江 靜，楊 臣

(1.泰州市食品藥品檢驗所，江蘇 泰州 225300；2.福建省食品藥品質(zhì)量檢驗研究院，福建 福州 350001)

雷公藤系衛(wèi)矛科(Celastraceae)植物雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f.)的根，主要產(chǎn)于浙江、湖南、江西、安徽、廣東、福建、臺灣等地，具有抗炎、抗菌等多種生理活性，臨床上可用于治療類風濕性關節(jié)炎、慢性腎炎和紅斑狼瘡等自身免疫性疾病，療效顯著[1-3]。雷公藤的根、莖、葉均可藥用兼具有毒性，主要藥用部位為其根，三萜類成分雷公藤紅素來源于雷公藤根皮，是雷公藤類中藥的主要活性成分和毒性成分[4-5]，其生物效應具有劑量依賴性，微摩爾級濃度的雷公藤紅素可誘導細胞凋亡，對多種細胞呈現(xiàn)毒性作用，而納摩爾級濃度則對細胞無毒性[6-7]。

目前，雷公藤藥材中雷公藤紅素的HPLC含量測定方法文獻報道較少，國內(nèi)市場上的雷公藤類口服制劑，多為原藥材的乙醇粗提取物，其毒性成分雷公藤紅素的含量缺乏監(jiān)控標準，無法保證用藥安全。因此對原藥材中含量進行監(jiān)控，制定合理的質(zhì)量控制標準勢在必行[8]。本實驗以雷公藤紅素為評價指標，通過條件優(yōu)化建立藥材中其含量測定方法，為制定監(jiān)控標準提供參考；首次對包含全根在內(nèi)的不同部位、來源的雷公藤藥材中雷公藤紅素的含量進行比較，為充分利用和開發(fā)雷公藤藥材資源提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent-1200高效液相色譜儀，包括：真空脫氣機，四元梯度泵，自動進樣器，二極管陣列檢測器，Ver08.01-Chemstation色譜工作站(美國Agilent公司)。S150超聲波清洗器(德國Elma)，XS205電子分析天平(梅特勒-托利多)。

1.2 材料

乙腈(Fisher-A9984，HPLC)，Milli-Q超純水，磷酸(AR，滬試)，甲醇(AR，滬試)。雷公藤紅素對照品(批號：MUST-12021802，來源：上海雅吉生物科技有限公司，含量≥98%)。藥材分別采自三明泰寧、龍巖長汀和購自湖南A公司、湖北B公司，經(jīng)福建省食品藥品質(zhì)量檢驗研究院鑒定為衛(wèi)矛科植物雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f.)的根。見表1。

表1 雷公藤藥材信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈：0.1%磷酸(80∶20)；流速：1 mL·min-1；檢測波長：425 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取雷公藤紅素對照品18.94 mg，加甲醇于20 mL量瓶溶解，稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含0.947 mg的溶液，作為對照儲備液。精密吸取儲備液5.0 mL，置50 mL量瓶，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含0.0947 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

藥材過三號篩，取0.1 g，精密稱定，置于150 mL三角瓶中，加入甲醇20 mL，密塞，稱取重量，超聲處理(功率300 W，頻率50 Hz)30 min，冷卻，補足重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

圖1 雷公藤紅素對照品(A)、雷公藤藥材供試品(B)色譜

2.4 線性關系的考察

精密取雷公藤紅素對照品溶液(0.947 mg/mL)0.025 mL，0.1 mL，0.5 mL，1 mL，3 mL，5 mL，10 mL，分別置于50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，吸取10 μL進樣。以峰面積(Y)為縱坐標，對照品溶液質(zhì)量濃度(X)為橫坐標作圖，得雷公藤紅素的回歸方程為Y=20.593X-14.529，r=0.999 9。結果表明：雷公藤紅素在0.47～189.4 μg·mL-1之間呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

取0.0947 mg·mL-1雷公藤紅素對照品溶液，連續(xù)重復進樣6次，測得雷公藤紅素峰面積的RSD為0.05%。表明該儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取湖北B公司提供的雷公藤全根粉(批號：Z1105033)制備供試品溶液，室溫下放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、14 h、18 h、24 h后測得雷公藤紅素峰面積RSD為0.21%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性試驗

取湖北B公司提供的雷公藤全根粉(批號：Z1105033)制備供試品溶液，平行操作6份，測得雷公藤紅素的平均含量為3.32 mg·g-1，RSD為0.36%。表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取湖北B公司提供的雷公藤全根粉(批號：Z1105033，含雷公藤紅素約0.16 mg)0.05 g，平行6份，按相同質(zhì)量濃度加入0.947 mg·mL-1雷公藤紅素對照品170 μL，按“2.3”項下操作制備供試品溶液，進樣測定雷公藤紅素的峰面積，結果平均回收率為98.3%(n=6)，RSD為1.93%。

2.9 樣品含量測定

對分別來自三明泰寧GAP種植基地、龍巖長汀(野生)、湖南A公司和湖北B公司的共17批雷公藤藥材，分成根皮、根心、全根，按 “2.3”項下操作制成供試品溶液，按“2.1”項的色譜條件，記錄色譜(圖1)，以外標法進行測定。結果見表2。

表2 17批雷公藤藥材中雷公藤紅素的含量 (mg/g)

3 討論

檢測波長的選擇。雷公藤為三萜類化合物，其紫外吸收波長集中在長波長處，在200～800 nm處掃描，425 nm處有最大吸收，因此選定425 nm為測定波長。

流動相的選擇。考察了甲醇-1%乙酸水(87∶13)、乙腈-1%乙酸水(80∶20)、甲醇-0.1%磷酸水(87∶13)、乙腈-0.1%磷酸水(80∶20)作流動相，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸水(80∶20)對稱因子更好，柱效更高，因此選擇乙腈-0.1%磷酸水(80∶20)。

提取條件的選擇。前處理過程依次對是否過柱、提取方式、提取溶劑、提取體積、提取時間進行了考察，發(fā)現(xiàn)過柱有一定損失，超聲提取較回流提取充分，甲醇提取效率最高，提取體積20 mL最為合適，30 min即可提取完全。因此樣品用20 mL甲醇超聲提取30 min，操作簡便快速。

實驗結果表明，根皮中雷公藤紅素的含量高于全根，明顯高于根心，證實了雷公藤紅素主要來源于雷公藤根皮，提示選用帶根皮的藥材入藥時應慎重對待，三者均可考慮作為制備雷公藤紅素的原料。根心中雷公藤紅素含量可高達1.52 mg·g-1，內(nèi)部不同批次可相差7倍，表明應對根心中雷公藤紅素的含量進行監(jiān)控，優(yōu)選原藥材時建議消除批間差異。野生雷公藤各部位雷公藤紅素的含量在栽培含量范圍內(nèi)，表明雷公藤紅素含量高低與來自野生或栽培無必然聯(lián)系。同為根心部位的人工栽培雷公藤紅素含量差異達6倍，因此應規(guī)范雷公藤的人工栽培。來自不同企業(yè)的入藥部位雷公藤全根中雷公藤紅素的含量相差20倍，最高可達3.32 mg·g-1；同一企業(yè)不同編號可相差8倍；全根入藥時，應預先監(jiān)控不同來源雷公藤紅素的含量差異。

本實驗建立的方法簡便快速、重現(xiàn)性好、準確度高，可為制定雷公藤藥材中雷公藤紅素的質(zhì)量控制標準提供參考。通過不同部位、來源的雷公藤藥材中雷公藤紅素的含量比較，一方面為雷公藤藥材資源的優(yōu)選和開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持，另一方面有助于指導臨床安全用藥。