分，因此，根據(jù)每100g所含草果個(gè)數(shù)進(jìn)行等級(jí)劃分。

參照《中藥材商品規(guī)格等級(jí)草果》[11]及市場(chǎng)交易規(guī)則，將草果藥材分為3個(gè)等級(jí)，每100 g 30粒以內(nèi)為一等，有14批，占35.9%；每100 g 40粒以內(nèi)為二等，有21批，占53.8%，每100 g 40粒以上為三等，有4批，占10.3%。樣品信息及等級(jí)劃分情況見表1。

表1 草果藥材樣品信息及等級(jí)劃分

2 方法與結(jié)果

2.1 水分

按照甲苯法(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0832第四法)測(cè)定，39批草果藥材的水分含量在6.6%～10.1%之間。

2.2 總灰分

按照總灰分測(cè)定法(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則2302)測(cè)定，39批草果藥材的總灰分含量在5.9%～9.9%之間，其中8批草果藥材總灰分含量不符合要求。

2.3 重金屬及有害元素

按照鉛、鎘、砷、汞、銅測(cè)定法(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則2321)電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定。39批草果藥材中，28批檢出鉛元素，檢出率為71.8%；12批檢出砷元素，檢出率為30.8%；38批檢出鎘元素，檢出率為97.4%；38批檢出銅元素，檢出率為97.4%；19批藥材檢出汞元素，檢出率為48.7%。參考《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的重金屬殘留限量：鉛含量不得超過5 mg/kg，鎘含量不得超過0.3 mg/kg，砷含量不得超過2 mg/kg；汞含量不得超過0.2 mg/kg；銅含量不得超過20 mg/kg。39批草果藥材的鉛、鎘、砷、汞、銅含量均符合規(guī)定。

2.4 揮發(fā)油

按照揮發(fā)油測(cè)定法(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則2204)測(cè)定，39批草果藥材揮發(fā)油含量在1.4%～2.0%之間。

2.5 桉油精含量

2.5.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 火焰離子檢測(cè)器；毛細(xì)管色譜柱(DB-17，柱長(zhǎng)30 m，內(nèi)徑25 mm，交聯(lián)50%二苯基甲基硅氧烷為固定相，涂膜厚度0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度250 ℃；檢測(cè)器溫度300 ℃；分流比5∶1。程序升溫步驟見表2。

表2 程序升溫步驟

2.5.2 供試品溶液制備 取本品粉末(過三號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，精密加入乙酸乙酯25 mL，稱定重量，超聲處理(功率600 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用乙酸乙酯補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.3 對(duì)照品溶液制備 取桉油精對(duì)照品適量，精密稱定，加乙酸乙酯制成每1 mL含0.1 mg桉油精的溶液，即得。

2.5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取桉油精對(duì)照品適量，加乙酸乙酯使溶解、稀釋，得一系列對(duì)照品溶液。精密吸取1 μL，注入氣相色譜儀按上述色譜條件測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)，以桉油精濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算得桉油精回歸方程為Y=3.3007X+18.145，線性范圍為16.4～826.4 mg/L，相關(guān)系數(shù)R2= 0.9999。

2.5.5 方法學(xué)驗(yàn)證 按照藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則9101)，對(duì)上述方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。精密度試驗(yàn)中，桉油精峰面積RSD<3%，說明儀器精密度良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。重復(fù)性試驗(yàn)中測(cè)得桉油精含量RSD<3.0%，說明該方法重復(fù)性良好。加樣回收率試驗(yàn)中，桉油精加樣回收率為90.3%～ 102.5%，平均回收率為94.2%，RSD<5%，表明該方法準(zhǔn)確度良好，符合要求。

2.5.6 含量測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各1 μL， 注入氣相色譜儀測(cè)定，結(jié)果見表3。39批樣品中有31批藥材合格，其中一等品13批，桉油精含量在0.21%～1.07%之間，均值為0.53%；二等品16批，桉油精含量在0.16%～0.91%之間，均值為0.48%，三等品2批，桉油精含量在0.29%～0.40%之間，均值為0.35%。

表3 草果藥材水分、總灰分、重金屬及有害元素、揮發(fā)油與桉油精測(cè)定結(jié)果 (n=2)

2.6 相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步探究草果藥材商品規(guī)格與檢測(cè)指標(biāo)之間的關(guān)系，采用 SPSS Statistics 25分析軟件分別對(duì)不同等級(jí)的39批草果藥材檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。由相關(guān)性分析可知，不同等級(jí)草果藥材與桉油精含量的相關(guān)系數(shù)為 0.159，說明草果藥材等級(jí)與桉油精含量呈弱相關(guān)。

3 討論

張?jiān)坪閇12]研究結(jié)果表明，草果的形態(tài)特征不僅關(guān)系到其產(chǎn)量的高低，還與其藥材品質(zhì)有一定聯(lián)系，可將草果的果實(shí)長(zhǎng)以及果實(shí)長(zhǎng)寬比作為草果品質(zhì)的直觀評(píng)價(jià)指標(biāo)。憑外觀觀察，一般以個(gè)大、飽滿、色紅棕、氣味濃的草果為佳，其種子揮發(fā)油、1,8-桉油精和反-2-癸烯醛含量較高。本研究結(jié)果表明，水分、總灰分、重金屬及有害元素、揮發(fā)油與桉油精含量等檢測(cè)指標(biāo)難以區(qū)分草果等級(jí)，不能反映草果藥材的內(nèi)在質(zhì)量?jī)?yōu)劣。

本研究對(duì)桉油精含量測(cè)定供試品溶液的提取方法、提取溶劑、溶劑用量進(jìn)行了考察，結(jié)果表明超聲提取法的桉油精提取率(0.30%)高于水蒸氣蒸餾法(0.12%)，乙酸乙酯的提取率(0.44%)高于正己烷(0.30%)，溶劑用量對(duì)桉油精提取率影響不大?；跒V過等操作的簡(jiǎn)便性考慮，提取溶劑用量最終確定為25 mL。

本研究結(jié)果顯示，收集到的39批草果藥材中均檢出重金屬及有害元素，建議增加此項(xiàng)目檢測(cè)，保證草果應(yīng)用的安全性。建議開展以內(nèi)在質(zhì)量和臨床療效為依據(jù)的草果藥材分級(jí)研究，將藥材外觀性狀、內(nèi)部化學(xué)組分和療效結(jié)合起來進(jìn)行量化研究，建立能有效服務(wù)市場(chǎng)、對(duì)臨床具有指導(dǎo)作用的草果藥材等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。