李思函,王 瑩,李艾黎,李 春

(東北農(nóng)業(yè)大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030)

大豆是我國主要農(nóng)作物之一,富含蛋白質(zhì)、磷脂和異黃酮等成分,被稱作“綠色牛乳”。按照牛乳干酪的制作工藝,利用豆乳替代牛乳,即可獲得一種新型豆制品—大豆干酪。與傳統(tǒng)大豆食品相比,豆酪具有含鹽量低、營養(yǎng)豐富、功能性強以及發(fā)展?jié)摿Υ蟮忍攸c,已成為新的研發(fā)熱點。如王金鳳等[1]將干酪生產(chǎn)工藝和腐乳生產(chǎn)工藝結(jié)合起來制備出色澤、香氣、質(zhì)地良好的豆酪產(chǎn)品;李瑩瑩等[2]利用葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯、氯化鎂和木瓜蛋白酶這三種凝固劑制作新鮮軟質(zhì)豆酪;李理等[3]討論分析干酪乳桿菌鼠李糖亞種和肉葡萄球菌在豆酪后熟過程中的作用,都不同程度地豐富了豆酪產(chǎn)品的種類。

益生菌是一類可以對宿主產(chǎn)生健康功效的活性微生物總稱[4],主要包含嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、乳球菌等[5]。益生菌具有平衡腸道和調(diào)節(jié)腸黏膜免疫系統(tǒng)的重要作用[6-8],常被應用于大豆發(fā)酵制品。通常益生菌食品產(chǎn)生益生特性所需的菌量最少為107CFU/g[9],但由于益生菌對生長環(huán)境的獨特要求以及菌株的特異性,使其在發(fā)酵制品中的存活率偏低。因此,如何保證益生菌從接種、加工、儲存一直到通過胃腸道被食用過程中具有有效的活菌數(shù)是研究的關(guān)鍵問題[10]。

前期研究篩選得到一株具有益生特性的嗜酸乳桿菌KLDS 1.0738,經(jīng)細胞模型和動物模型證實當其劑量高于107CFU/g時可降低淋巴細胞分泌的炎性因子,并抑制IgE介導的食物過敏[11]。鑒于益生菌在產(chǎn)品發(fā)酵和貯藏過程中菌種存活率高低決定產(chǎn)品的保健功效,本研究通過優(yōu)化復合益生素添加量、發(fā)酵劑比例和發(fā)酵條件等因素,提高菌種存活率并保持生物活性,為開發(fā)新型高活性益生菌豆酪產(chǎn)品提供新的理論依據(jù)及工藝參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜酸乳桿菌(LactobacillusacidophilusKLDS 1.0738,L.a)、嗜熱鏈球菌(StreptococcusthermophilusKLDS 3.0201,S.t) 東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學重點實驗室菌種庫;優(yōu)質(zhì)東北大豆 哈爾濱忠君超市;改良MRS及MC培養(yǎng)基 海博化工有限公司;低聚半乳糖 上海源葉有限公司;菊粉 上海麥克林生化科技有限公司;其他化學試劑均為分析純或生化純試劑。

光學顯微鏡 上海永科光學;TA.XT plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems公司;UV-2401PC分光光度計 日本島津株式會社;HYP-2008消化爐 上海昕瑞儀器公司;全自動定氮儀 上海聲陽儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化與培養(yǎng) 取甘油凍存的嗜酸乳桿菌KLDS 1.0738及嗜熱鏈球菌KLDS 3.0201分別以2%接種量接種于滅菌MRS培養(yǎng)基和MC培養(yǎng)基,37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h,傳代培養(yǎng)至三代備用。

1.2.2 大豆干酪制作流程 新鮮軟質(zhì)大豆干酪工藝流程參照鄧艷等[12]的方法略做修改如下:

優(yōu)質(zhì)大豆→浸泡→鹽漬→磨漿過濾→添加益生素→滅菌→冷卻→添加發(fā)酵劑、益生菌→預發(fā)酵→添加CaCl2→凝固發(fā)酵→凝乳切割→吊袋排乳清→壓榨→靜置成型→成熟→成品

具體制備工藝:精選優(yōu)質(zhì)大豆,豆水比1∶3浸泡8～12 h,用0.5% Na2CO3溶液鹽漬浸泡25 min后,清洗2～3次,并稱量濕豆質(zhì)量,計算吸水量。以豆水比1∶7進行磨漿后經(jīng)200目尼龍布過濾,向其中加入低聚半乳糖、菊粉益生素后滅菌,冷卻至37 ℃左右。依次加入益生菌嗜酸乳桿菌及發(fā)酵劑嗜熱鏈球菌,37 ℃下預發(fā)酵一定時間后加入0.3% CaCl2繼續(xù)凝固發(fā)酵2 h。豆酪坯凝乳后用干酪刀切割成1 cm3的立方塊,靜置排乳清15 min,將凝塊倒入鋪有四層紗布的帶孔模具中,輕微壓榨,除去已排出的乳清。將紗布包放入壓榨機中,前2 h每10 min壓緊一次,之后2 h每30 min壓緊一次,然后于4 ℃靜置成型12 h,成熟24 d后即可得益生菌軟質(zhì)豆酪。

1.2.3 優(yōu)化豆酪凝乳工藝參數(shù) 凝乳是豆酪制作過程中的關(guān)鍵步驟,影響終制品的得率和質(zhì)構(gòu)。本研究以微生物和CaCl2作為大豆蛋白凝固劑,通過前期的預實驗選取發(fā)酵劑添加量(嗜熱鏈球菌∶嗜酸乳桿菌=1∶1)、CaCl2添加量、預發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度等因素(見表1),以豆酪坯乳清OD值、總酸度和凝乳效果感官評分為指標,進行初期豆酪坯凝乳工藝正交優(yōu)化試驗。

表1 豆酪坯凝乳工藝正交試驗設計Table 1 The orthogonal test design of coagulation technology in soy cheese butter processing

1.2.3.1 乳清OD值測定 將收集到的乳清稀釋50倍后使用分光光度計在波長500 nm處測定豆乳乳清OD值。

1.2.3.2 豆酪坯總酸度測定 參照GB/T 5009.51-2003[13],采用滴定酸度法測定。準確稱取10 g樣品,加蒸餾水煮沸。冷卻后,移入100 mL容量瓶中定容,混勻,濾出濾液備用。取樣品溶液10 mL,加50 mL蒸餾水混勻,用NaOH標準溶液滴定,同時以60 mL水做空白試驗。

1.2.3.3 豆酪凝乳效果感官評定 選取15名經(jīng)過感官評價訓練的人員,具備干酪制品加工、檢驗方面的專業(yè)知識,熟悉樣品評鑒及檢測所需要的方法。對豆酪的凝乳質(zhì)地、乳清濁度、切割后的凝塊情況及凝乳風味進行綜合評價[14],具體評分標準如表2所示。

表2 凝乳效果感官評分標準Table 2 The sensory evaluation standard of coagulation property

1.2.4 優(yōu)化益生菌發(fā)酵豆酪的條件 通過對前期單因素實驗研究結(jié)果分析以及參考查閱相關(guān)文獻[15-16],總結(jié)選取嗜酸乳桿菌添加量、復合益生素(低聚半乳糖∶菊粉=1∶2)添加量、成熟溫度以及成熟時間等因素(見表3),以益生菌活菌數(shù)及感官評定為指標,進行成熟期益生菌豆酪制作的正交優(yōu)化試驗。

表3 成熟期益生菌豆酪正交試驗設計Table 3 The orthogonal test design of probiotic soy cheese during ripening

1.2.4.1 活菌數(shù)的測定 參照GB 4789.35-2016,采用平板菌落計數(shù)法測定[17]。同時,通過使用選擇性瓊脂培養(yǎng)基對益生菌豆酪成熟期間活菌數(shù)的變化進行測定,每隔6 d測定豆酪的活菌數(shù)。取豆酪樣品10 g(除去表層1 cm),用無菌研缽磨碎后,加2%(w/v)無菌檸檬酸鈉溶液(1∶10稀釋),勻漿處理2 min,用生理鹽水將樣品稀釋到適當倍數(shù)。取1 mL樣品勻液于滅菌平皿中,將冷卻至48 ℃的改良MC培養(yǎng)基和MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注入平皿各約15 mL,轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻。于36±1 ℃分別進行需氧和厭氧培養(yǎng)72±2 h后,對嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌進行計數(shù),從樣品稀釋到平板傾注要求在15 min內(nèi)完成。

1.2.4.2 豆酪感官評定 選取15名經(jīng)過感官評價訓練人員,分別從豆酪的滋氣味、組織狀態(tài)、外觀、色澤等方面對成熟后的豆酪進行感官評定[18],詳細評分標準見表4。

表4 益生菌豆酪感官評分標準Table 4 The sensory evaluation standard of probiotic soy cheese

1.2.5 益生菌豆酪成熟過程中的品質(zhì)變化

1.2.5.1 益生菌豆酪成品指標 按照上述最優(yōu)工藝組合制作益生菌豆酪后,稱取豆酪組織內(nèi)部(距離表層1 cm左右)適量樣品檢測以下相關(guān)理化指標,與不含益生菌組豆酪(空白組)以及室溫成熟的未優(yōu)化組益生菌豆酪品質(zhì)進行比較。

水分含量測定:參照GB/T 5009.3-2010[19],采用直接干燥法;灰分含量測定:參照GB/T 5009.4-2010[20],采用灼燒稱量法;蛋白質(zhì)含量測定:參照GB/T 5009.5-2010,采用凱氏定氮法[21];脂肪含量測定:參照GB 5413.3--2010,采用索氏抽提法[22];干酪產(chǎn)率測定:豆酪的產(chǎn)率以豆酪質(zhì)量與大豆質(zhì)量的百分比表示[23]。

1.2.5.2 蛋白質(zhì)水解能力 采用pH4.6可溶性氮方法測定[24],取第0、24 d豆酪樣品0.75 g,加入25 mL pH4.6的醋酸鹽緩沖液。充分研磨樣品后,使用25 mL緩沖液沖洗。將懸浮液4000 r/min離心20 min,取定量上清液于消化瓶中進行凱氏定氮實驗,pH4.6可溶性氮占總氮的百分比,即為占豆酪總氮量的百分數(shù)。

1.2.5.3 脂肪降解能力 配制50 mL乙醚乙醇混合溶液,兩者比例為2∶1,備用。準確稱取第0、24 d豆酪樣品5 g,加熱至微熱化開,加入乙醚乙醇混合液使樣品溶解后,滴入1%酚酞約10滴,采用氫氧化鉀標準溶液滴定法,粗略計算大豆干酪中游離脂肪酸的含量[25]。

1.2.5.4 益生菌豆酪質(zhì)構(gòu)指標 采用TPA方法對豆酪成熟第0、24 d進行分析,按質(zhì)構(gòu)儀預置的反向擠壓程序進行質(zhì)構(gòu)測定[26-27]。質(zhì)構(gòu)測定條件為:探頭PA/BE-d35,測試前速度1 mm/s,測試速度1 mm/s,測試后速度為10 mm/s,測試距離為10 mm,接觸力為1 g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 豆酪坯凝乳工藝的優(yōu)化

如表5所示,由乳清OD值的極差分析得出,各因素影響程度的順序為B>D>A>C,即CaCl2添加量>發(fā)酵溫度>發(fā)酵劑添加量>預發(fā)酵時間,表明CaCl2添加量對豆酪凝乳效果的影響最明顯。由于乳清OD值過高,固形物流失較多,豆乳凝乳質(zhì)地較差,得率也較低,故優(yōu)選后的工藝參數(shù)為A3B2C3D2。通過對總酸度的極差分析得出,各因素的影響順序為D>C>B>A,即發(fā)酵溫度>預發(fā)酵時間>CaCl2添加量>發(fā)酵劑添加量,發(fā)酵溫度的影響最大,優(yōu)化后的工藝參數(shù)為A2B2C3D2。綜合豆酪坯乳清OD值和總酸度指標初步確定三因素優(yōu)化后工藝參數(shù)為B2C3D2，結(jié)合感官評分指標及參考查閱文獻選取發(fā)酵劑添加量優(yōu)化后參數(shù)為A2，最終確定豆酪坯的優(yōu)化工藝條件為：A2B2C3D2,即發(fā)酵劑添加量3%、CaCl2添加量0.3%、37 ℃預發(fā)酵2 h。

表5 豆酪凝乳工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果Table 5 The results of orthogonal tests for the coagulation technology optimization of soy cheese

豆酪中添加CaCl2能夠顯著增強豆類蛋白網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、增強凝乳的硬度和強度[28]。因乳酸菌產(chǎn)酸相對較快,凝固豆乳的速度也較快[29],縮短了豆酪的發(fā)酵成熟時間,能夠產(chǎn)生較好品質(zhì)的豆酪。發(fā)酵劑的添加量對豆酪坯的品質(zhì)影響也較大,發(fā)酵劑添加量過多時,豆酪的質(zhì)地、口感以及發(fā)酵時間均無明顯提高,同時成本也會加大。研究發(fā)現(xiàn)李晴輝等[30]在新型涂抹型豆酪中添加3%嗜酸乳桿菌和乳雙歧桿菌預發(fā)酵1.5 h時,豆酪質(zhì)構(gòu)、凝乳等效果較好;李紅梅[31]接種3%嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌37 ℃發(fā)酵1 h后,豆酪的硬度適中、具有較好的彈性和咀嚼性。因此,在結(jié)合以上研究選取的本試驗最優(yōu)工藝條件下,制得的豆酪口感、質(zhì)地較好,具有良好的滋氣味。

2.2 含益生菌豆酪坯加工工藝的優(yōu)化

生產(chǎn)工藝對益生菌的存活影響較大,由表6可知,各因素對益生菌活菌數(shù)影響程度順序為A>B>D>C,即益生菌添加量>復合益生素添加量>成熟時間>成熟溫度。嗜酸乳桿菌除基本的營養(yǎng)需要外,添加低聚糖等益生素對提高菌的活力和菌數(shù)效果較好,對益生菌產(chǎn)品菌種存活保藏有一定的維持促進作用。如張茹等[32]在酸羊奶中添加低聚異麥芽糖與低聚半乳糖益生素可以促進益生菌的增殖與活性。蔡桂林等[33]發(fā)現(xiàn)添加1%的低聚異麥芽糖和菊粉可提高益生菌酸奶冰淇淋中益生菌的存活率。因此,通過預實驗選取低聚半乳糖與菊粉進行比例組合添加到益生菌豆酪中。通過對試驗結(jié)果分析得出,活菌數(shù)最優(yōu)的工藝組合為A2B1C3D3,乳清OD值最優(yōu)的工藝組合為A2B3C1D3,總酸度最優(yōu)的工藝組合為A2B1C1D1,感官評分最優(yōu)的組合為A2B2C1D2。綜合平衡各因素的影響程度，結(jié)合豆酪活菌數(shù)量及總酸度指標選取最優(yōu)工藝A2B1，乳清OD值及感官評分指標選取最優(yōu)工藝C1，綜合豆酪最終感官評分及考慮最適合菌種的溫度選取最優(yōu)工藝D2，最終確定最優(yōu)工藝參數(shù)組合為A2B1C1D2，即嗜酸乳桿菌KLDS 1.0738添加5%,復合益生素(低聚半乳糖∶菊粉=1∶2)添加4%,成熟溫度4 ℃,成熟時間為24 d時,制作的益生菌豆酪坯總酸度適宜,乳清OD值較低,嗜酸乳桿菌活菌數(shù)高于108CFU/g。

表6 益生菌豆酪坯正交試驗結(jié)果Table 6 The results of orthogonal tests for probiotics soy cheese

2.3 益生菌豆酪的指標測定

2.3.1 益生菌豆酪成熟期間菌數(shù)的變化 益生菌豆酪在成熟期間菌數(shù)變化如圖1所示。從圖1a中能看出,兩組豆酪中嗜酸乳桿菌活菌數(shù)均逐漸降低而后趨于平穩(wěn),優(yōu)化組下降趨勢較緩慢。優(yōu)化組豆酪中嗜酸乳桿菌活菌數(shù)顯著高于未優(yōu)化組活菌數(shù)(p<0.05),且最終菌數(shù)可達到2.05×108CFU/g,表明工藝優(yōu)化后的豆酪更有利于菌種的存活。同時,圖b中兩組嗜熱鏈球菌的菌數(shù)變化顯著(p<0.05),但優(yōu)化組活菌數(shù)相較于未優(yōu)化組下降緩慢,且仍有較高的菌種存活率。由于主發(fā)酵劑中的乳酸菌可與益生菌協(xié)同生長,故在豆酪制作中接入嗜酸乳桿菌KLDS 1.0738,促進了嗜熱鏈球菌KLDS 3.0201的增殖,同時基于共生作用,嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)相較于未優(yōu)化組也會有所提高(p<0.05)。新鮮豆酪在冷藏成熟過程中兩種菌的活菌數(shù)均呈逐漸降低的趨勢,但具有保健功能特性的嗜酸乳桿菌活菌數(shù)仍能達到107CFU/g以上,符合國際上功能性益生菌食品的標準[34]。研究表明,豆酪基質(zhì)更適于益生菌存活,如適宜的pH環(huán)境;較高的脂肪、固形物含量以及緩沖能力等,均有利于益生菌保持較高的生物活性[35-36]。豆酪貯存中活菌數(shù)呈下降趨勢可能由于部分在生產(chǎn)過程中隨乳清排出而造成有效添加量降低以及成熟后期可利用的營養(yǎng)物質(zhì)減少等原因造成,如Karimi等[37]發(fā)現(xiàn)由于干酪長期儲存在低溫環(huán)境中,酸度升高,營養(yǎng)物質(zhì)減少,可利用的碳水化合物大量消耗等,使得干酪活菌數(shù)有所下降。

圖1 豆酪成熟期間不同菌種活菌數(shù)變化

2.3.2 益生菌豆酪理化指標測定 益生菌豆酪成熟后理化指標、質(zhì)構(gòu)指標以及感官評分如表7～表9所示,分別測定豆酪在第0、24 d時理化及質(zhì)構(gòu)指標的變化情況。三組豆酪于4 ℃儲存24 d,pH均有所降低,總酸度則都有不同程度增加。同時,與第0 d相比,豆酪成熟24 d后可溶性氮含量和脂肪酸含量顯著升高(p<0.05)。優(yōu)化組豆酪pH4.6可溶性氮含量和脂肪酸含量相較于其余兩組均顯著升高(p<0.05),分別達到17.13%和7.65%,未優(yōu)化組豆酪含量也較空白組高(見表7)。蛋白質(zhì)、脂肪的分解程度直接關(guān)系著豆酪成熟中質(zhì)構(gòu)的變化和風味的形成,能夠有效增加豆酪的營養(yǎng)價值和風味特性。

表7 益生菌豆酪理化指標測定結(jié)果Table 7 The results of physical and chemical indexes for probiotics soy cheese

表8 益生菌豆酪質(zhì)構(gòu)指標測定結(jié)果Table 8 The results of texture indexes for probiotics soy cheese

表9 益生菌豆酪成分含量測定結(jié)果Table 9 The results of other indexes for final probiotics soy cheese

由表8豆酪TPA值可知,優(yōu)化組豆酪的膠黏性、咀嚼性、膠黏性等指標高于未優(yōu)化組和空白組,硬度、彈性及回彈性指標無明顯差異變化(p>0.05)。整體而言,優(yōu)化組豆酪在微生物的作用下,成熟24 d后較第0 d各指標均有所提高,組織結(jié)構(gòu)均勻、成型較快,質(zhì)地、口感更佳,感官評分也明顯高于其余兩組,未優(yōu)化組豆酪略高于空白組。優(yōu)化組豆酪膠黏性、粘聚性等指標較高可能由于添加的嗜酸乳桿菌能夠分泌粘附物質(zhì),具有較好的腸道定殖能力。因此,菌體代謝能力增強且分泌更多粘液物質(zhì),從而使干酪組織黏度等增加[38]。同時,楊佐毅等[39]研究表明大豆干酪在4 ℃成熟期間,氨基態(tài)氮含量呈上升的趨勢,豆酪的硬度和彈性緩慢增加,并在成熟后期達到高點。優(yōu)化組豆酪的硬度、彈性指標略高可能隨著成熟期的延長,豆酪水分流失,導致硬度升高,也可能與豆酪中蛋白質(zhì)、脂肪含量有關(guān),蛋白質(zhì)含量較高,易形成較為堅硬和致密的蛋白質(zhì)膠束,而脂肪在豆酪組織結(jié)構(gòu)中可以起到柔軟潤滑的作用[40]。

益生菌豆酪成熟24 d后成分測定如表9所示,相比其余兩組,優(yōu)化組豆酪蛋白質(zhì)含量、脂肪含量和水分含量略低,得率略高。從表9可以看出三組的成分結(jié)果無明顯差異(p>0.05),可以說明益生嗜酸乳桿菌的添加對豆酪組分影響不大,無不良效果。在豆酪中添加益生菌可以改善豆酪的感官特性,使其外觀更加細膩平滑,具有良好的咀嚼口感,滋味和氣味也更容易被接受。

3 結(jié)論

結(jié)果表明豆酪凝乳的最優(yōu)工藝參數(shù)為:發(fā)酵劑添加量3%、CaCl2添加量0.3%、37 ℃預發(fā)酵2 h,成型后的豆酪坯質(zhì)地柔軟細膩,組織狀態(tài)均勻,外形良好,表面光滑,具有獨特的豆香味。含嗜酸乳桿菌豆酪的最優(yōu)工藝參數(shù)為:嗜酸乳桿菌KLDS 1.0738添加量5%,復合益生素(低聚半乳糖∶菊粉=1∶2)添加量4%,于4 ℃成熟24 d。該條件下制得的豆酪質(zhì)地優(yōu)良,嗜酸乳桿菌在豆酪中活力較好,活菌數(shù)可達到2.05×108CFU/g,感官評價可達76.43分,對新鮮豆酪產(chǎn)品質(zhì)量基本沒有負面影響,可以用來生產(chǎn)含有較高活菌濃度的益生菌新鮮豆酪。未優(yōu)化組豆酪活菌數(shù)較低、口感一般,整體豆酪品質(zhì)低于優(yōu)化組。結(jié)合感官評定結(jié)果,工藝優(yōu)化的益生菌豆酪具有獨特的豆酪風味以及良好的質(zhì)地口感,同時具有較好的保健功效,生產(chǎn)成本較低,擁有良好的生產(chǎn)開發(fā)前景。