劉 瑞,胡煥煥,石曉衛(wèi),豐慧根

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院研究生處,河南新鄉(xiāng) 453003)

大豆異黃酮是大豆生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的次生代謝物,可以預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松、心血管疾病、婦女絕經(jīng)綜合癥、與激素相關(guān)的各種癌癥,具有抗氧化、清除自由基及誘發(fā)癌細(xì)胞凋亡等作用,廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、保健領(lǐng)域[1]。作為多功能性健康食品,大豆異黃酮具有較好的開發(fā)前景[2]。大豆異黃酮主要分布于大豆種子的子葉和胚軸中,胚軸中異黃酮含量較高,為1%～2%,但由于胚只占種子重量的2%,限制了大豆異黃酮的生產(chǎn)[3]。植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的技術(shù)已經(jīng)比較成熟,是高效生產(chǎn)大豆異黃酮的重要途徑。

組織培養(yǎng)材料的遺傳特性是影響植物組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)積累次生代謝物質(zhì)的重要因素[4]。選擇異黃酮含量高的品種及外植體誘導(dǎo)愈傷組織,對(duì)獲得高產(chǎn)異黃酮細(xì)胞懸浮體系甚為關(guān)鍵。在植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中,常用添加前體或誘導(dǎo)子的方法提高次生代謝產(chǎn)物的含量。異黃酮是由苯丙烷類代謝途徑的分支所形成的次生代謝產(chǎn)物,苯丙氨酸和乙酸是黃酮類生物合成的重要前體[5]。楊英、高麗華等[6-7]分別在脹果甘草和水母雪蓮懸浮細(xì)胞中添加苯丙氨酸(Phe)或乙酸鈉(NaAc),均促進(jìn)了黃酮類化合物的積累。真菌能產(chǎn)生誘導(dǎo)植物合成次生代謝物的活性物質(zhì),如寡聚糖、β-葡聚糖、幾丁質(zhì)寡糖、糖蛋白、蛋白質(zhì)和多肽等,因此在植物細(xì)胞培養(yǎng)中常被用作誘導(dǎo)子來提高次生代謝產(chǎn)物的含量[8]。青霉(Penicillium)和黑曲霉(Aspergillusniger)是自然界普遍存在的兩種真菌,兩種誘導(dǎo)子也被廣泛應(yīng)用于不同植物細(xì)胞中萜類、生物堿、皂苷等物質(zhì)的合成,并取得一定成果[9-10]。但青霉和黑曲霉作為誘導(dǎo)子對(duì)大豆懸浮細(xì)胞生產(chǎn)異黃酮的影響少有報(bào)道。

因此,本研究以高異黃酮含量的品種龍野01-491為材料,以其下胚軸為外植體,進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo),建立細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系。在此基礎(chǔ)上,添加不同的前體(L-phe、NaAc)、生物誘導(dǎo)子(青霉誘導(dǎo)子、黑曲霉誘導(dǎo)子),分析其對(duì)異黃酮產(chǎn)量的影響,以期為細(xì)胞工程技術(shù)生產(chǎn)大豆異黃酮藥物或功能性食品提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆:龍野01-491 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種研究所提供的高異黃酮含量大豆品系;黑曲霉 編號(hào)GIM 3.613,廣東省微生物菌種保藏中心;青霉 編號(hào)GIM 3.106,中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心;大豆黃素、染料木黃酮、大豆苷、染料木苷 Sigma;冰乙酸、甲醇 天津彪仕奇科技發(fā)展有限公司;二乙酸熒光素(FDA)、乙酸鈉(NaAc)、L-苯丙氨酸(L-phe)、6-芐氨基嘌呤(6-BA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、1-萘乙酸(NAA)、NaClO、濃H2SO4、蔗糖、瓊脂粉、水解乳蛋白(LH) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;MS培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

MGC-450HP人工智能光照培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;ZWYR-2102C雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;Nikon E600熒光顯微鏡 日本Nikon公司;GWA-UP型超純水器 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;VARIAN Prostar240高效液相色譜儀 美國(guó)VARIAN公司;DS-1型電動(dòng)高速組織勻漿機(jī) 江蘇江陰科研器械廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 愈傷組織的誘導(dǎo) 龍野01-491為野生大豆,種皮呈褐色且稍厚,參考張秀玲、朱學(xué)藝等[11-12]的方法并略作改動(dòng)，進(jìn)行種子脫毒、發(fā)芽和下胚軸愈傷組織的誘導(dǎo)。先用刀片將種子破皮,濃H2SO4處理5 min,用75%酒精處理30 s,無菌水沖洗1次,1% NaClO處理5 min,無菌水清洗4～5次。將脫毒后的種子接入含3%蔗糖的1/2 MS固體培養(yǎng)基中,待種子發(fā)芽3 cm左右時(shí),取下胚軸。以下胚軸為外植體,接入到含0.5 mg/L 2,4-D、1.0 mg/L NAA、0.1 mg/L 6-BA、30 g/L蔗糖、100 mg/L LH的MS固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織[13];培養(yǎng)條件:25 ℃,暗培養(yǎng),培養(yǎng)2周。

1.2.2 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立 參考梁曉芳等[13]方法。取質(zhì)地疏松、生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織15 g,接種到100 mL含0.8 mg/L 2,4-D、30 g/L蔗糖的MS液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,110～120 r/min,25 ℃,暗培養(yǎng),振蕩培養(yǎng)3 d,依次用60、200目尼龍網(wǎng)過濾,除去愈傷組織碎片和細(xì)胞團(tuán),獲得懸浮細(xì)胞體系。

1.2.3 大豆懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)特性的檢測(cè) 按4 g/L(細(xì)胞干重計(jì))細(xì)胞密度接種,并使接種后的體積為30 mL,于0、3、6、9、12、15 d取搖瓶細(xì)胞懸液,測(cè)細(xì)胞生物量,繪制懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。取1滴細(xì)胞懸液于載玻片上,加一滴0.04 mg/mL FDA溶液,常溫作用5 min,加蓋玻片,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和活性。

1.2.4 細(xì)胞生物量的測(cè)定 取大豆懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物,抽濾,50 ℃烘干至恒重,稱重,每次三個(gè)重復(fù)。細(xì)胞生物量為每瓶(每30 mL培養(yǎng)物)收獲的細(xì)胞干重(g/flask(瓶))。

1.2.5 異黃酮的提取及測(cè)定

1.2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取大豆苷、染料木苷、大豆黃素、染料木黃酮各5.0 mg,均用80%甲醇溶解并定容至10 mL,配制成0.5 mg/mL的四種標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)貯備液。分別取四種標(biāo)準(zhǔn)貯備液各1.0、0.5、0.25、0.125 mL,用80%甲醇稀釋并定容至10 mL,配制50、25、12.5、6.25 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。0.45 μm濾膜過濾,供高效液相色譜檢測(cè),以大豆異黃酮各單體濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo),以峰面積為縱坐標(biāo)繪制四種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線,其回歸方程分別為:Y=1.6304×105X+9.6333×105(R2=0.9993);Y=1.8483×105X+8.9980×105(R2=0.9989);Y=3.5701×105X+2.5849×106(R2=0.9969);Y=1.7681×105X+3.8145×105(R2=0.9997)。

1.2.5.2 異黃酮的提取 參考程真真等[14]方法。將細(xì)胞樣品粉碎,過60目,以1∶1000 (m∶V)向樣品中加入80%甲醇,超聲提取30 min,5000 r/min離心15 min,取上清,0.45 μm濾膜過濾,得待測(cè)樣品液。

1.2.5.3 高效液相色譜條件 依據(jù)張曉波、賈蕓等[15-16]HPLC檢測(cè)方法進(jìn)行改良。HPLC檢測(cè)條件:色譜柱:ODS-BP C18柱(4.6 mm×200 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇∶2.2%冰乙酸=50∶50 (V∶V);柱溫:50 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;流速:1 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;進(jìn)樣時(shí)間:20 min。四種標(biāo)準(zhǔn)品混合進(jìn)樣,出峰順序?yàn)?大豆苷、染料木苷、大豆黃素、染料木黃酮。

1.2.5.4 異黃酮含量與異黃酮產(chǎn)量的測(cè)定 異黃酮含量為細(xì)胞內(nèi)四種異黃酮含量之和,代表細(xì)胞合成異黃酮的能力,本文以1 g干細(xì)胞中的4 種異黃酮的總質(zhì)量表示,單位為mg/g。

異黃酮含量(mg/g)=X·V/m

式中:X為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的各異黃酮濃度;V為抽提定容體積;m為樣品質(zhì)量。

異黃酮產(chǎn)量是確定培養(yǎng)條件下培養(yǎng)瓶中細(xì)胞的異黃酮總產(chǎn)量,本文以每瓶(30 mL培養(yǎng)物)中的總異黃酮質(zhì)量表示,單位為mg/flask。

異黃酮產(chǎn)量(mg/flask)=細(xì)胞干重(g/flask)×異黃酮含量(mg/g)。

1.2.6 添加前體對(duì)大豆懸浮細(xì)胞生物量、異黃酮含量及異黃酮產(chǎn)量的影響 分別在細(xì)胞培養(yǎng)的0、9 d,向大豆細(xì)胞懸浮體系中分別添加不同濃度的經(jīng)過濾除菌的NaAc(10、50、80、100 μmol/L)和L-Phe(50、80、100、150 μmol/L溶液),每組三個(gè)重復(fù),以不加前體的培養(yǎng)液作為對(duì)照,12 d時(shí)收獲細(xì)胞,考察其對(duì)細(xì)胞生物量、異黃酮含量、細(xì)胞總異黃酮產(chǎn)量的影響。

1.2.7 添加誘導(dǎo)子對(duì)大豆懸浮細(xì)胞生物量、異黃酮含量及異黃酮產(chǎn)量的影響 參考文濤等的誘導(dǎo)子制備方法[17]。將青霉和黑曲霉的凍干菌種,分別接種在馬鈴薯固體培養(yǎng)基上,28 ℃活化培養(yǎng)4 d,接種到馬鈴薯液體培養(yǎng)基中,28 ℃,120 r/min搖床震蕩培養(yǎng)5 d,4層紗布過濾收獲菌絲體。菌絲體經(jīng)0.05 mol/L(pH7.0)的磷酸緩沖液洗滌3次,1 g菌絲沉淀重懸浮于10 mL水中,2000 r/min勻漿5 min,4000 r/min離心10 min,棄沉淀,上清液于121 ℃下滅菌20 min,即為真菌誘導(dǎo)子。向裝有30 mL細(xì)胞培養(yǎng)液的搖瓶中分別添加不同量的黑曲霉和青霉誘導(dǎo)子,每組三個(gè)重復(fù),以不加真菌誘導(dǎo)子的培養(yǎng)液作為對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS軟件,用LSD法進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆下胚軸的愈傷組織

大豆下胚軸在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,誘導(dǎo)6 d即出愈,脫分化程度良好、質(zhì)地疏松、黃白色、生長(zhǎng)良好(圖1)。

圖1 下胚軸愈傷組織

2.2 懸浮培養(yǎng)大豆細(xì)胞的生長(zhǎng)和異黃酮的合成與積累

愈傷組織建立的細(xì)胞懸浮體系,細(xì)胞懸液呈乳白色。經(jīng)FDA染色,熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),大豆懸浮細(xì)胞較大,形狀主要為類圓形、桿狀和長(zhǎng)條狀,細(xì)胞活性較強(qiáng),發(fā)出明亮的綠色熒光(圖2)。

懸浮培養(yǎng)的大豆細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞的異黃酮合成曲線如圖3所示。大豆細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈S形,0～3 d為滯后期,3～9 d為對(duì)數(shù)期,9～15 d為穩(wěn)定期。在0～6 d,異黃酮的含量增加緩慢;6～12 d,異黃酮含量迅速增加;12～15 d,異黃酮含量稍有下降,且無顯著性差異(p>0.05)。細(xì)胞異黃酮積累如圖3所示,異黃酮產(chǎn)量在0～3 d增長(zhǎng)緩慢;第3 d起,雖然細(xì)胞合成異黃酮緩慢,但是細(xì)胞已進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,異黃酮產(chǎn)量也迅速增加,并在12 d達(dá)到最大值(3.86±0.20) mg/flask。選擇在細(xì)胞培養(yǎng)12 d時(shí)收獲細(xì)胞并獲取異黃酮。

圖3 大豆懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、異黃酮合成及異黃酮積累曲線

在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中添加前體和誘導(dǎo)子,可能提高細(xì)胞中次級(jí)代謝產(chǎn)物的含量,但也有可能抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)[6]。在不少的研究報(bào)道中,前體和誘導(dǎo)子的添加策略一般是在細(xì)胞已長(zhǎng)至較高密度的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期加入有助于次生物代謝物合成的物質(zhì)[7]。但是,Chen等在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)初期時(shí),向其中加入苯丙氨酸,紫杉醇產(chǎn)量提高了10倍[18]。因此,選擇在大豆細(xì)胞懸浮培養(yǎng)初期0 d和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期9 d加入前體和誘導(dǎo)子,考察不同前體和真菌誘導(dǎo)子對(duì)大豆細(xì)胞生長(zhǎng)和異黃酮積累的影響。

2.3 前體對(duì)懸浮細(xì)胞異黃酮積累的影響

2.3.1 L-phe 分別在細(xì)胞培養(yǎng)的0、9 d添加50、80、100、150 μmol/L L-phe,12 d時(shí)收獲細(xì)胞,稱細(xì)胞干重,測(cè)細(xì)胞異黃酮含量,結(jié)果如圖4。圖4結(jié)果表明,在細(xì)胞培養(yǎng)0 d添加L-phe,50～80 μmol/L L-phe對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無明顯抑制作用,而100～150 μmol/L的L-phe對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用;而9 d時(shí)加入L-phe對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)明顯起促進(jìn)作用,在50～150 μmol/L范圍內(nèi),隨著L-phe濃度的增大作用減小。結(jié)果提示,9 d時(shí)加入L-phe更有利于大豆細(xì)胞生長(zhǎng)。檢測(cè)不同處理組細(xì)胞中異黃酮含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),9 d加入L-phe時(shí),不同濃度處理組的異黃酮含量均高于對(duì)照(8.57±0.25) mg/g,具有顯著性差異(p<0.05);在50～100 μmol/L范圍內(nèi),異黃酮含量隨著L-phe濃度的增大而增大,濃度為100 μmol/L時(shí)達(dá)到最大,異黃酮含量為(21.41±0.18) mg/g,是對(duì)照的2.50倍;當(dāng)L-phe濃度為150 μmol/L時(shí),異黃酮含量有所降低。

圖4 L-Phe對(duì)大豆懸浮培養(yǎng)細(xì)胞異黃酮積累的影響

由細(xì)胞生物量和異黃酮含量計(jì)算所有細(xì)胞的異黃酮總產(chǎn)量,結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出,以L-phe作為前體飼喂大豆懸浮細(xì)胞生產(chǎn)異黃酮時(shí),第9 d添加L-phe優(yōu)于0 d時(shí)添加,且當(dāng)L-phe濃度為100 μmol/L時(shí),異黃酮的產(chǎn)量達(dá)到最高(12.52±0.51) mg/flask,是對(duì)照組產(chǎn)量(3.88±0.08) mg/flask的3.23倍。結(jié)果提示,以L-phe作為前體飼喂大豆懸浮細(xì)胞生產(chǎn)異黃酮時(shí),應(yīng)在細(xì)胞培養(yǎng)9 d加入,最佳添加濃度為100 μmol/L。

2.3.2 NaAc 以NaAc作為異黃酮的前體物質(zhì)添加在大豆懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系中,并使其最終濃度為10、50、80、100 μmol/L。結(jié)果如圖5所示,0 d加入低濃度(10～50 μmol/L)NaAc對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響不顯著,高濃度(100 μmol/L)NaAc抑制細(xì)胞生長(zhǎng);而9 d加入10～100 μmol/L NaAc,與對(duì)照組相比細(xì)胞干重均增加,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)明顯起促進(jìn)作用,但隨著濃度的增大,促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用減弱。提示高濃度(100 μmol/L)NaAc不利于細(xì)胞生長(zhǎng)。雖然,在9 d 時(shí)添加NaAc有利于大豆細(xì)胞的生長(zhǎng),但是9 d時(shí)加入不同濃度的NaAc,與對(duì)照相比,異黃酮含量均降低;而在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),0 d添加NaAc促進(jìn)異黃酮合成的作用優(yōu)于9 d,NaAc濃度為50 μmol/L時(shí)細(xì)胞內(nèi)異黃酮含量達(dá)到最高為(10.03±0.13) mg/g,與對(duì)照相比具有顯著性差異(p<0.05),是對(duì)照的1.17倍,當(dāng)NaAc濃度升高時(shí),細(xì)胞內(nèi)異黃酮含量下降。

由細(xì)胞生物量和異黃酮含量計(jì)算異黃酮產(chǎn)量。圖5可以看出,在懸浮培養(yǎng)0 d時(shí)加入80 μmol/L NaAc,異黃酮產(chǎn)量達(dá)到最大(5.55±0.36) mg/flask,是對(duì)照組的1.43倍。

圖5 NaAc對(duì)大豆異黃酮積累的影響

2.4 真菌誘導(dǎo)子對(duì)懸浮細(xì)胞異黃酮積累的影響

2.4.1 黑曲霉誘導(dǎo)子 向大豆懸浮培養(yǎng)體系中添加0.1、0.5、1.0、1.5 mL的黑曲霉誘導(dǎo)子,結(jié)果如圖6所示。在搖瓶培養(yǎng)0 d加入0.1～1.5 mL黑曲霉誘導(dǎo)液,均不同程度地抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng),實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)子添加3 d后,細(xì)胞出現(xiàn)明顯褐化現(xiàn)象;在9 d時(shí)加入黑曲霉誘導(dǎo)子促進(jìn)了細(xì)胞的生長(zhǎng),但隨著添加濃度的增大,促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用減弱。第9 d添加(0.1～1.0 mL)黑曲霉誘導(dǎo)子均有利于細(xì)胞合成異黃酮,不同處理組的異黃酮含量與對(duì)照組均具有顯著性差異(p<0.05)。在第9 d加入黑曲霉誘導(dǎo)子添加量為0.5 mL時(shí),異黃酮含量達(dá)到最大,為(11.15±0.21) mg/g,是對(duì)照組的1.29倍。

圖6 黑曲霉誘導(dǎo)子對(duì)大豆異黃酮積累的影響

在第9 d加入黑曲霉誘導(dǎo)子,既有利于細(xì)胞生長(zhǎng),也促進(jìn)了異黃酮的合成。因此,在此時(shí)加入黑曲霉誘導(dǎo)子優(yōu)于0 d時(shí)誘導(dǎo)的效果。當(dāng)黑曲霉誘導(dǎo)子添加量為0.5 mL時(shí),異黃酮產(chǎn)量均達(dá)到最大,為(7.25±0.30) mg/flask,是對(duì)照的1.82倍。

2.4.2 青霉誘導(dǎo)子 向大豆懸浮培養(yǎng)體系中添加0.1、0.5、1.0、1.5 mL的青霉誘導(dǎo)子,結(jié)果如圖7示。與黑曲霉誘導(dǎo)子結(jié)果相似,9 d向大豆細(xì)胞懸浮液中加入0.1～1.5 mL青霉誘導(dǎo)子,均能明顯促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng),但隨著青霉誘導(dǎo)子量的增加,促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用減小;且不同添加量的處理組,異黃酮含量均增加,與對(duì)照組均具有顯著性差異(p<0.05),其中,1.0 mL青霉誘導(dǎo)子可使異黃酮含量達(dá)到最高為(17.15±0.10) mg/g。綜合細(xì)胞生物量和異黃酮含量,青霉誘導(dǎo)子為0.5 mL時(shí),異黃酮產(chǎn)量達(dá)到最大(10.20±0.17) mg/flask,是對(duì)照組異黃酮產(chǎn)量(3.99±0.08) mg/flask的2.56倍;在0.5～1.5 mL范圍內(nèi),隨著青霉誘導(dǎo)液加入量的增加,異黃酮產(chǎn)量降低。青霉和黑曲霉誘導(dǎo)子均在9 d添加時(shí)異黃酮產(chǎn)量達(dá)到最高,說明在大豆細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期,大豆細(xì)胞對(duì)青霉和黑曲霉誘導(dǎo)子的誘導(dǎo)作用具有較強(qiáng)的反應(yīng)能力。

圖7 青霉誘導(dǎo)子對(duì)大豆異黃酮積累的影響

3 討論與結(jié)論

前體物質(zhì)是終端次生代謝產(chǎn)物在生物體代謝途徑中的中間體,前體飼喂可有效提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量。異黃酮類物質(zhì)合成途徑是類黃酮代謝途徑的一個(gè)分支,由苯丙氨酸和丙二酰輔酶A經(jīng)苯丙氨酸裂解酶(PAL)、香豆酸輔酶A連接酶(4CL)等酶催化,經(jīng)過羥基化、甲氧基化和烷基化過程形成的[19]。從代謝途徑上看,Phe是異黃酮代謝途徑中重要的的合成前體物,乙酸也是黃酮類生物合成的重要前體之一。

楊英等[6]認(rèn)為前體飼喂可能有利于提高細(xì)胞內(nèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物的含量,但同時(shí)也可能會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。前體的最佳添加濃度非常重要。本研究發(fā)現(xiàn),添加合適濃度的L-phe和NaAc均能促進(jìn)大豆異黃酮的產(chǎn)量,與楊英、高麗華等的結(jié)果一致[6-7]。在大豆懸浮體系中添加100 μmol/L L-phe和80 μmol/L NaAc,一方面,對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒有明顯的抑制作用,且作為代謝過程中的中間產(chǎn)物,促進(jìn)了異黃酮的合成;另一方面,合適濃度的L-phe和NaAc能增加苯丙烷類合成途徑的起始酶——苯丙氨酸裂解酶(PAL)的活性,可為后面的合成步驟提供更多前體,從而提高了異黃酮的產(chǎn)量,使其達(dá)到最大[6]。在體系中添加高于最佳添加濃度的前體時(shí),例如:在搖瓶培養(yǎng)的第9 d添加高濃度150 μmol/L L-phe,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生細(xì)胞毒性,細(xì)胞生長(zhǎng)速率下降,細(xì)胞生物量降低;異黃酮含量雖然高于對(duì)照,但是仍低于100 μmol/L L-phe處理組,異黃酮合成減少,最終導(dǎo)致異黃酮產(chǎn)量達(dá)到不到最高。在加入較低濃度(50 μmol/L)L-phe時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)最快,但細(xì)胞內(nèi)異黃酮含量較低,最終的異黃酮產(chǎn)量也達(dá)不到最高。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),NaAc促進(jìn)異黃酮積累的作用比L-phe弱,這與吳桂容等[20]L-phe和NaAc對(duì)雞血藤細(xì)胞產(chǎn)異黃酮的影響研究結(jié)果一致。推測(cè)由于乙酸是聚乙炔類、大環(huán)抗菌素類、多酚類、類異戊二烯的前體,代謝途徑分支較多,NaAc提供的乙酸根離子可能較多地參與脂肪酸類、萜類以及其它黃酮類化合物的合成而造成的[21]。

本研究實(shí)驗(yàn)了接種初期和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期添加L-phe和NaAc對(duì)大豆懸浮細(xì)胞異黃酮積累的影響,發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間添加前體物質(zhì)具有不同的效果。L-phe在第9 d添加優(yōu)于在0 d添加,而NaAc在0 d添加較好,說明不同前體適宜的添加時(shí)間不同。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中,要尋找合適的時(shí)間添加外源前體來提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。L-phe在9 d時(shí)添加時(shí),一方面,9 d時(shí)細(xì)胞積累了足夠的初級(jí)代謝產(chǎn)物,加入合適濃度的L-phe促進(jìn)了異黃酮的合成,異黃酮含量增加,從而達(dá)到促進(jìn)異黃酮積累的目的;另一方面,9 d時(shí),細(xì)胞活性仍較好,但是細(xì)胞培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分已經(jīng)消耗殆盡,實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)的L-phe對(duì)大豆細(xì)胞無毒性,是細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)成分,參與細(xì)胞蛋白質(zhì)合成和作為碳源和氮源促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng),細(xì)胞生物量增加[8]。在9 d時(shí)添加50 μmol/L NaAc時(shí),雖然獲得細(xì)胞生物量較高,但是異黃酮合成量均低于0 d添加不同濃度NaAc的所有處理組;在0 d時(shí)添加80 μmol/L NaAc時(shí),雖然沒有對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)起明顯促進(jìn)作用,但是異黃酮合成增加,異黃酮含量在此時(shí)高于9 d時(shí)添加不同濃度NaAc的所有處理組,最終結(jié)果顯示,0 d時(shí)添加80 μmol/L NaAc的異黃酮產(chǎn)量最大。因此,在添加前體時(shí)需要找到懸浮細(xì)胞生物量與次生產(chǎn)物含量之間的平衡點(diǎn),才能獲得最高的產(chǎn)量[22]。

真菌誘導(dǎo)子是來源于真菌的一種確定的化學(xué)信號(hào)。它能快速、高度專一和選擇性地誘導(dǎo)植物特定基因的表達(dá),進(jìn)而活化特定次生代謝途徑,積累特定的目的次生產(chǎn)物[9]。真菌誘導(dǎo)子能有效促進(jìn)植物次生代謝產(chǎn)物的積累,其誘導(dǎo)效果與真菌誘導(dǎo)子的種類、濃度和作用時(shí)間等因素密切相關(guān)[23]。真菌誘導(dǎo)子誘導(dǎo)次生代謝產(chǎn)物的積累有最適濃度,當(dāng)真菌誘導(dǎo)子的濃度過高時(shí)會(huì)抑制次生代謝產(chǎn)物的合成和積累。本研究中,在9 d添加真菌誘導(dǎo)子時(shí),0.5 mL的青霉誘導(dǎo)子和黑曲霉誘導(dǎo)子對(duì)異黃酮的積累作用最顯著,但隨著加入量的增加,效果減弱,與熊瓊瓊、呂建軍等研究結(jié)果基本一致[9,24]。推測(cè)誘導(dǎo)子濃度過大(1～1.5 mL)時(shí),一方面,高濃度誘導(dǎo)子的細(xì)胞毒性增強(qiáng),降低了大豆細(xì)胞生長(zhǎng)速率,導(dǎo)致異黃酮減少;另一方面,可能抑制了PAL的活性,導(dǎo)致異黃酮合成減少,最終異黃酮的產(chǎn)量下降[25]。

真菌誘導(dǎo)子的作用效果還依賴于培養(yǎng)細(xì)胞的生理狀態(tài),只有處于一定生長(zhǎng)時(shí)期的細(xì)胞才能有效地接受誘導(dǎo)信號(hào)[24]。在本研究中,在0 d時(shí)加入青霉和黑曲霉誘導(dǎo)液均抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng),細(xì)胞生物量顯著降低;9 d加入青霉或黑曲霉誘導(dǎo)子,在合適的濃度范圍內(nèi),沒有對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用,且促進(jìn)了目的代謝產(chǎn)物的合成,有利于產(chǎn)物的積累,與熊瓊瓊、呂建軍等結(jié)果一致。究其原因:0 d時(shí),細(xì)胞還沒有適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境,且活性較低,真菌誘導(dǎo)子加入后快速地引起Ca2+、H+內(nèi)流,培養(yǎng)液pH升高,不利于細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),嚴(yán)重的細(xì)胞毒性抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng),同時(shí)對(duì)其代謝損傷較大,從而抑制了次生代謝產(chǎn)物的積累[8,25];對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的細(xì)胞密度較大,且細(xì)胞活力仍較高,生長(zhǎng)和代謝相對(duì)旺盛,此時(shí)加入一定濃度的外源黑曲霉誘導(dǎo)子或青霉誘導(dǎo)子,能充分接受誘導(dǎo)信號(hào),激活苯丙烷類途徑中的PAL等異黃酮合成限速酶,加速了異黃酮的合成,使細(xì)胞內(nèi)的異黃酮含量和異黃酮產(chǎn)量增加[26]。

本研究利用高異黃酮含量的龍野01-491大豆品系的下胚軸誘導(dǎo)愈傷組織,并建立大豆細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系,就前體和真菌誘導(dǎo)子在提高大豆懸浮細(xì)胞異黃酮積累的方法進(jìn)行了探討。結(jié)果表明,前體(L-phe和NaAc)、真菌誘導(dǎo)子(黑曲霉誘導(dǎo)子和青霉誘導(dǎo)子)均可以在一定程度上提高大豆懸浮培養(yǎng)細(xì)胞異黃酮的產(chǎn)量。雖然前體和真菌誘導(dǎo)子的分別添加能在一定程度上提高大豆懸浮細(xì)胞異黃酮的產(chǎn)量,但誘導(dǎo)子和前體的作用機(jī)制并不重疊,兩者具有協(xié)同添加的基礎(chǔ)[21]。目前,使用前體和真菌誘導(dǎo)子的協(xié)同作用提高異黃酮產(chǎn)量的報(bào)道較少。因此,在本研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究前體和真菌誘導(dǎo)子的協(xié)同作用,是提高大豆懸浮細(xì)胞產(chǎn)異黃酮的又一重要課題。