邱華振,楊昳津,胡 健,王光強(qiáng),熊智強(qiáng),張 匯,艾連中,夏永軍,*

(1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海食品微生物工程技術(shù)研究中心,上海 200093;2.上海金楓酒業(yè)股份有限公司,上海 200120)

福建紅曲米產(chǎn)品全國(guó)出名,具有成熟的生產(chǎn)工藝和典型的代表性[1]。紅曲色素作為食品添加劑應(yīng)用于酒類、飲料以及熟食等食品中[2]。然而紅曲色素光不穩(wěn)定特性制約了紅曲色素廣泛的應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)紅曲色素褪色主要機(jī)制是光降解[3],在光照條件下紅曲色素吸收光子后被激化,由于光的吸收、自由基的產(chǎn)生、發(fā)色團(tuán)的破壞,導(dǎo)致變色和褪色[4]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮的金銀花 山東臨沂沂蒙山;水溶性紅曲紅色素、水溶性紅曲黃色素 山東中惠生物科技股份有限公司;維生素C、蘆丁、槲皮素、醋酸銨 分析純,上海源葉生物科技有限公司;綠原酸 分析純,上海生工生物工程股份有限公司;冰醋酸 分析純,上海泰坦科技股份有限公司;三乙胺、鹽酸 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇、乙腈(分析純)、400度富爾馬肼(Formazine)濁度標(biāo)準(zhǔn)液 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

IKA研磨機(jī) IKA集團(tuán)有限公司;PB-10普及型pH計(jì) 德國(guó)Sartorius公司;2468-2414型液相色譜儀 Waters公司;SpectraMax i3x酶標(biāo)儀 Molecular Devices;HWS-26型水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;UV2600型紫外分光光度計(jì) 尤尼柯儀器有限公司;RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-III型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠;KQ-600B型超聲波清洗器 昆山舒美超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金銀花醇提物的制備 準(zhǔn)確稱取制備好的金銀花粉末2.0 g于100 mL的容量瓶中加入60 mL 55%的乙醇進(jìn)行超聲提取,超聲時(shí)間為30 min、溫度60 ℃[11]。趁熱過(guò)濾,濾渣采用相同的方法進(jìn)行浸提,重復(fù)2次。將所有過(guò)濾后的濾液合并,于圓底燒瓶中55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,然后進(jìn)行真空干燥制得金銀花醇提物干粉,于干燥皿中4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 紅曲色素水溶液及金銀花醇提物色素溶液的制備 分別稱取紅色素和黃色素0.1 g溶于1000 mL的去離子水中,配制成紅色素水溶液和黃色素水溶液,取100 mL上述色素溶液分別添加0.05 g金銀花醇提物,配制成0.5 mg/mL金銀花醇提物色素水溶液,充分溶解并4 ℃遮光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 紅曲色素溶液及添加金銀花醇提物色素溶液的紫外吸收波長(zhǎng)掃描 將配制好的水溶性紅曲紅色素(下文稱“紅色素”)溶液和水溶性紅曲黃色素(下文稱“黃色素”)溶液以及分別添加金銀花醇提物的色素溶液用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)進(jìn)行250～550 nm全波長(zhǎng)掃描,確定其最大吸收峰的吸光值(Amax),以及添加金銀花醇提物后是否影響其最大吸收峰。

1.2.4 紅曲色素溶液的紫外降解動(dòng)力學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)紫外照射加快色素光降解,控制紫外光源距離來(lái)控制紫外強(qiáng)度[12]。準(zhǔn)確量取50 mL紅色素和黃色素溶液分別置于四個(gè)Φ=8 cm透紫外石英平皿中,依次距離40 W、250 nm紫外燈光源4、8、12、16 cm下進(jìn)行紫外照射實(shí)驗(yàn)[13]。每隔15 min取一次樣,用分光光度計(jì)測(cè)定其Amax并計(jì)算色素保存率。

1.2.5 金銀花醇提物添加量的確定 分別用紅色素、黃色素水溶液配成0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mg/mL的金銀花醇提物溶液,分別取50 mL置于Φ=8 cm透紫外石英平皿中進(jìn)行紫外照射每隔30 min取樣一次,分光光度計(jì)測(cè)定其Amax并計(jì)算其色素保存率;同時(shí)測(cè)定不同濃度下的金銀花醇提物色素水溶液的濁度(NTU),觀察其添加量對(duì)色素水溶液濁度的影響。

1.2.6 酸性條件下金銀花醇提物對(duì)色素光穩(wěn)定性的影響 分別取100 mL兩種色素水溶液用1 mol/L鹽酸調(diào)成pH4、pH7,各取50 mL配成濃度為0.5 mg/mL金銀花醇提物色素水溶液,以不添加金銀花醇提物的色素溶液為空白對(duì)照組,然后進(jìn)行紫外照射每隔30 min取樣一次,測(cè)其Amax并計(jì)算色素保存率。

1.2.7 金銀花醇提物HPLC分析

1.2.7.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液的制備 精密的稱取標(biāo)準(zhǔn)樣品綠原酸3.95 mg、蘆丁4.90 mg、槲皮素2.12 mg于25.00 mL的容量瓶中,甲醇溶解,搖勻,定容制成0.158 mg/mL綠原酸、0.196 mg/mL蘆丁、0.085 mg/mL槲皮素的混合對(duì)照品溶液。分別取1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 mL至10 mL的容量瓶中,甲醇溶解并搖勻,定容。用0.25 μm微孔濾膜過(guò)濾,得到一系列不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合液。準(zhǔn)確稱取實(shí)驗(yàn)室制得的金銀花醇提物粉末0.003 g,甲醇溶解,搖勻,定容于25 mL容量瓶中,充分溶解,用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,得到供試品溶液。

1.2.7.2 色譜條件 色譜柱為Sepax HP-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)柱;流動(dòng)相:乙腈(A);0.01 mol/L醋酸銨溶液(每100 mL中0.2 mL三乙胺,乙酸調(diào)pH至4.8)(B),采用梯度洗脫,梯度洗脫程序:0～30 min,A∶B 8∶92～30∶70 (V/V),流速:1.00 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm[14]。

1.2.7.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 在上述的條件下對(duì)上述的樣品進(jìn)行HPLC檢測(cè)分析,以綠原酸、蘆丁、槲皮素測(cè)定峰面積值(y)為縱坐標(biāo);以其相應(yīng)的一系列濃度(x)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計(jì)算回歸方程:綠原酸:y=12258x-92.325,R2=0.9999;槲皮素:y=34736x-94.721,R2=0.9999;蘆丁:y=16565x-44.851,R2=1.0000。

1.2.8 綠原酸對(duì)紅曲色素的護(hù)色效果分析 各取0.05 g綠原酸、金銀花醇提物、VC,分別用紅色素水溶液和黃色素水溶液配制成0.5 mg/mL綠原酸色素溶液、0.5 mg/mL金銀花醇提物色素溶液、0.5 mg/mL VC色素溶液,分別取50 mL置于Φ=8 cm透紫外石英平皿中距離紫外燈16 cm進(jìn)行照射,每隔30 min取樣一次測(cè)其Amax并計(jì)算其色素保存率。

1.2.9 色素保存率的計(jì)算 以A(%)對(duì)時(shí)間作圖來(lái)表示紅曲色素隨光降解濃度隨時(shí)間的變化關(guān)系,并按下式來(lái)計(jì)算色素保存率。

保存率:A(%)=Ax/A0×100

式中:A0為色素的起始Amax值;Ax為處理后色素Amax值。

1.2.10 紅曲色素水溶液濁度的測(cè)定 運(yùn)用WGZ-1A散射光濁度儀對(duì)紅曲色素水溶液濁度進(jìn)行測(cè)定。分別將零度水和富爾馬肼倒入樣品瓶中,液體凹液面與其刻度線齊平,然后擰緊瓶蓋并擦拭干凈瓶上的指印和水跡,然后置入樣品座內(nèi)蓋上遮光蓋,分別進(jìn)行調(diào)零和校準(zhǔn)。調(diào)零校準(zhǔn)后同樣方法對(duì)樣品進(jìn)行濁度測(cè)試,待數(shù)值穩(wěn)定后即可記下紅曲色素溶液的濁度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、方程擬合和方差分析,采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色素溶液以及添加金銀花醇提物色素溶液的紫外吸收波長(zhǎng)掃描圖分析

圖1中a紅色素在486 nm處有最大吸收峰,與文獻(xiàn)中所測(cè)最大吸收峰一樣[15]。圖c黃色素在466 nm處有最大吸收峰,與文獻(xiàn)中的最大吸收峰相近[16]。圖b、d與原始紅曲色素溶液相比,添加了金銀花醇提物后的色素溶液吸收特征在可見(jiàn)光部分沒(méi)有顯著變化,即金銀花醇提物對(duì)紅曲色素的吸收峰沒(méi)有影響,根據(jù)Fuleki所做實(shí)驗(yàn)的結(jié)論,在沒(méi)有其他介質(zhì)干擾的情況下可以用最大吸收峰的吸光度值(Amax)來(lái)表示色素的含量[17]。

圖1 水溶性紅曲色素溶液吸收特征分析

2.2 兩種水溶性色素紫外光降解動(dòng)力學(xué)分析

由圖2a可知,紅色色素保存率與紫外照射時(shí)間負(fù)相關(guān),距離紫外光源的距離越近下降速率越快[18]。在距離紫外光源16、12、8、4 cm條件下,每隔15 min取樣一次并測(cè)其色素保存率。照射105 min后,色素保存率分別由100%下降到43.09%、34.98%、19.65%、8.90%;由圖2b可知,黃色色素保存率由100%下降到36.95%、22.17%、12.77%、6.33%。隨著紫外強(qiáng)度的增加和照射時(shí)間的延長(zhǎng),紅色素和黃色素開(kāi)始降解,顏色不斷的變淺。由于隨著紫外強(qiáng)度的增加和照射時(shí)間的延長(zhǎng)，水溶液中發(fā)生光化學(xué)反應(yīng),產(chǎn)生大量的羥基自由基(·OH)等氧化離子,導(dǎo)致色素的光氧化降解[7]。由色素的光化學(xué)反應(yīng)機(jī)理可知,色素光降解的反應(yīng)速率公式為:dA/dt=-kA0,積分后為ln(A/A0)=-kt即A(%)=e-kt[19],式中A表示色素一定時(shí)間t照射后的色素含量,A0表示初始色素含量,A(%)表示色素保存率。表1中色素保存率和紫外照射時(shí)間(t)的回歸方程可以看出,回歸系數(shù)R2都大于0.9800,因此色素光降解過(guò)程中色素保存率A(%)與時(shí)間t符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。

圖2 不同光照強(qiáng)度條件下色素保存率與照射時(shí)間的關(guān)系

表1 色素降解動(dòng)力學(xué)方程分析Table 1 Analysis of the degradation kinetics of pigments

2.3 金銀花醇提物添加量的確定

由圖3a可知,隨著金銀花醇提物濃度的增加,紅色素保存率下降速度緩慢。在相同條件下照射180 min后,不同金銀花醇提物濃度0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mg/mL色素保存率分別由100%減少到20.43%、42.80%、53.59%、55.27%、57.92%、60.72%。由圖3b可知,隨著金銀花醇提物濃度的增加,黃色色素保存率下降速度緩慢。相同條件下照射180 min后,色素保存率分別由100%下降到19.12%、34.18%、42.22%、44.25%、46.53%、51.60%?？梢钥闯鲭S著金銀花醇提物濃度的增加黃色色素保存率也不斷的增加。但從0.5 mg/mL開(kāi)始紅色素和黃色素增長(zhǎng)趨勢(shì)均變緩慢。由圖3c可知,隨著金銀花醇提物添加濃度的增加紅色素水溶液的初始濁度開(kāi)始增加,分別為2.13、11.87、15.00、17.57、21.40、22.60 NTU;由圖3d可知,隨著金銀花醇提物添加濃度的增加黃色素水溶液的初始濁度也開(kāi)始增加,分別為1.10、6.10、8.13、9.77、11.03、14.53 NTU。綜合濁度、成本以及效果考慮我們選擇金銀花醇提物濃度為0.5 mg/mL為最佳添加濃度。

圖3 金銀花醇提物添加量對(duì)色素濁度的影響

2.4 酸性環(huán)境下金銀花醇提物對(duì)色素光穩(wěn)定性的影響

我國(guó)市場(chǎng)大部分飲料呈酸性,其pH在2.5～7.5之間[20]。水溶性紅曲色素作為天然色素廣泛地被應(yīng)用到酒水、飲料當(dāng)中。溶液過(guò)酸過(guò)堿都會(huì)使色素褪色降解[21],水溶性紅曲色素在酸性飲料中的使用受到了限制[22]。由圖4a可知,相同條件下照射180 min紅色素水溶液在pH7、4條件下,空白組色素殘存率分別由100%下降到了20.43%、11.95%;添加金銀花醇提物色素殘存率分別由100%下降到了56.26%、54.72%,色素保存率分別是空白組的2.75倍、4.58倍,因此金銀花醇提物在酸性條件下有效地提高了紅色素光穩(wěn)定性。由圖b可知,相同條件下照射180 min黃色素溶液在pH7、4條件下,空白組色素保存率分別由100%下降到了19.12%、8.07%;添加金銀花醇提物色素殘存率分別由100%下降到了52.58%、47.85%,色素保存率分別是空白組的1.75、5.93倍,因此金銀花醇提物有效地提高了色素的酸穩(wěn)定性。

圖4 不同pH條件下金銀花醇提物對(duì)色素光穩(wěn)定性的影響

2.5 金銀花醇提物護(hù)色部分有效物質(zhì)的分析

研究表明金銀花中含有很多抗氧化物質(zhì),如綠原酸、槲皮素、蘆丁、木犀草素等,其中含量最多的是綠原酸[14],本文采用高效液相色譜法對(duì)其有效物質(zhì)進(jìn)行定性定量檢測(cè)。由圖5a可知,通過(guò)對(duì)綠原酸、蘆丁、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC分析,保留時(shí)間分別為7.19、20.30、34.08 min。由圖5b可知,金銀花醇提物溶液主要含有綠原酸和槲皮素不含蘆丁。由綠原酸回歸方程y=12258x-92.325,槲皮素回歸方程y=34736x-94.721計(jì)算,可得出金銀花醇提物中綠原酸和槲皮素的含量分別為108.13、25.19 mg/g。

圖5 綠原酸、蘆丁、槲皮素和金銀花醇提物的HPLC分析圖

2.6 金銀花醇提物和綠原酸的護(hù)色作用效果

通過(guò)圖6中的a、b可以看出,金銀花醇提物和綠原酸以及VC對(duì)紅色素和黃色素的光穩(wěn)定性都有較好的作用。對(duì)于紅色素在相同條件下照射180 min,對(duì)照組、0.5 mg/mL VC色素溶液、0.5 mg/mL金銀花醇提物色素溶液、0.5 mg/mL綠原酸色素溶液色素保存率分別由100%降到27.20%、55.05%、59.37%、49.44%?？梢钥闯鼋疸y花醇提物的護(hù)色效果最佳,其次是VC和綠原酸，色素保存率分別是空白對(duì)照組色素保存率的2.18、2.02、1.82倍。所以金銀花醇提物和綠原酸都具有良好的護(hù)色效果。對(duì)于黃色素相同條件下照射180 min,對(duì)照組、0.5 mg/mL VC色素溶液、0.5 mg/mL金銀花醇提物色素溶液、0.5 mg/mL綠原酸色素溶液其色素保存率分別由100%降到13.79%、48.14%、44.06%、35.34%?？梢钥闯鰧?duì)于黃色素護(hù)色效果最好的是VC,其次是金銀花醇提物和綠原酸,分別是對(duì)照組色素保存率的3.49、3.20、2.56倍。因此金銀花醇提物對(duì)水溶性紅曲色素就有很好的護(hù)色效果,通過(guò)綠原酸的護(hù)色作用可以看出,金銀花醇提物的護(hù)色作用可能與綠原酸的存在密切相關(guān)。

圖6 金銀花醇提物護(hù)色效果及有效物質(zhì)分析

3 結(jié)論

水溶性紅曲紅色素和水溶性紅曲黃色素都會(huì)發(fā)生光降解反應(yīng),且光照強(qiáng)度越強(qiáng)降解速率越快,符合一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)方程。結(jié)合添加金銀花醇提物后色素溶液的濁度(NTU),確定金銀花醇提物最優(yōu)添加量為0.5 mg/mL,紫外照射180 min紅色色素保存率可以達(dá)到56.26%(空白組20.43%);黃色色素保存率可以達(dá)到52.58%(空白組19.12%)。在pH=4的條件下,紅色素和黃色素添加金銀花醇提物的色素保存率分別是空白組的4.58、5.93倍。因此金銀花醇提物能有效提高水溶性紅曲紅色素、黃色素的保存率以及酸性條件下的光穩(wěn)定性。通過(guò)HPLC分析,金銀花醇提物中含有大量的綠原酸,紅色素以及黃色素溶液中分別添加0.5 mg/mL綠原酸,色素保存率分別是空白組的2.18、3.20倍,因此金銀花醇提物的護(hù)色作用與其所含綠原酸密切相關(guān)。金銀花醇提物作為純天然的紅曲色素護(hù)色劑,其成本低,天然無(wú)害,具有很好的應(yīng)用前景。