鄒蔓姝，韓遠(yuǎn)山，王宇紅

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；3.湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南 長沙 410208)

馬錢子是馬錢科植物馬錢(strychnosnux-vomicaL.)的干燥成熟種子，具有通絡(luò)止痛、散結(jié)消腫的功效[1]，主要有效成分為生物堿類成分[2]。士的寧和馬錢子堿為該藥的代表性成分，占總生物堿含量的80%。這兩種成分分子量小，脂溶性好，極易跨膜吸收產(chǎn)生療效或毒副作用，是有效成分又是毒性成分[3]，治療量與中毒量較接近，嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用。

超微粉碎技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種中藥粉碎新技術(shù)[4]，該技術(shù)將傳統(tǒng)中藥材粉碎至細(xì)胞破壁范圍，因其速度快、時間短并可低溫操作的特點，粉體的生物活性成分能最大限度地保留下來。藥材經(jīng)超微處理后，粉末粒徑細(xì)微均勻，比表面積增加，吸附性增強，有效成分釋放變快，藥物能較好地分散、溶解在胃液中，且與胃黏膜的接觸面積變大，極大地提高了生物利用度[5-6]。

為了使臨床更加安全、有效地使用馬錢子，筆者對馬錢子進行了超微粉體技術(shù)處理，以常規(guī)粉體為對照，以中毒閾劑量(LOAEL)、最大安全劑量(NOAEL)為指標(biāo)，考察馬錢子超微粉及其粗粉對血液學(xué)、血液生化學(xué)、主要臟器系數(shù)及其病理學(xué)切片的量效關(guān)系變化的影響，為其臨床安全應(yīng)用提供試驗數(shù)據(jù)。

1 儀器與動物

1.1 儀器與試劑

BFMT-6BI型貝利粉碎機(濟南倍力粉體技術(shù)有限公司)；Winner3001激光粒度分析儀(濟南微納儀器有限公司)；ZRS-8G智能溶出試驗儀(天津大學(xué)無線電廠)；SB2200超聲清洗器(SHANGHAI BRANSON)；T-214電子天平(北京賽多利斯)；Waters2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)；RT-1904C半自動生化分析儀(深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司)；C18Inertsil ODS-2色譜柱(島津-GL)；馬錢子藥材(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院)；士的寧(批號：110705-201307，中國食品藥品檢定研究院)；馬錢子堿(批號：110706-201306，中國食品藥品檢定研究院)。

1.2 動物

健康ICR小鼠，SPF級，20～22 g，150只，雌雄各半，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(動物許可證號 SCXK(湘)2013-0004)。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同粒徑粉體樣品制備

取制馬錢子約2 kg，40～50 ℃干燥，分為4份，1份用普通粉碎機粉碎成粗粉(全部能通過二號篩，混有能通過四號篩的不超過40%，為1號樣品)，另3份用貝利粉碎機粉碎，采用Winner3001激光粒度分析儀進行觀察，測定D90(當(dāng)累積體積分?jǐn)?shù)為90%時對應(yīng)的粉末粒徑)分別為58.15 μm、37.74 μm和14.58 μm的超微粉，并編號為2、3、4號樣品。

2.2 士的寧、馬錢子堿含量測定方法

2.2.1 對照品溶液制備 (1)士的寧對照品溶液：精密稱取士的寧對照品27.98 mg于50 mL量瓶中，加鹽酸-甲醇(1∶100)溶液溶解定容，濃度為0.559 6 mg/mL。

(2)馬錢子堿對照品溶液：精密稱定馬錢子堿對照品18.24 mg于50 mL容量瓶中，加鹽酸-甲醇(1∶100)溶液溶解定容，濃度為0.364 8 mg/mL。

(3)混合對照品溶液：分別吸取上述配制好的士的寧與馬錢子堿對照品溶液各5 mL于25 mL容量瓶中，加鹽酸-甲醇(1∶100)溶液至刻度。

2.2.2 色譜條件 C18Inertsil ODS-2色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：A=乙腈，B=0.2%甲酸，采用線性梯度洗脫：0～15 min，8%A；15～25 min，8%～10%A；25～40 min，10%～70%A；40～45 min，70%～95%A；45～55 min，95%A；55～60 min，95%～8%A；檢測波長：254 nm；流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，進樣量：10 μL，洗脫時間：60 min。理論塔板數(shù)均應(yīng)不低于5 000。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別精密吸取0.5596 mg/mL士的寧對照品、0.3648 mg/mL馬錢子堿對照品的溶液各0.5、1、2、3、4、5 mL，置于25、25、10、10、10、5 mL容量瓶中，用鹽酸-甲醇(1∶100)溶液稀釋至刻度，搖勻，即得各濃度的混合對照品溶液。分別吸取10 μL注入液相色譜儀中，測定其峰面積，以對照品濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算回歸方程。見表1。

表1 士的寧與馬錢子堿線性關(guān)系考察結(jié)果

2.2.4 精密度實驗 分別取0.3648 mg/mL馬錢子堿、0.559 6 mg/mL士的寧標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在同樣條件下，連續(xù)進樣6次進行測定，馬錢子堿峰面積RSD為0.36%，士的寧峰面積RSD為0.28%。表明該方法的精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性實驗 取馬錢子粉，加鹽酸-甲醇(1∶100)溶液50 mL溶解，分別于放置0、2、4、6、8、12、24 h后進樣進行測定，馬錢子堿、士的寧峰面積RSD分別為1.28%、2.36%。表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性很好。

2.2.6 加樣回收實驗 分別精密稱取馬錢子粉約0.1 g，共6份，置于50 mL量瓶中，加鹽酸-甲醇(1∶100)溶液30 mL，混勻，放置30 min后，精密加入混合對照品溶液1 mL，用鹽酸-甲醇(1∶100)溶液補足定容。在上述色譜條件下進行測定，實驗結(jié)果表明，6份樣品的馬錢子堿平均加樣回收率為99.82%，RSD為2.89%，士的寧平均加樣回收率為100.4%，RSD為2.7%。

4.1 課堂實錄 現(xiàn)以“外界因素對種子萌發(fā)的影響”實驗為例，主題為“設(shè)計實驗檢測影響種子萌發(fā)的因素”，是教材中第9章“植物學(xué)”第4節(jié)“植物繁殖”學(xué)生課后的個人探究活動。教師給學(xué)生提出實驗主題后，要求學(xué)生通過文獻閱讀提出探究問題、實驗設(shè)計方案、進行實驗、實驗數(shù)據(jù)采集與分析、得出實驗結(jié)論并進行評價和改進。經(jīng)過觀察，大多數(shù)學(xué)生選擇的自變量有“溫度”“培養(yǎng)液pH”“赤霉素”和“光照強度”等，將胚芽的長度作為因變量即實驗指標(biāo)。學(xué)生利用教師提供的黃豆、綠豆和紅豆等實驗材料，借助實驗儀器，在實驗室內(nèi)進行實驗，整個實驗持續(xù)數(shù)周。學(xué)生每天同一時間進行實驗觀察記錄、利用軟件進行數(shù)據(jù)采集和分析(可借用校內(nèi)時間)。

2.3 士的寧、馬錢子堿溶出度考察

2.3.1 供試品溶液制備 取不同粒徑的馬錢子超微粉適量，精密稱定，分別置于900 mL人工胃液中，(37±0.5)℃水浴，轉(zhuǎn)速為100 r/min，分別于1、3、5、10、20、40、60、240 min取樣2 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過，備用。

2.3.2 士的寧、馬錢子堿溶出度測定 取上述樣品溶液，同“2.2.3”項下操作，分別測定其峰面積，根據(jù)回歸方程求出士的寧、馬錢子堿含量，計算累積溶出百分率。結(jié)果見表2、表3及圖1、圖2。

時間(min)1號2號3號4號110.99±0.2330.47±0.1658.42±0.4354.49±0.46321.26±0.3045.42±0.5975.89±0.4574.77±0.79531.58±0.5550.49±0.1980.14±0.7981.15±0.591040.11±0.6155.46±0.8987.52±0.5986.64±0.942055.51±0.4765.11±0.4689.47±0.4690.12±0.164062.49±0.2273.33±0.1292.48±0.9993.00±0.496075.48±0.7385.52±0.3495.44±0.6496.12±0.6324087.42±0.4593.79±0.7999.12±0.8598.91±0.42

圖1 不同粒徑馬錢子粉中士的寧的累積 溶出率

時間(min)1號2號3號4號110.53±0.1535.31±0.5658.74±0.4957.99±0.42322.76±0.5244.61±0.6474.16±0.4673.02±0.61530.79±0.9954.31±0.4981.59±0.7580.47±0.451039.11±0.5659.31±0.5887.99±0.4588.42±0.452056.39±0.6465.42±0.7491.97±0.6591.22±0.264068.43±0.6272.12±0.4693.59±0.4193.00±0.566073.22±0.4383.24±0.7195.00±0.4995.22±0.1924087.17±0.5993.12±0.4999.17±0.7398.79±0.42

2.3.3 士的寧、馬錢子堿溶出度的數(shù)學(xué)模型擬合 根據(jù)Weibull分布擬合直線，提取溶出度參數(shù)T50(藥物溶出50%所需時間)、Td(藥物溶出63.2%所需時間)、m(溶出曲線斜率)，對T50、Td、m進行方差分析，用t檢驗進行多因素組間方差比較。馬錢子1號粉體樣品中士的寧、馬錢子堿的溶出度參數(shù)與2號、3號、4號粉體樣品比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；2號粉體樣品與3號、4號粉體樣品的溶出參數(shù)比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；3號粉體樣品與4號粉體樣品比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表4、表5。

圖2 不同粒度馬錢子粉中馬錢子堿的 累積溶出率

樣品號T50Tdm1號20.0699±0.030139.6365±0.02470.4115±0.02142號5.3849±0.034111.4232±0.02330.2784±0.03213號0.3070±0.01251.2286±0.01200.2231±0.02314號0.3779±0.01801.3253±0.01150.2346±0.0254

樣品號T50Tdm1號19.6406±0.043938.0819±0.03300.4168±0.03362號4.4099±0.032610.3062±0.04140.2473±0.03103號0.3004±0.01371.2121±0.01120.2249±0.01234號0.3057±0.02601.2354±0.03480.2214±0.0120

2.4 工藝參數(shù)的考察

根據(jù)前期研究資料，采用BFMT-6BI貝利粉碎機制備馬錢子超微粉體，固定條件為：棍狀介質(zhì)(Φ20 mm×174 mm)，振幅5.5 mm，粉碎溫度0～10 ℃。本試驗采用單因素試驗方法，對馬錢子超微粉碎的入磨物料水分、介質(zhì)填充率、投料量、粉碎時間等工藝參數(shù)進行了考察。

2.4.1 物料水分 稱取馬錢子粗粉300 g，共6份，干燥至水分約為3%、4%、5%、6%、7%、8%時，置于高頻振動磨中，分別粉碎20 min，粉碎溫度為0～10 ℃，振幅為5.5 mm，介質(zhì)填充率為60%。結(jié)果表明，入磨水分為3%～6%時，D50、D90變化曲線比較平緩，當(dāng)入磨水分達到7%以上時，D50、D90呈現(xiàn)急劇增長趨勢，水分含量越高，粉碎效果越差，故將水分含量控制在3%～6%為宜(見圖3)。

圖3 入磨水分對超微粉碎的影響

2.4.2 介質(zhì)填充率 稱取馬錢子粗粉300 g，共5份，干燥至水分含量為3%～5%，置于高頻振動磨中，振動20 min，粉碎溫度為0～10 ℃，振幅為5.5 mm，介質(zhì)填充率分別為50%、60%、70%、80%、90%。結(jié)果表明，當(dāng)介質(zhì)填充率在60%～70%范圍內(nèi)變化時，對超微粉粒徑無明顯影響，故介質(zhì)填充率以60%～70%為宜(見圖4)。

圖4 介質(zhì)填充率與馬錢子超微粉D90 的變化曲線

2.4.3 投料量 稱取馬錢子粗粉，干燥至水分約為4%時，分別取100、200、300、400、500、600 g，共6份，置于高頻振動磨中，分別振動20 min，粉碎溫度0～10 ℃，振幅為5.5 mm，介質(zhì)填充率為60%。結(jié)果表明，投料量為400 g以下時，D50、D90變化曲線比較平緩，當(dāng)投料量為500 g時，D50、D90呈現(xiàn)急劇增長趨勢，為提高粉碎效率，故選擇投料量為400 g，占振動磨筒的6.7%(見圖5)。

圖5 投料量對馬錢子超微粉D50 、D90 的影響

2.4.4 粉碎時間 稱取馬錢子粗粉適量，干燥至水分約4%，分為6份，每份400 g，置于高頻振動磨中，分別粉碎5、10、15、20、25、30 min，粉碎溫度為0～10 ℃，振幅為5.5 mm，介質(zhì)填充率為60%。結(jié)果表明，馬錢子粗粉粉碎時間為20 min時，即可達到超微粉粒徑要求，當(dāng)時間超過20 min后，粒徑變化不大。故將粉碎時間范圍定為20～25 min(見圖6)。

圖6 粉碎時間對馬錢子超微粉D50 、D90 的影響

2.4.5 規(guī)范化工藝確定 根據(jù)前述試驗結(jié)果，確定馬錢子超微粉體的規(guī)范化制備工藝為：選用貝利粉碎機粉碎，振幅為5.5 mm、粉碎溫度為0～10 ℃，入磨物料水分為3%～6%，入磨粒度為粗粉，介質(zhì)填充率為60%～70%，投料量為6.7%，振動時間為20～25 min。按規(guī)范化制備工藝制備馬錢子超微粉，并觀察其顯微特征，檢測粒徑，考察休止角等物理特性，結(jié)果見表6、圖7、圖8。

表6 馬錢子超微粉碎的工藝參數(shù)及物理特性

圖7 馬錢子超微粉顯微特征(×400)

圖8 馬錢子超微粉粒度分布

2.5 超微粉的安全性評價

將體重為20～22 g 的ICR小鼠130只隨機分為13組，每組10只動物，雌雄各半。分別為空白對照組、馬錢子粗粉6個劑量組(10.0、20.0、28.3、40.0、56.6、80 mg/kg組)、馬錢子超微粉6個劑量組(10.0、20.0、28.3、40.0、56.6、80 mg/kg組)。灌胃給藥，給藥劑量為20 mL/kg，空白對照組僅給予相同體積的蒸餾水，每天1次，連續(xù)給藥28天。

2.5.1 觀測指標(biāo) 第28天給藥后2 h斷頭取血，分離血清，測定8項生化指標(biāo)，包括總蛋白(TP)、葡萄糖(Glu)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、尿素(Urea)和肌酐(Cre)；解剖留取心、肝、脾、肺、腎、腦進行病理學(xué)檢查，計算臟器指數(shù)=臟器(mg)/體質(zhì)(g)，并對病變程度評分。

2.5.2 馬錢子超微粉與粗粉對小鼠生化指標(biāo)的影響 采用SPSS19.0對結(jié)果進行分析，與空白組比較，56.6 mg/kg超微粉劑量組小鼠血清CK水平明顯升高(P<0.05)；雄性小鼠80.0 mg/kg劑量組血清AST水平明顯升高(P<0.05)，雌性小鼠40.0 mg/kg劑量組血清TP濃度明顯升高(P<0.05)，但仍在正常值范圍內(nèi)。馬錢子超微粉使小鼠血清生化指標(biāo)含量明顯升高的最小劑量為56.6 mg/kg，未觀察到其明顯影響的最大劑量為40.0 mg/kg。

與空白組比較，80.0 mg/kg粗粉劑量組小鼠血清CK水平明顯升高(P<0.05)；雄性小鼠56.6、80.0 mg/kg劑量組血清尿素濃度明顯升高(P<0.05)；雌性小鼠 80.0 mg/kg劑量組血清肌酐濃度明顯升高(P<0.05)，但在正常值范圍內(nèi)。馬錢子粗粉使得血清生化指標(biāo)含量明顯升高的最小劑量分別為雄性小鼠56.6 mg/kg，雌性小鼠80.0 mg/kg。未觀察到其明顯影響的最大劑量分別為雄性小鼠40.0 mg/kg，雌性小鼠56.6 mg/kg。

2.5.3 馬錢子超微粉與粗粉對小鼠臟器指數(shù)的影響 采用SPSS19.0對結(jié)果進行分析，與空白組比較，馬錢子超微粉各組小鼠臟器指數(shù)無顯著差異(P>0.05)。但馬錢子粗粉56.6、80.0 mg/kg劑量組雄性小鼠臟器指數(shù)明顯減小(P<0.05)；56.6 mg/kg劑量組雌性小鼠臟器指數(shù)明顯增大(P<0.05)。

2.5.4 馬錢子超微粉與粗粉對小鼠臟器病理的影響 從病理切片結(jié)果(見圖9)可以看出，不論超微粉和粗粉的給藥劑量大小，脾和腦組織的標(biāo)本均未見明顯病理學(xué)改變，僅有少量炎性細(xì)胞。40.0 mg/kg及其以下劑量組小鼠心、肝、肺、腎皆無明顯病理學(xué)改變。56.6 mg/kg及其以上劑量組小鼠，無論超微粉或粗粉，心臟標(biāo)本中均有少量炎細(xì)胞灶，伴瘀血，個別標(biāo)本有心肌纖維濁腫或心肌細(xì)胞水腫；肝標(biāo)本中存在少量炎細(xì)胞灶，細(xì)胞濁腫；肺標(biāo)本中均有少量炎細(xì)胞灶，伴肺泡壁淤血，淤血情況估計與斷頭取血方式有關(guān)，未見其他病變；腎標(biāo)本中同樣有少量炎細(xì)胞灶，腎小管上皮細(xì)胞濁腫。

圖9 各給藥組臟器病理切片

3 討論

與粗粉相比，超微粉碎的藥材主要有效成分含量變化不大，能維持藥材原有的藥效。細(xì)胞壁在粉碎過程中被破壞，有效成分無需穿透細(xì)胞壁即可釋放，釋放速度和釋放量得到大大提高。超微粉碎是在封閉系統(tǒng)中進行的，可減少某些藥材揮發(fā)性成分的損失，也避免了對環(huán)境的污染。

本試驗以士的寧、馬錢子堿溶出量為考察指標(biāo)，采用T檢驗進行統(tǒng)計分析，并對超微粉的規(guī)范化工藝參數(shù)進行優(yōu)選。結(jié)果表明，粉體粒徑以D9035～45 μm為宜。不同粒徑馬錢子粉中士的寧、馬錢子堿的溶出度參數(shù)T50之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，以3、4號粉體樣品的溶出速率最快，累積溶出量最高。但兩者溶出度參數(shù)T50比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，可能是粉末達到一定細(xì)度，擴散速度趨于穩(wěn)定，表面吸附也將增加，導(dǎo)致最終溶出度無明顯差異。

關(guān)于有害作用的最小劑量(LOAEL)，即中毒閾劑量，馬錢子超微粉為40.0 mg/kg，馬錢子粗粉為56.6 mg/kg。未觀察到有害作用的最大劑量(NOAEL)，即最大安全劑量，馬錢子超微粉為40.0 mg/kg，馬錢子粗粉為56.6 mg/kg。由此可知，超微粉對馬錢子毒性閾劑量與安全閾劑量無明顯影響。馬錢子超微粉與其粗粉對ICR小鼠的腎臟、心臟及肝臟毒性作用較大，應(yīng)引起臨床應(yīng)用的重視。

全粉入藥的中藥材是否采用超微粉碎方法應(yīng)綜合考察化學(xué)指標(biāo)和藥效指標(biāo)。中藥材經(jīng)超微粉碎后，吸濕性增強，易發(fā)生團聚，該現(xiàn)象會導(dǎo)致溶出速率減慢和溶出量下降，因此儲存過程中應(yīng)注意防潮。量反應(yīng)試驗結(jié)果表明，小劑量多次給藥的中毒閾劑量與安全閾劑量無明顯差異。為確保臨床安全用藥，應(yīng)重視馬錢子超微粉的給藥方式。