施振華,曾茂茂,何志勇,秦 昉,鄒忠愛(ài),張志剛,陳 潔,*

(1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122;2.江南大學(xué)食品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122;3.廈門華夏學(xué)院環(huán)境與公共健康學(xué)院,福建廈門 361024;4.肉食品安全生產(chǎn)技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門 361100)

晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation endproducts,AGEs)是一類對(duì)人體健康不利的有害物,普遍存在于肉制品、烘焙類等熱加工食品中[1-2]。近年來(lái)引起了學(xué)術(shù)界以及工業(yè)界的重視。AGEs是食品或生物體系中蛋白質(zhì)或游離氨基酸和核酸、脂肪、還原糖等物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的一系列終產(chǎn)物的總稱,如羧甲基賴氨酸(CML)、羧乙基賴氨酸(CEL)、吡咯素(Pyr)等[3]。研究表明,AGEs在體內(nèi)的積累能夠引起糖尿病、阿爾茲海默癥、心血管疾病等慢性疾病[4]。

AGEs的生成途徑很多,影響因素復(fù)雜。未加工的動(dòng)物源性食品中也含有AGEs,熱加工或者長(zhǎng)期存放食品能促進(jìn)新AGE的生成。對(duì)于熱加工食品,食品基質(zhì)中的組成、各類可反應(yīng)底物的含量、pH、加工方式以及是否存在具有抑制反應(yīng)的抗氧化劑等都會(huì)影響AGEs生成[5]。由于真實(shí)食品體系過(guò)于復(fù)雜,而AGEs的種類太多,因此目前關(guān)于AGEs的研究大多通過(guò)建立模擬體系,以可被質(zhì)譜定量檢測(cè)的CML、CEL等作為標(biāo)志物,討論AGEs的形成途徑、動(dòng)力學(xué)特征以及反應(yīng)影響因素[1,6]。

迄今為止,關(guān)于各種反應(yīng)條件對(duì)AGEs生成影響的研究比較充分,如pH、溫度、時(shí)間等[5]。單糖是食品加工過(guò)程中常見(jiàn)的配料,也是二糖或者低聚糖結(jié)構(gòu)的組成單元。在美拉德反應(yīng)過(guò)程中,單糖的類型對(duì)反應(yīng)途徑和反應(yīng)產(chǎn)物有明顯的影響。一般而言,醛糖的美拉德反應(yīng)速度要高于酮糖。然而單糖作為反應(yīng)底物之一,其對(duì)AGEs和它中間體生成的影響幾乎沒(méi)有報(bào)道。因此,為了比較不同類型的單糖對(duì)AGEs生成的影響,本實(shí)驗(yàn)建立了4種單糖-賴氨酸的美拉德反應(yīng)模擬體系,研究了單糖的類型(葡萄糖、半乳糖、果糖、山梨糖)和熱加工時(shí)間對(duì)CML、CEL和Pyr三種AGEs生成的影響。通過(guò)比較反應(yīng)體系中乙二醛(GO)、丙酮醛(MGO)和3-脫氧葡萄糖醛酮(3-DG)三種二羰基化合物以及果糖基賴氨酸(FL)的含量來(lái)探討AGEs可能的形成途徑,以期通過(guò)優(yōu)化加工條件以及配方水平來(lái)降低AGEs的含量,為未來(lái)熱加工食品提高安全和健康水平提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄糖、半乳糖、果糖、山梨糖、賴氨酸、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉 均為分析純,購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;CML標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%)、CEL標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%)、d4-CML同位素內(nèi)標(biāo)(純度>98%)、d4-CEL同位素(純度>98%) 美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司;色譜級(jí)甲醇、乙腈、甲酸、Pyr(純度>98%)和九氟戊酸(純度>98%) 上海百靈威試劑公司;GO(40%水溶液)、MGO(40%水溶液)、3-DG、FL、2,3-己二酮(INS)和鄰苯二胺(OPD)、d4-賴氨酸同位素內(nèi)標(biāo)(純度>98%) 美國(guó)Sigma-Aldrich公司;超純水 通過(guò)Millipore Milli-Q purification system制備。

Micromass Quattro MicroTM API高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀、ACQUITY UPLC TQD超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀、Alliance 2695高效液相色譜儀、RI-2414示差折光檢測(cè)器 美國(guó)Waters公司;pH計(jì) 上海Mettler Toledo公司;UV-2800H型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) UNICO上海儀器有限公司;DF-2型攪拌油浴鍋 金壇市水北科普實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模擬體系的制備 葡萄糖-賴氨酸(Glu-Lys)模擬體系:準(zhǔn)確稱取1.80 g的葡萄糖(100 mmol/L)和1.46 g的賴氨酸(100 mmol/L)定容于100 mL的磷酸鹽緩沖溶液(100 mmol/L,pH=7.0)中,充分混勻溶解后得Glu-Lys溶液。分別取5 mL溶液于120 ℃的油浴中加熱20、40、60、80、100、120 min。隨后立即置于冰水浴中冷卻,并將反應(yīng)液放于-20 ℃保存。半乳糖-賴氨酸(Gla-Lys)、果糖-賴氨酸(Fru-Lys)、山梨糖-賴氨酸(Sor-Lys)的模擬體系分別按照上述方法制備,其用量和濃度與Glu-Lys體系一致。

1.2.2 反應(yīng)體系pH及顏色變化的測(cè)定 參照李菁等[7]的方法,通過(guò)pH和吸光度的變化評(píng)價(jià)模擬體系中美拉德反應(yīng)的程度。在-20 ℃保存之前,取不同反應(yīng)時(shí)間的溶液,用pH計(jì)測(cè)定溶液pH。超純水將反應(yīng)液稀釋一定倍數(shù)后,用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其在294 nm波長(zhǎng)處和420 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.2.3 葡萄糖、半乳糖、果糖和山梨糖四種單糖的測(cè)定 參照高娃等[8]的方法,取不同反應(yīng)時(shí)間的溶液稀釋10倍,過(guò)0.22 μm濾膜。HPLC條件:色譜柱為Waters公司的Sugar-PAK I分析柱(300 mm×6.5 mm,10 μm),柱溫為60 ℃。流動(dòng)相為超純水,流速為0.4 mL/min,檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器。葡萄糖、半乳糖、果糖和山梨糖四種單糖的測(cè)定采用外標(biāo)法進(jìn)行定量,以不同單糖標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo),以不同單糖標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 賴氨酸和果糖基賴氨酸(FL)的測(cè)定 參照Nguyen等[6]的方法,取不同反應(yīng)時(shí)間的溶液稀釋至合適倍數(shù),取稀釋后的溶液200 μL,加入200 ng/mL的d4-Lysine溶液作為內(nèi)標(biāo),混合液過(guò)0.22 μm濾膜。UPLC條件:色譜柱為XSelectTMHSS T3(150 mm×4.6 mm,5 μm),柱溫為35 ℃。流動(dòng)相A相為甲醇,B相為0.1%的甲酸水溶液,流速為0.2 mL/min,梯度洗脫條件:0 min,1% A;5 min,8% A;5.5 min,100% A;6.5 min,100% A;7 min,1% A;運(yùn)行時(shí)間:10 min。MS/MS條件:采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)下的電噴霧正離子模式(ESI+),離子源溫度為110 ℃,脫溶劑溫度為400 ℃。其中MRM模式設(shè)置為L(zhǎng)ysine:m/z 147→m/z 88;d4-LysineL:m/z 151→m/z 88;FL:m/z 309→m/z 225。其中,賴氨酸的測(cè)定采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量,以賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo),以賴氨酸峰面積與其同位素內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;FL測(cè)定采用外標(biāo)法進(jìn)行定量,以FL標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo),以FL標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5α-二羰基化合物的測(cè)定 參照Z(yǔ)hang等[9]的方法,取10倍稀釋后的反應(yīng)液200 μL,加入100 μL的INS溶液作為內(nèi)標(biāo),再加入100 μL的OPD溶液作為衍生試劑。充分混合后置于4 ℃冰箱避光衍生12 h。隨后將衍生后的溶液過(guò)0.22 μm濾膜,進(jìn)樣分析。HPLC條件:色譜柱為X-Bridege C18(100 mm×2.1 mm,3.5 μm),柱溫為35 ℃。流動(dòng)相A相為甲醇,B相為0.1%的甲酸水溶液,流速為0.3 mL/min,梯度洗脫條件:0 min,30% A;5 min,90% A;8 min,100% A;9 min,100% A;10 min,30% A;運(yùn)行時(shí)間:15 min。MS/MS條件:采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)下的電噴霧正離子模式(ESI+),離子源溫度為110 ℃,脫溶劑溫度為400 ℃。其中MRM模式設(shè)置為GO:m/z 131→m/z 77;MGO:m/z 145→m/z 77;INS:m/z 187→m/z 77;3-DG:m/z 235→m/z 199。GO、MGO和3-DG三種α-二羰基化合物的測(cè)定采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量,以不同的α-二羰基化合物標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo),以其相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與內(nèi)標(biāo)INS峰面積的比值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 AGEs的測(cè)定 參照Z(yǔ)hang等[10]的方法,取稀釋后的反應(yīng)液100 μL,加入50 μL的d4-CML溶液和50 μL的d4-CEL溶液作為內(nèi)標(biāo)。充分混合后過(guò)0.22 μm濾膜,進(jìn)樣分析。HPLC條件:色譜柱為X-Bridege C18(100 mm×2.1 mm,3.5 μm),柱溫為35 ℃。流動(dòng)相A相為乙腈,B相為5 mmol/L的九氟戊酸水溶液,流速為0.3 mL/min,梯度洗脫條件:0 min,5% A;5 min,60% A;7 min,100% A;9 min,100% A;10 min,5% A;運(yùn)行時(shí)間:20 min。MS/MS條件:采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)下的電噴霧正離子模式(ESI+),離子源溫度為110 ℃,脫溶劑溫度為400 ℃。其中MRM模式設(shè)置為CML:m/z 205→m/z 84;CML-d4:m/z 209→m/z 88;CEL:m/z 219→m/z 84;CEL-d4:m/z 223→m/z 88;Pyr:m/z 255→m/z 175。其中,CML和CEL的測(cè)定采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量,以CML和CEL標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo),以其標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;Pyr的測(cè)定采用外標(biāo)法進(jìn)行定量,以Pyr標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo),以Pyr標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用Origin 9.0軟件進(jìn)行作圖。MassLynx V4.1軟件用于液質(zhì)參數(shù)的控制以及數(shù)據(jù)的采集和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

為了測(cè)定體系中AGEs和α-二羰基化合物的含量,本實(shí)驗(yàn)在參考Zhang等[9-10]研究的基礎(chǔ)上分別建立了兩種液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS/MS)方法用于同步測(cè)定三種AGEs(CML、CEL和Pyr)和三種α-二羰基化合物(GO、MGO和3-DG)。圖1顯示了AGEs及α-二羰基化合物的LC-MS/MS譜圖,各化合物在MRM模式下都具有較好的峰型。

圖1 AGEs和α-二羰基化合物的液質(zhì)定量離子流圖

為了進(jìn)一步研究方法的準(zhǔn)確性,本實(shí)驗(yàn)對(duì)該方法從線性回歸分析、定量限(LOQ)、檢測(cè)限(LOD)、加標(biāo)回收率以及精密度等方面進(jìn)行考察,結(jié)果如表1和表2所示。從表1可以看出,3種AGEs和3種α-二羰基化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好,其相關(guān)系數(shù)均大于0.99。3種AGEs的LOD值為5.77～6.88 ng/g,LOQ值為8.65～10.31 ng/g;3種α-二羰基化合物的LOD值為5.72～9.88 ng/g,LOQ值為9.16～12.34 ng/g。儀器的LOD值以及LOQ值表明體系中目標(biāo)物上樣濃度在該范圍之上均可以滿足定量分析的要求。表2反應(yīng)了兩種液質(zhì)聯(lián)用法的日內(nèi)精密度數(shù)據(jù)以及不同濃度的加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)。從表2可以看出,3種AGEs和3種α-二羰基化合物日內(nèi)精密度均在1.50%～9.13%之間,其不同濃度的加標(biāo)回收率均在85%～110%之間。加標(biāo)回收率以及日內(nèi)精密度數(shù)據(jù)均表明本實(shí)驗(yàn)所建立的兩種方法適合同步定量分析當(dāng)前體系中AGEs和α-二羰基化合物的含量。

表1 液質(zhì)聯(lián)用法的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍、R2、LOD值和LOQ值Table 1 Standard curves,linear range,R2,LOD and LOQ of the LC-MS/MS method

表2 液質(zhì)聯(lián)用法的回收率和精密度Table 2 Recovery and precision of the LC-MS/MS method

2.2 不同單糖-賴氨酸體系pH隨加熱時(shí)間的變化

圖2反應(yīng)了4種單糖-賴氨酸體系pH隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而變化的情況。由圖2可知,糖的類型和反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系pH有著明顯的影響。相比較酮糖體系(Fru-Lys和Sor-Lys),醛糖體系(Gla-Lys和Glu-Lys)的pH下降更為明顯。引起體系pH下降的原因一方面可能是賴氨酸作為堿性氨基酸,在反應(yīng)過(guò)程中隨著氨基的消耗使體系pH下降;另一方面,糖的降解會(huì)形成甲酸、乙酸等有機(jī)酸,從而引起體系pH的下降。Carline等[11]研究表明,醛糖和酮糖體系中甲酸和乙酸生成量差別并不明顯,因此賴氨酸的消耗可能是引起體系間pH差異的主要原因。

圖2 不同體系中pH隨加熱時(shí)間的變化

2.3 不同單糖-賴氨酸體系反應(yīng)物顏色隨加熱時(shí)間的變化

反應(yīng)物顏色變化可以反映美拉德反應(yīng)的程度,實(shí)驗(yàn)采用294 nm和420 nm波長(zhǎng)處的吸光度變化反映美拉德反應(yīng)的程度,前者是無(wú)熒光的褐色素前體物的形成,后者是反應(yīng)末期褐色素的形成[12]。圖3反應(yīng)了4種單糖-賴氨酸體系中波長(zhǎng)294和420 nm處的吸光度隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而變化的情況。由圖3可知,隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng),四個(gè)體系的褐色素前體物及褐色素的含量都明顯上升。在反應(yīng)結(jié)束時(shí),褐色素前體物的含量由高到低為:Gla-Lys>Glu-Lys>Sor-Lys>Fru-Lys。隨著反應(yīng)時(shí)間的增長(zhǎng),美拉德反應(yīng)進(jìn)入最后階段,褐變程度加深,形成了類黑精等色素物質(zhì)(圖3b)。

圖3 不同體系中褐色素前體物(a)及褐變程度(b)隨加熱時(shí)間的變化

2.4 不同單糖-賴氨酸反應(yīng)體系中底物的消耗差異

圖4反應(yīng)了4種單糖-賴氨酸體系中底物單糖和賴氨酸的含量隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而變化的情況。由圖4(a)可知,所有體系中賴氨酸的含量都隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而減少。兩個(gè)醛糖體系中賴氨酸的損失沒(méi)有明顯差別,但是均高于酮糖體系。在反應(yīng)120 min后,Glu-Lys和Gla-Lys體系中賴氨酸的損失高達(dá)26.65%、28.95%,而Fru-Lys和Sor-Lys體系中賴氨酸的損失僅為11.47%、14.90%。醛糖和酮糖的賴氨酸損失差異與體系顏色變動(dòng)的順序類似。

圖4 不同體系中賴氨酸(a)和糖(b)的含量隨加熱時(shí)間的變化

由圖4(b)可知,在相同的反應(yīng)時(shí)間內(nèi),所有單糖-賴氨酸體系中單糖的損失均要高于賴氨酸的損失。在反應(yīng)120 min后,Glu-Lys、Gla-Lys、Fru-Lys和Sor-Lys體系中單糖的損失分別達(dá)到了80.50%、76.20%、75.05%、81.65%。

一般來(lái)說(shuō),賴氨酸含量的變化反應(yīng)了美拉德反應(yīng)的進(jìn)程。隨著反應(yīng)的進(jìn)行,體系中賴氨酸與單糖共價(jià)結(jié)合生成席夫堿化合物,然后席夫堿進(jìn)一步通過(guò)重排、縮合、交聯(lián)等反應(yīng)生成最終產(chǎn)物,如類黑精等[13]。反應(yīng)體系中單糖的損失遠(yuǎn)高于賴氨酸的損失,這意味著單糖可能發(fā)生了其他反應(yīng)。為了探討單糖與賴氨酸的損失差異,進(jìn)一步測(cè)定了糖的異構(gòu)化反應(yīng),即Glu-Lys體系中果糖的含量以及Fru-Lys體系中葡萄糖的含量。圖4(b)結(jié)果顯示,兩個(gè)體系中經(jīng)異構(gòu)化生成的糖的含量并不高,在反應(yīng)結(jié)束時(shí),Glu-Lys體系中果糖的含量為6.64%,Fru-Lys體系中葡萄糖的含量為5.28%。上述結(jié)果暗示,單糖可能進(jìn)一步參與到了美拉德反應(yīng)后期類黑精等的生成中,具體途徑還有待于進(jìn)一步研究。

2.5 不同單糖-賴氨酸反應(yīng)體系中AGEs中間體的生成差異

在糖-賴氨酸簡(jiǎn)單模擬體系中,AGEs的生成一般而言可能存在4種途徑,即a. 美拉德反應(yīng)途徑：美拉德反應(yīng)生成席夫堿和Amadori產(chǎn)物,隨后,這些Amadori產(chǎn)物經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜反應(yīng)(脫水和重排反應(yīng)),生成一些高活性的二羰基化合物,包括GO、MGO、3-DG等,這些二羰基化合物進(jìn)一步與氨基酸殘基發(fā)生反應(yīng),生成穩(wěn)定且不可逆的AGEs,如CML、CEL和Pyr;b. AGEs美拉德旁路反應(yīng)：即席夫堿氧化碎裂后生成二羰基化合物,然后進(jìn)一步反應(yīng)生成AGEs;c. AGEs也可以直接通過(guò)Amadori產(chǎn)物的重排生成[14];d. FL途徑：FL是美拉德反應(yīng)早期階段所形成的另一種中間體,它可以通過(guò)氧化途徑或非氧化途徑形成AGEs[15]。為了探討不同單糖在單糖-賴氨酸模擬體系中各個(gè)可能途徑及其差異,實(shí)驗(yàn)分別測(cè)試了體系中GO、MGO、3-DG和FL的生成量隨加熱時(shí)間的變化,結(jié)果見(jiàn)圖5所示。

圖5 不同體系中GO(a)、MGO(b)、3-DG(c)和FL(d)的生成量隨加熱時(shí)間的變化

圖5反應(yīng)了4種單糖-賴氨酸體系中間體的含量隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而變化的情況。由圖5可知,反應(yīng)時(shí)間對(duì)中間體的生成有明顯的影響。所有體系中GO和3-DG的含量在20～120 min內(nèi)隨著反應(yīng)的進(jìn)行而逐漸下降。Glu-Lys、Gla-Lys、Fru-Lys和Sor-Lys體系中GO在20 min時(shí)的生成量分別為(215.18±5.57)、(404.86±60.22)、(262.48±19.35)、(505.07±36.40) μmol/L,而3-DG在20 min時(shí)的生成量分別為(594.91±66.99)、(383.99±27.56)、(257.14±27.87)、(308.63±33.58) μmol/L。這表明體系中GO和3-DG在反應(yīng)前20 min內(nèi)大量生成,隨后其消耗速率大于生成速率,因此體系中GO和3-DG的含量開(kāi)始下降。所有體系中MGO的生成趨勢(shì)基本一致。其中Glu-Lys、Gla-Lys和Fru-Lys體系MGO的含量在20～100 min內(nèi)隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而增加,而在100～120 min內(nèi)其含量逐漸下降。在100 min時(shí),Glu-Lys、Gla-Lys和Fru-Lys體系中MGO達(dá)到最大生成量,分別為(466.35±47.51)、(410.47±43.34)、(473.85±17.42) μmol/L。Sor-Lys體系中MGO的含量在20～80 min呈上升趨勢(shì),在80～120 min內(nèi)呈先下降后上升的趨勢(shì),其MGO的最大生成量為(475.90±40.23) μmol/L。Glu-Lys、Gla-Lys和Sor-Lys三個(gè)體系中FL生成規(guī)律都呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì),其含量分別在60、40、60 min時(shí)達(dá)到最大值,最大值分別為(117.53±1.61)、(100.35±4.47)、(46.77±2.50) μmol/L。而Fru-Lys體系中FL的含量在20～120 min內(nèi)持續(xù)上升,在120 min時(shí)生成量達(dá)到(50.55±1.09) μmol/L。

上述結(jié)果中4種單糖-賴氨酸反應(yīng)模擬體系中α-二羰基化合物的生成量均明顯高于FL,暗示,在當(dāng)前研究體系下α-二羰基化合物是生成AGEs的主要途徑。本研究中GO和MGO在反應(yīng)初期(20 min)就已經(jīng)大量生成,而MGO的含量在反應(yīng)120 min時(shí)基本趨于穩(wěn)定,該結(jié)果與黃啟瑞等[16]的研究結(jié)果一致。但本研究中α-二羰基化合物的生成量均明顯高于FL的結(jié)果與Han等[15]的研究有一定差異,他們的研究結(jié)果中GO生成相對(duì)比較慢,且在反應(yīng)過(guò)程中也存在著最大值,且FL的含量要遠(yuǎn)高于GO,這可能是由于反應(yīng)體系處理不一樣而引起反應(yīng)機(jī)制的不同。

2.6 不同單糖對(duì)AGEs的生成的影響

圖6反應(yīng)了4種單糖-賴氨酸體系A(chǔ)GEs的含量隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而變化的情況。由圖6可知,單糖的類型對(duì)CML生成量有一定的影響,在反應(yīng)結(jié)束時(shí)體系中 CML的含量為Fru-Lys>Sor-Lys>Glu-Lys>Gla-Lys。這一趨勢(shì)與CML的中間體GO相似。雖然體系中GO含量隨著反應(yīng)的進(jìn)行而快速下降,但是反應(yīng)進(jìn)行到40 min后酮糖體系GO的含量均高于醛糖體系。這進(jìn)一步驗(yàn)證了在當(dāng)前研究體系中CML主要通過(guò)GO途徑生成。Glu-Lys、Gla-Lys和Fru-Lys體系中CML的含量在20～100 min內(nèi)逐漸上升,隨后開(kāi)始下降,其在100 min時(shí)的生成量分別為(284.63±37.59)、(256.76±24.82)、(309.51±31.71) μmol/L。而Sor-Lys體系中CML的含量在80 min時(shí)達(dá)到最大值,其值為(306.76±6.11) μmol/L。這與Nguyend等[6]研究結(jié)論一致,CML有一定的熱不穩(wěn)定性,糖-酪蛋白體系中CML的含量在130 ℃下加熱25 min后開(kāi)始下降。不同體系中CEL的生成規(guī)律如圖6(b)所示。Glu-Lys和Gla-Lys體系中CEL的含量在20～100 min內(nèi)一直上升,在100 min時(shí)分別達(dá)到了(454.11±54.12)、(418.49±34.67) μmol/L;在120 min時(shí),其含量又分別下降到了(439.69±18.97)、(395.76±41.45) μmol/L。Fru-Lys和Sor-Lys體系中CEL的含量在20～120 min內(nèi)一直上升,在120 min時(shí)分別達(dá)到了(468.52±20.19)、(489.85±13.43) μmol/L。這與MGO的變化趨勢(shì)相似,在20 min時(shí)醛糖體系中MGO含量要高于酮糖體系,而在120 min時(shí)酮糖體系中MGO的含量更高。這表明MGO可能是CEL的主要中間體,加熱時(shí)間的延長(zhǎng)促使體系中MGO與賴氨酸進(jìn)一步反應(yīng)生成CEL。

圖6 不同體系中CML(a)、CEL(b)和Pyr(c)的生成量隨加熱時(shí)間的變化

與CML和CEL相比,體系中的Pyr含量明顯較少。反應(yīng)結(jié)束時(shí),Glu-Lys、Gla-Lys、Fru-Lys和Sor-Lys體系中Pyr的含量分別為(50.67±1.29)、(49.92±3.46)、(38.95±3.75)、(75.18±8.09) μmol/L。Liang等[17]研究也發(fā)現(xiàn),溫度對(duì)Pyr的生成有著顯著的影響。對(duì)于葡萄糖-賴氨酸、果糖-賴氨酸、蔗糖-賴氨酸體系,其Pyr含量在60～120 ℃下生成量較低,隨著溫度進(jìn)一步提高,其含量才有明顯上升。

將底物消耗、反應(yīng)物顏色變動(dòng)、中間體生成以及最終AGEs生成結(jié)合起來(lái)分析可以發(fā)現(xiàn),賴氨酸損失與反應(yīng)物顏色變動(dòng)趨勢(shì)基本一致,醛糖大于酮糖。這表明醛糖參于美拉德反應(yīng)的程度要高于酮糖,但是單糖的類型對(duì)AGEs生成的影響并不遵從這一規(guī)律。在反應(yīng)結(jié)束時(shí),Fru-Lys和Sor-Lys兩個(gè)酮糖體系中CML和CEL的含量均要高于Glu-Lys和Gla-Lys兩個(gè)醛糖體系。另外,在當(dāng)前研究條件下,酮糖體系中CML含量在20～120 min內(nèi)一直高于醛糖體系。這和體系中GO含量的變化趨勢(shì)相類似。GO是生成CML的主要中間體,酮糖體系中GO含量在40～120 min內(nèi)一直高于醛糖體系(圖5a)。由圖6(b)可知,CEL的含量在20～80 min時(shí)快速生成,隨后在80～120 min含量變化較小。如Sor-Lys體系CEL的含量由20 min的(149.91±6.87) μmol/L上升到80 min的(450.34±6.8721.61) μmol/L,隨后達(dá)到了120 min的(489.85±13.43) μmol/L。所有體系中Pyr的生成量遠(yuǎn)低于CML和CEL的生成量。在20～120 min內(nèi),Sor-Lys體系中Pyr的含量一直高于Glu-Lys、Gla-Lys和Fru-Lys體系。隨著加熱的進(jìn)行,Sor-Lys體系中Pyr的含量由20 min的(32.29±2.89) μmol/L上升到120 min的(75.18±8.09) μmol/L。雖然醛糖參于美拉德反應(yīng)的程度要高于酮糖,但是其對(duì)AGEs生成的影響卻各不相同。這主要是因?yàn)锳GEs生成途徑復(fù)雜，它既可以通過(guò)美拉德反應(yīng)生成,也可以由α-二羰基化合物與賴氨酸反應(yīng)而生成。這表明未來(lái)控制AGEs需要從途徑著手,重點(diǎn)控制中間體α-二羰基化合物的生成。

3 結(jié)論

本文研究了單糖的類型和加熱時(shí)間對(duì)體系中AGEs生成的影響。結(jié)果表明,在當(dāng)前研究條件下,醛糖體系中pH的下降程度和顏色的增加程度均要高于酮糖體系。Glu-Lys、Gla-Lys、Fru-Lys和Sor-Lys體系中賴氨酸在加熱120 min時(shí)的損失分別為26.65%、28.95%、11.47%、14.90%。所有單糖體系中單糖在加熱120 min時(shí)的損失均達(dá)到75%以上,而單糖的異構(gòu)化程度低于10%,這表明單糖除了參于美拉德反應(yīng)之外,還通過(guò)氧化降解等途徑產(chǎn)生損失。

所有體系中GO的含量在20～120 min內(nèi)一直呈下降趨勢(shì),這表明GO在反應(yīng)前20 min內(nèi)大量生成。所有體系在20～120 min內(nèi)MGO和3-DG的含量遠(yuǎn)高于FL的含量,推測(cè)在當(dāng)前條件下α-二羰基化合物可能是形成AGEs的主要中間體。在反應(yīng)結(jié)束時(shí),酮糖體系的的CML和CEL含量均要高于醛糖體系,Sor-Lys體系在120 min時(shí)CML和CEL的生成量分別達(dá)到了(283.18±18.83)、(489.85±13.43) μmol/L。而所有體系中Pyr的生成量均要遠(yuǎn)低于CML和CEL的生成量,其中Sor-Lys體系Pyr生成量最高,在120 min時(shí)達(dá)到了(75.18±8.09) μmol/L。在美拉德反應(yīng)過(guò)程中,醛糖體系pH下降、顏色增加、賴氨酸損失的程度均高于酮糖體系。但是,反應(yīng)結(jié)束時(shí)酮糖體系CML和CEL以及中間體GO和MGO的含量均高于醛糖體系,這表明單糖的類型對(duì)美拉德反應(yīng)和AGEs生成的影響各不相同。本研究為探討美拉德反應(yīng)過(guò)程中AGEs的生成途徑提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),為通過(guò)改變加工條件來(lái)降低真實(shí)食品體系中AGEs的含量提供了理論支持。