翟孟婷,王宗義,鄭 宇,候彤瑤,黃漫青

(1.北京農學院,食品科學與工程學院,食品質量安全北京實驗室,農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室,北京 102206;2.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司,營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室,老年營養(yǎng)食品研究北京市工程實驗室,北京 102209)

N-亞硝胺是一類在食品加工和貯藏過程中由亞硝酸鹽和胺類物質作用形成的一類重要致癌性食品污染物[1-2]。目前,我國僅對N-亞硝基二甲胺(NDMA)在肉制品和水產動物性制品中的限量做出規(guī)定,分別為3和4 μg/kg[3],其他N-亞硝胺尚未限定。

食品中N-亞硝胺主要依賴色譜結合特異性高靈敏檢測器或質譜進行檢測,常見的檢測方有氣相色譜-熱能分析儀法(GC-TEA)[4-5]、氣相色譜-氮磷檢測器法(GC-NPD)[6]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[7-8]、氣相色譜-串聯(lián)質譜法(GC-MS/MS)[9-10]和液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)[11-12]。其中,GC-MS/MS和LC-MS/MS由于具有優(yōu)異的選擇性和靈敏度,近年來應用報道較多,成為N-亞硝胺檢測的主要方法。但由于食品基質復雜,目標物含量低,改進樣品前處理仍然是N-亞硝胺檢測方法研究的關鍵。檢測亞硝胺經典樣品處理方法是水蒸氣蒸餾-液液萃取,也是現(xiàn)行國標法[5]采用的方法,具有基質效應小、富集倍數(shù)大的特點,但過程較長且有毒試劑用量大。改進的方法主要有水蒸氣蒸餾-固相萃取[13]、分散液液微萃取[14-15]、分散固相萃取[16]和QuEChERS[9-10]等,或更為環(huán)境人員友好,或提高了檢測效率。本文以穩(wěn)定同位素標記N-亞硝胺為內標,通過氫氧化鋇皂化處理結合二氯甲烷單次萃取,以及適當?shù)臉右簼饪s方法,建立一種簡便易行、相對成本較低的樣品處理方法,再結合GC-MS/MS的高靈敏、高選擇性,實現(xiàn)對幾種加工肉制品和水產品中7種N-亞硝胺的有效檢測,并進行實際應用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚干(馬口魚、鲅魚、銀針魚、黃花魚、鳳尾魚、海燕魚)、蝦仁(金鉤、海米和紅蝦)和加工肉制品(午餐肉、廣味腸、臘肉、醬豬蹄、魚肉腸、培根、烤肉和熏腸) 北京回龍觀地區(qū)超市;氫氧化鋇(八水)、硫酸鈉 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;二氯甲烷 色譜純,美國J.T.Baker公司;N-亞硝基二甲胺(NDMA)、N-亞硝基二正丙胺(NDPA)、N-亞硝基二乙胺(NDEA)、N-亞硝基哌啶(NPIP)、N-亞硝基吡咯烷(NPYR)、N-亞硝基嗎啉(NMOR)、N-亞硝基甲乙胺(NMEA)混合標準溶液(2000 mg/L,1 mL) 美國o2si公司;NDMA-d6甲醇溶液(1000 μg/mL,1 mL)、NDPA-d14 甲醇溶液(1000 mg/L,1 mL)、NPYR-d8甲醇溶液(1000 μg/mL,1 mL) 美國Accustandard Inc公司。

Agilent 7890B-7000C氣相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用儀 美國Agilent Technologies公司;Centrifuge 5810R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;RE-2000B旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;IKA MS 3 basic渦旋混勻器 德國IKA公司;BF-2000氮氣吹干儀 北京八方科技世紀有限公司;MJ-WBL2501B攪拌機 廣東美的生活電器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制 將N-亞硝胺混合標準溶液、3種定值穩(wěn)定同位素標記內標溶液,分別用二氯甲烷轉移至10 mL容量瓶中,得各N-亞硝胺濃度均為200 μg/mL的混合標準儲備液和NDMA-d6、NDPA-d14和NPYR-d8濃度均為100 μg/mL的混合內標儲備液,于棕色貯液瓶中-18 ℃儲存。用甲醇稀釋混合標準儲備液,得濃度分別為1、0.1 μg/mL的混合標準中間工作液;用甲醇稀釋混合內標儲備液,得濃度1 μg/mL的混合內標溶液。用二氯甲烷稀釋混合標準中間工作液和內標溶液,得內標濃度為50 ng/mL,N-亞硝胺濃度分別為1、5、10、25、50和100 ng/mL系列混合工作液。

1.2.2 樣品前處理

1.2.2.1 皂化與萃取 取適量樣品,預切成約1 cm3的小塊,于樣品粉碎機中絞碎至粉或糜狀,稱取絞碎混勻樣品10 g于50 mL離心管中,加入50 μL混合內標溶液,靜置5 min,加入3 g氫氧化鋇(八水),去離子水30 mL,渦旋1 min,擰緊蓋子于90 ℃烘箱處理2 h,取出10000 r/min離心10 min。將上清液傾入另一50 mL離心管,加入25 mL二氯甲烷,渦旋1 min后離心。棄去上層水溶液,下層二氯甲烷提取液通過盛有5 g無水硫酸鈉玻璃漏斗(底部放少量玻璃棉),收集于100 mL雞心瓶中,用5 mL二氯甲烷清洗離心管和無水硫酸鈉,合并二氯甲烷提取液于雞心瓶中。

1.2.2.2 濃縮方式的比較 采用旋蒸結合氮吹的方式進行,對如下三種方式進行比較:(a)將25 mL提取液在35 ℃旋蒸至5 mL,室溫氮吹至1 mL,待測;(b)將25 mL提取液在35 ℃旋蒸至干,用1 mL甲醇復溶,待測。(c)將25 mL提取液在35 ℃旋蒸至1 mL,室溫氮吹至近干,用1 mL甲醇復溶,待測。

1.2.3 色譜質譜檢測

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱:DB-WAXUI(30 m×250 μm×0. 25 μm);進口樣溫度190 ℃,不分流進樣,進樣量1 μL;載氣為氦氣,恒流模式,流量0.9 mL/min;程序升溫條件:35 ℃保持1 min,10 ℃/min升至90 ℃,30 ℃/min升至240 ℃保持6 min;傳輸線溫度:250 ℃。

1.2.3.2 質譜條件 電子轟擊電離源(EI);電離能量:70 eV;離子源溫度:230 ℃;四級桿溫度:150 ℃;采集模式:多重反應監(jiān)測模式(MRM),見表1;溶劑延遲:5 min。

表1 N-亞硝胺的MRM參數(shù)Table 1 MRM parameters of N-nitrosamines

1.2.3.3 定性、定量分析 通過對目標物保留時間、母離子及兩個二級離子響應比值與標樣相應參數(shù)進行對照進行定量;以目標物相應穩(wěn)定同位素標記內標物的濃度比(橫標)與相應的響應比為(縱標)進行回歸,制作校正曲線,內標法進行定量。NDMA、NMEA和NDEA以NDMA-d6為內標,NDPA、NPIP以NDPA-d14為內標,NPYR和NMOR以NPYR-d8為內標。

1.2.4 方法學考察

1.2.4.1 線性關系、檢出限和定量限 對濃度范圍為1～100 ng/mL的系列標準溶液進樣分析,繪制校正曲線和計算R2值,評價線性關系;對實際樣品和加標樣品的實際檢測,以各分析物的定量離子對信噪比(Peak to Peak)分別為3和10,且定性離子對色譜峰能夠被有效識別,評估檢出限和定量限。

1.2.4.2 準確性與精密度 選取黃花魚干、金鉤蝦仁和午餐肉三個代表性樣品進行三水平、六重復添加回收實驗,計算加標回收率和相對標準偏差。

1.2.5 樣品測定 應用本方法檢測市售17種樣品,其中包括魚干6種、蝦仁3種和加工肉制品8種,每個樣品重復測定兩次。

1.3 數(shù)據處理

使用MassHunter workstation Acquisition/Qualitative/Quantitative Analysis Software Version B.07.04和Excel 2007進行相關數(shù)據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 色譜分離與質譜檢測

中等極性和強極性毛細管柱均適用于N-亞硝胺的是分離[10,13],但就食品基質而言,強極性柱優(yōu)勢較為明顯,NDMA不易受共流出物的干擾。本實驗使用DB-WAXUI 柱,典型分離色譜圖如圖1所示,7種N-亞硝胺分離良好,NDMA與基質中干擾物有效分離。質譜MRM參數(shù),在參照樣品基質干擾的情況下,對目標物的前級離子、碎片離子進行了選擇,對碰撞能進行了優(yōu)化,結果亦列于表1。

圖1 標樣及樣品的MRM色譜圖

2.2 樣品前處理

2.2.1 皂化與萃取 研究表明,動物性食品中的脂肪可通過氫氧化鈉溶液皂化處理,使N-亞硝胺轉移至水溶液中[14-15,17],而氫氧化鋇溶解度小,降溫后迅速從溶液中析出,利于促進離心分離,且分離液清澈、粘度低,更有利于后續(xù)進一步活性炭固相萃取凈化[18-19],但氫氧化鋇用量超過1 g時容易析出堵塞小柱。本實驗在文獻[18]和[19]的基礎上,增加氫氧化鋇的用量至3 g,此時樣品溶液達到飽和非常有利于二氯甲烷的萃取;又由于動物性食品脂肪含量較高,適當提高溫度和處理時間有利于加速脂肪的皂化,當溫度為90 ℃,處理時間為2 h時,樣液中的脂肪層消失,皂化完全。由于實際定量分析應用的是目標物與穩(wěn)定同位素標記內標物的濃度比,絕對提取量不影響定量結果,故離心后,上清液轉至另一離心管中,經二氯甲烷一次萃取,即可滿足檢測的需要,二氯甲烷用量減至經典法的十分之一。又由于整個處理在50 mL離心管中進行,僅需兩次離心、一次樣液轉移,即可完成皂化與萃取,使得方法較為簡單,有利于多個樣品的批量處理。

2.2.2 濃縮方式的比較 文獻報道[20]和本實驗研究均發(fā)現(xiàn)N-亞硝胺在減壓濃縮和氮吹過程中容易發(fā)生損失,為優(yōu)化濃縮方法,本實驗對濃縮方式進行了考察,設計的3種濃縮方式的比較結果見圖2。方式(a)的各目標物峰面積與參照標樣對應峰面積的比值均高于其他兩種方法,效果最佳。方式(b),即旋蒸至盡干,方式(c),即氮吹至盡干,都會使NDMA、NMEA等相對分子質量較小的目標物損失嚴重;而方式(b)和(c)的對比結果表明樣品基質存在下,各目標物氮吹至盡干均較旋蒸至盡干目標物損失少,且相對分子質量越小損失越大。使用甲醇復溶樣品,樣液清亮,可進一步去除脂溶性物質,減小基質效應,但需要對二氯甲烷進行蒸干,造成目標物過度損失。綜合上述,本實驗選擇方式(a)進行濃縮,即旋蒸至5 mL,氮吹至1 mL。

圖2 濃縮過程對7種N-亞硝胺含量的影響

2.3 線性關系、檢出限、定量限

根據實際樣品的含量,對濃度范圍為1～100 ng/mL標準溶液進行考察,繪制標準曲線,R2均大于0.999。檢出限和定量限則根據實際樣品和加標樣品各分析物的定量離子對信噪比(Peak to Peak)分別為3和10且定性離子對色譜峰能夠被有效識別、評估而得,分別為0.08～0.23、0.25～0.76 μg/kg。線性方程、檢出限和定量限詳見表2,參照肉制品和水產制品中NDMA的限量規(guī)定為3和4 μg/kg,該方法的檢出限、定量限能夠滿足動物性食品中N-亞硝胺檢測的需要。

表2 各化合物的線性方程、檢出限和定量限Table 2 Regression equations,limits of detection and limits of quantification for the compounds

2.4 準確度和精密度

選取黃花魚、金鉤蝦仁和午餐肉三個代表性樣品進行三水平(n=6)添加回收實驗,根據樣品中N-亞硝胺的含量情況,設置兩組添加水平(見表3),7種N-亞硝胺的回收率和相對標準偏差分別為71.6%～133.8%和2.04%～17.1%(亦見表3)。

表3 樣品中7種揮發(fā)性N-亞硝胺的回收率及精密度(n=6)Table 3 The recoveries and precision of seven volatile N-nitrosamines(n=6)

2.5 實際樣品的測定

應用本方法檢測市場上6種魚干,3種干制蝦仁和8種加工肉制品,每個樣品重復測定兩次,結果列于表4。魚蝦樣品中NDPA的檢出率為100%,NDMA的檢出率為88.9%，檢出最高值為2.59 μg/kg;加工肉制品中NPYR和NDMA檢出率為100%,NDMA含量范圍在

表4 實際樣品中7種N-亞硝胺含量Table 4 Contents of seven N-nitrosamines in actual samples

3 結論

本文建立了以穩(wěn)定同位素為內標,氫氧化鋇處理結合二氯甲烷萃取,GC-MS/MS檢測幾種水產品和加工肉制品中7種N-亞硝胺的新方法。氫氧化鋇加熱處理能有效去除樣品中的脂肪,結合二氯甲烷單次離心管中萃取,有效簡化了樣品處理方法。方法在考察的濃度范圍內(1～100 ng/mL)表現(xiàn)良好線性,R2均大于0.999,回收率為71.6%～133.8%,RSD為2.04%～17.1%。該方法簡便易行、相對成本低,有毒試劑用量小,選擇性好,有足夠的檢出限,能夠滿足魚干、蝦仁等水產品和午餐肉、香腸等加工肉制品中7種N-亞硝胺檢測的需要。