張英,陳莉,劉宇煒,樂凱,嚴(yán)琴,李超英

(1.江漢大學(xué),武漢 430056;2.湖北省中山醫(yī)院,武漢 430033)

牙髓痛為口腔疾患中常見的癥狀之一[1-2],可見于西醫(yī)學(xué)的齲齒、牙髓炎、根尖周圍炎和牙本質(zhì)過敏等[3-5]。中醫(yī)學(xué)稱之為“骨槽風(fēng)”“牙咬痛”“牙宣”[6-7]。針刺合谷對牙髓痛具有良好的鎮(zhèn)痛作用[8-10],但其作用機(jī)理尚不明確。P2X受體作為配體門控型離子通道,在體內(nèi)組織、部位均有表達(dá),當(dāng)前已克隆出P2X1-77種亞型[11], P2X1-6亞型大多在初級感覺神經(jīng)元表達(dá),如結(jié)狀神經(jīng)節(jié)、背根神經(jīng)節(jié)及三叉神經(jīng)節(jié)。近年來已有研究證實(shí)P2X受體中 P2X4受體與神經(jīng)病理痛相關(guān)[12],在疼痛信息的傳遞過程中起重要作用[13-15]。電針合谷治療牙髓痛的作用與P2X4受體的關(guān)系還不明確。本實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌內(nèi)毒素(LPS)誘導(dǎo)的牙髓痛大鼠為研究對象,利用RT-PCR檢測三叉神經(jīng)節(jié)和牙髓中P2X4受體mRNA的表達(dá)量,以探索電針合谷治療牙髓痛的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

牙體、牙列完整,無齲壞、牙齒畸形及牙周病,咬合正常的健康成年雄性SD大鼠42只,由武漢大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供,許可證號為 SCXK(鄂)2008-0004,體質(zhì)量180～250 g,隨機(jī)分為正常組(N組)、對照組(C組)、牙髓痛組(M組)、拮抗劑組(A組)、電針組(E組)、拮抗劑+電針組(AE組),每組7只。

1.2 主要藥品與儀器

微量移液器(德國Eppendorf公司),Realtime PCR儀(ABI公司),冷凍離心機(jī)(Sigma公司),大腸桿菌內(nèi)毒素(上海禾豐制藥,生產(chǎn)批號 120801),A-317491(美國Sigma公司),Trizol(Invitrogen公司),氯仿、異丙醇、無水乙醇(滬試公司),PrimeScriptTM RT reagent Kit、SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ(TAKARA 公司),β-actin引物(上海生工公司),P2X4引物(上海生工公司)。

1.3 動物造模及治療方法

N組不做任何處理;C組在鉆好的牙髓腔內(nèi)注入與M組等量的生理鹽水,浸潤5～6 min后用牙科填料將牙洞封閉;M組用小型電鉆或手鉆(鉆頭直徑約 1 mm)在上頜一側(cè)第一和第二磨牙上鉆孔,深入牙髓腔并暴露牙髓,用微量注射器注入濃度為 5 μg/μL的大腸桿菌內(nèi)毒素(LPS)溶液(每孔注入約 1～3 μL),浸潤 5～6 min后用牙科填料將牙洞封閉[16];A組同M組造模后,在注射器注入LPS溶液時,將A-317491(0.5 mg/kg)同時注射進(jìn)牙髓;E組針刺雙側(cè)合谷[17]穴,接電針治療儀,選連續(xù)波,頻率2 Hz,強(qiáng)度為1 mA,留針30 min,每日1次,共治療3次;AE組同M組造模后,在注射器注入LPS溶液時,將 A-317491(0.5 mg/kg)同時注射進(jìn)牙髓,針刺雙側(cè)合谷穴,接電針治療儀,選連續(xù)波,頻率2 Hz,強(qiáng)度為1 mA,留針30 min,每日1次,共治療3次。

1.4 樣本采集

大鼠腹腔注射 10%水合氯醛麻醉后斷頸處死,立即取出三叉神經(jīng)節(jié)、牙髓。

1.5 行為學(xué)分析

觀察每組大鼠開始治療第一天至最后一天的體質(zhì)量變化及外觀變化,觀察每組大鼠造模后半小時行為學(xué)變化,包括大鼠甩頭、嘶叫和舔足動作[18-20]。具體行為學(xué)觀測方法：每天將各組大鼠經(jīng)造模后,放入 Face Crooming觀測儀內(nèi),待其適應(yīng)環(huán)境5 min后,通過儀器底部的攝像機(jī)進(jìn)行實(shí)時拍攝,并分別記錄每只大鼠在30 min內(nèi)甩頭、嘶叫和舔足動作次數(shù)。

1.6 實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(ReaI-time poIymerase chain reaction, RT-PCR)檢測三叉神經(jīng)節(jié)、牙髓中P2X4受體基因(messenger RibonucIeic Acid, mRNA)表達(dá)

1.6.1 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

用 Trizol RNA提取試劑盒提取三叉神經(jīng)節(jié)總RNA。將 4 μL 5×RT Buffer、2 μL dNTP、1 μL Oliga(dT)18、1 μL RNase Inhibitor、1 μL ReverTra Ace和1 μg RNA,加RNase free H2O調(diào)至20 μL。42℃ 20 min,將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,95℃ 5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶后-20℃保存。

1.6.2 實(shí)時熒光定量檢測P2X4的mRNA

采用SYBR Green熒光染料法針對P2X4的mRNA進(jìn)行實(shí)時RT-PCR檢測,吸取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物10 μL引物上下游各 2 μL,加緩沖液 10 μL、ddH2O 4 μL及 SYBR Green熒光染料1 μL,放入熒光定量PCR儀,50℃持續(xù)2 min,接著95℃持續(xù)10 min,然后95℃持續(xù)15 s,退火1 min后,95℃持續(xù)15 s,然后60℃持續(xù)15 s,最后95℃持續(xù) 15 s,如上進(jìn)行 45個循環(huán),經(jīng) 4℃延伸10 min。設(shè)置陰性對照和β-actin內(nèi)參照。對P2X4受體CT值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,得到各組P2X4受體mRNA相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用 SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way-ANOVA),繼以 LSD檢驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)及體質(zhì)量變化情況

正常大鼠皮毛光潤,行動自如,體質(zhì)量穩(wěn)定增長。LPS造模后大鼠皮毛萎縮無光澤,行動遲緩,并有體質(zhì)量增加不明顯等現(xiàn)象。觀察造模后30 min大鼠的行為變化可以發(fā)現(xiàn),造模大鼠甩頭、嘶叫和舔足次數(shù)明顯增多,各組大鼠行為學(xué)及體質(zhì)量變化情況見表1和表2。

由表1可以看出,M組、A組、E組、AE組行為學(xué)變化均顯著高于C組和N組(P＜0.01);A組、E組、AE組行為學(xué)變化均顯著低于M組(P＜0.01)。

由表 2可以看出,C組體質(zhì)量顯著低于 N組(P＜0.01);M組、A組、E組、AE組體質(zhì)量均顯著低于 C組和N組(P＜0.01);E組、AE組體質(zhì)量均顯著高于M組(P＜0.01);A組體質(zhì)量稍高于M組(P＜0.05);AE組體質(zhì)量顯著高于A組和E組(P＜0.01);E組體質(zhì)量稍高于A組(P＜0.05)。

表1 各組大鼠行為學(xué)變化 (±s,次)

表1 各組大鼠行為學(xué)變化 (±s,次)

注：與 N組比較1)P＜0.01;與 C組比較2)P＜0.01;與 M組比較3)P＜0.01

組別 n 甩頭次數(shù)和 嘶叫次數(shù)和 舔足次數(shù)和N 組 7 5.6±1.15 1.8±1.30 7.0±1.58 C 組 7 5.8±1.30 2.2±0.45 7.2±1.10 M 組 7 14.0±1.581)2) 7.4±1.141)2) 17.4±1.521)2)A 組 7 12.0±1.481)2)3) 5.2±0.841)2)3) 13.0±1.581)2)3)E 組 7 11.2±1.301)2)3) 5.6±0.891)2)3) 13.4±1.141)2)3)AE 組 7 10.4±1.141)2)3) 5.0±1.001)2)3) 12.0±1.581)2)3)

表2 各組大鼠體質(zhì)量變化 (±s,g)

表2 各組大鼠體質(zhì)量變化 (±s,g)

注：與 N組比較1)P＜0.01;與 C組比較2)P＜0.01;與 M組比較3)P＜0.01,4)P＜0.05;與A組比較5)P＜0.01,6)P＜0.05;與E組比較7)P＜0.01

組別 n 體質(zhì)量差值N組 7 15.43±2.55 C組 7 13.45±2.691)M組 7 4.61±3.701)2)A組 7 6.50±2.321)2)4)E組 7 7.39±2.751)2)3)6)AE組 7 8.81±3.741)2)3)5)7)

2.2 電針合谷對大鼠三叉神經(jīng)節(jié)和牙髓中 P2X4受體mRNA表達(dá)量的影響

由表3可以看出,C組三叉神經(jīng)節(jié)P2X4受體mRNA表達(dá)量稍高于 N組(P＞0.05);M組、A組、E組、AE組 P2X4受體 mRNA表達(dá)量明顯高于 N組(P＜0.01);M組、E組、AE組P2X4受體mRNA表達(dá)量高于C組(P＜0.05);A組 P2X4受體 mRNA表達(dá)量高于 C組(P＜0.01);E組、AE組大鼠P2X4受體mRNA表達(dá)量低于M組(P＜0.01)。

由表4可以看出,C組牙髓P2X4受體mRNA表達(dá)量稍低于N組(P＞0.05);M組、A組、E組、AE組P2X4受體mRNA表達(dá)量明顯高于N組(P＜0.01);M組、A組、E組、AE組P2X4受體mRNA表達(dá)量高于C組(P＜0.01);E組、AE組大鼠 P2X4受體 mRNA表達(dá)量低于 M組(P＜0.01)。

表3 各組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)P2X4受體mRNA相對表達(dá)量比較(±s)

表3 各組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)P2X4受體mRNA相對表達(dá)量比較(±s)

注：與N組比較1)P＜0.01;與C組比較2)P＜0.01,3)P＜0.05;與M組比較4)P＜0.01

組別 n P2X4受體mRNA相對表達(dá)量N組 7 0.269±0.036 C組 7 0.308±0.046 M組 7 0.353±0.0271)3)A組 7 0.387±0.0291)2)E組 7 0.347±0.0311)3)4)AE組 7 0.332±0.0311)3)4)

表4 各組大鼠牙髓P2X4受體mRNA相對表達(dá)量比較(±s)

表4 各組大鼠牙髓P2X4受體mRNA相對表達(dá)量比較(±s)

注：與N組比較1)P＜0.01;與C組比較2)P＜0.01;與M組比較3)P＜0.01

組別 n P2X4受體mRNA相對表達(dá)量N組 7 1.065±0.043 C組 7 1.023±0.079 M組 7 1.768±0.0471)2)A組 7 1.888±0.1311)2)E組 7 1.693±0.0811)2)3)AE組 7 1.728±0.3201)2)3)

3 討論

牙髓痛由牙髓的神經(jīng)末梢傳導(dǎo)至外周感受器三叉神經(jīng)節(jié)的感受神經(jīng)元,經(jīng)收集后傳入下一級神經(jīng)元,最后到中樞相應(yīng)部位,由大腦皮層作出痛反應(yīng)[21-23]。牙髓內(nèi)僅存在傷害感受器/疼痛感受器,當(dāng)牙髓受到刺激時,唯一的感覺就是痛[18]。動物不能用言語表達(dá)其疼痛狀態(tài),創(chuàng)建病理性疼痛模型還需利用行為學(xué)觀察進(jìn)行分析,目前運(yùn)用較多是采用不同的行為學(xué)方法評價牙髓痛模型[18-20],如甩頭、嘶叫和舔足等。LPS誘導(dǎo)的炎性牙髓痛大鼠痛反應(yīng)明顯增強(qiáng),牙髓痛組與正常大鼠相比,牙髓痛組大鼠食量減少、體質(zhì)量增長緩慢、皮毛光澤度降低,且出現(xiàn)甩頭、嘶叫和舔足等疼痛表現(xiàn)增多,提示LPS誘導(dǎo)大鼠牙髓痛模型的可行。

P2X受體作為非選擇性配體門控型離子通道可與細(xì)胞外ATP結(jié)合,允許Na+、K+、Ca2+離子通過[24],誘發(fā)動作電位沿神經(jīng)軸突向中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo),從而產(chǎn)生痛覺[25],在機(jī)體痛覺的構(gòu)成、傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)中起重要作用[26-27]。P2X4受體在小膠質(zhì)細(xì)胞及外周巨噬細(xì)胞均有表達(dá),參與感覺神經(jīng)元興奮及痛覺產(chǎn)生[28-29]。實(shí)驗(yàn)顯示髓痛組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)、牙髓中 P2X4受體 mRNA表達(dá)量均顯著高于對照組、正常組。由此可推斷P2X4受體參與牙髓痛的信號傳導(dǎo)。

P2X受體亞型P2X3受體在神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮重要作用[30-32],A-317491是P2X3受體特異性拮抗劑,可有效抑制P2X3受體的表達(dá)[33]。而前期的研究發(fā)現(xiàn)P2X3受體高表達(dá)于牙髓痛模型,A-317491作為拮抗劑可有效抑制 P2X3受體高表達(dá),從而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)[34]。本次實(shí)驗(yàn)顯示拮抗劑組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)和牙髓中 P2X4受體 mRNA表達(dá)量與牙髓痛組無明顯統(tǒng)計學(xué)差異,說明A-317491作為P2X3受體的特異性拮抗劑,對P2X4受體并無明顯抑制作用。

合谷是手陽明大腸經(jīng)的原穴,出自《靈樞·本輸》,善治頭面、五官疾患,是針灸臨床治療牙痛的效穴。實(shí)驗(yàn)顯示,電針組、拮抗劑+電針組兩組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)、牙髓中P2X4受體mRNA表達(dá)量明顯低于牙髓痛組,提示電針合谷可抑制 P2X4受體的表達(dá),從而抑制牙髓痛傷害信息的傳導(dǎo)。于此同時,電針組、拮抗劑+電針組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)、牙髓中 P2X4受體 mRNA表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差異,說明在電針合谷有效抑制P2X4受體,與拮抗劑的參與與否并無明顯影響,由此推斷電針合谷不但能協(xié)同拮抗劑 A-317491抑制 P2X3受體表達(dá)產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng),而且某種程度上更優(yōu)于拮抗劑A-317491能進(jìn)一步抑制P2X4受體表達(dá),從而達(dá)到鎮(zhèn)痛作用。

本研究結(jié)果提示P2X4受體參與了實(shí)驗(yàn)性牙髓痛的產(chǎn)生與傳導(dǎo),電針對牙髓痛的鎮(zhèn)痛作用與 P2X4受體參與密切相關(guān),這可能是電針合谷鎮(zhèn)痛的機(jī)制之一,電針合谷如何調(diào)節(jié) P2X4受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)還有待進(jìn)一步研究。