楊玲,黃艷,黃任佳,馬曉芃,馬喆,劉雅楠,鄭寒丹,朱毅,劉慧榮,王照欽,吳璐一

(1.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海 200030;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 200437;3.上海中醫(yī)藥大學(xué)針灸免疫效應(yīng)重點(diǎn)研究室,上海 200030)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種病因未明的慢性非特異性腸道炎性疾病,好發(fā)于年輕人,病程慢性遷延且易反復(fù)發(fā)作,臨床治愈率低并有癌變的可能,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。UC屬于現(xiàn)代難治病,發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,主要與遺傳易感性、腸黏膜屏障缺陷、免疫反應(yīng)失調(diào)、環(huán)境因素等有關(guān)[1]。

Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)是最早被發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors, PRRs),是連接天然免疫和特異性免疫的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體家族,其最突出的生物學(xué)功能是促進(jìn)細(xì)胞因子的合成與釋放,引發(fā)炎癥反應(yīng)[2]。TLR4是TLRs家族中研究最為廣泛的一種,活化的TLR4可激活MyD88依賴(lài)性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,TLR4通過(guò)招募主要接頭蛋白MAL(TIRAP)和MyD88,激活I(lǐng)KKα、IKKβ等一系列蛋白磷酸化激酶,導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB激活并入核而啟動(dòng)炎癥因子基因表達(dá)[3-4]。對(duì)MyD88基因敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn),MyD88基因敲除小鼠對(duì)LPS仍有反應(yīng)性,仍能激活NF-κB的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),表明TLR4介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中除了MyD88依賴(lài)性途徑外,還存在MyD88非依賴(lài)途徑[5]。β干擾素 TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TRIF)是和MyD88同樣具有 TIR結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的接頭蛋白,在 TLR4介導(dǎo)的MyD88非依賴(lài)途徑中起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)UC患者結(jié)腸黏膜中TLR4表達(dá)顯著升高,且與UC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[6-9]。以TLR4為靶點(diǎn),尋找UC的特異性療法,可能是UC防治的一個(gè)切入點(diǎn)。

艾灸具有抗炎、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的作用,在UC的臨床應(yīng)用中具有一定的優(yōu)勢(shì)[10-11]?！鞍念A(yù)處理”屬于中醫(yī)治未病的范疇,應(yīng)用于 UC的防治,可拓展艾灸的臨床應(yīng)用范圍。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),艾灸預(yù)處理能夠調(diào)節(jié) UC大鼠腸黏膜屏障相關(guān)蛋白,降低炎癥反應(yīng),改善UC大鼠結(jié)腸的病理狀態(tài),達(dá)到預(yù)防UC的目的[12]?；谇捌谘芯炕A(chǔ),本研究擬從TLR4介導(dǎo)的MyD88非依賴(lài)途徑——TLR4/TRIF信號(hào)通路角度,探討艾灸預(yù)處理“天樞”穴防治UC的免疫機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

清潔級(jí) Sprague Dawley(SD)大鼠 28只,體質(zhì)量(180±20)g,委托上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心訂購(gòu),并提供適宜的飼養(yǎng)環(huán)境：12 h晝夜節(jié)律交替、室溫(20±2)℃,室內(nèi)濕度 50%～70%,所有實(shí)驗(yàn)操作均在上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)指導(dǎo)下進(jìn)行。

1.2 主要藥物和試劑

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方法,分成正常組、模型組、隔藥灸預(yù)處理組和溫和灸預(yù)處理組,每組7只。

1.4 干預(yù)方法

本實(shí)驗(yàn)共分為兩個(gè)階段干預(yù),第一階段為預(yù)處理階段,第二階段為模型制備階段。

艾灸預(yù)處理(第 1～7天)：隔藥灸預(yù)處理組,行隔藥灸干預(yù);溫和灸預(yù)處理組,行溫和灸干預(yù);正常組、模型組不予干預(yù),只做與隔藥灸預(yù)處理組相同的抓取與固定。隔藥灸預(yù)處理干預(yù)方法：將藥餅(直徑1 cm、厚度0.5 cm)置于大鼠天樞穴區(qū),上置艾炷(重量為90 mg)施灸,每日1次,每次每穴灸2壯,連續(xù)灸7 d;溫和灸預(yù)處理方法：采用大鼠實(shí)驗(yàn)專(zhuān)用艾條(直徑 7 mm、長(zhǎng)120 mm,重 2 g)距離天樞穴 2 cm處施灸,間隔 2 min刮取艾灰1次,每日1次,每次每穴灸10 min,連續(xù)灸7 d。

模型制備(第8～14天)：隔藥灸預(yù)處理組、溫和灸預(yù)處理組、模型組,均予 4%DSS水溶液連續(xù)飲用制備UC模型[13];正常組不予處理。

1.5 標(biāo)本的采集和處理

大鼠予腹腔注射2%的戊巴比妥鈉(30～40 mg/kg)麻醉處理后,暴露大鼠腹腔,分離結(jié)腸,自恥骨聯(lián)合處—盲腸取下整段結(jié)腸,沿腸系膜縱行剖開(kāi),予生理鹽水輕柔漂洗后肉眼觀察結(jié)腸大體形態(tài),自下而上截取結(jié)腸6～8 cm,分成兩部分,一部分固定于4%多聚甲醛固定液中,用于形態(tài)學(xué)觀察;剩余部分置于液氮1 h后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察

結(jié)腸組織切片采用HE染色后,于光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化。主要步驟包括切片常規(guī)脫蠟至水,二甲苯Ⅰ、Ⅱ各 20 min;100%、95%、90%、80%、70%乙醇各5 min;雙蒸水5 min×2次;蘇木素浸染2～3 min;流水沖洗10 min;1%鹽酸乙醇分化1～2 s;流水沖洗5 min;伊紅浸染2～3 min;70%、80%、90%、100%乙醇各1～2 s;二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15 min;封片,置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

綜上所述,肝局灶性結(jié)節(jié)增生是發(fā)病率較低的一類(lèi)良性占位病變,該疾病不是真正的腫瘤疾病,發(fā)病原因還不清楚,女性患者發(fā)病率比男性高。臨床中對(duì)肝局灶性結(jié)節(jié)性增生患者使用CT平掃和增強(qiáng)掃描的效果比較好,能夠很好的觀察分析患者的病理特征和供血情況,對(duì)患者的血管腫瘤鑒別效果比較理想,有些特殊影像特征會(huì)對(duì)診斷帶來(lái)一些影響,臨床中應(yīng)該要引起重視。

1.6.2 TLR4、IRF3、TRAF6蛋白表達(dá)的檢測(cè)

采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)法檢測(cè)。取大鼠結(jié)腸組織石蠟切片,依次經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)、封閉等流程后滴加一抗：TLR4(濃度 1：50);IRF3(濃度 1：100);TRAF6(濃度 1：200),4℃冰箱過(guò)夜后滴加二抗孵育,完成PBS沖洗、DAB顯色、蘇木素染色、脫水等流程后封片。在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇3～5個(gè)視野進(jìn)行圖像信息的采集,采用Image-Plus Pro 6.0軟件對(duì)采集的圖像進(jìn)行分析,計(jì)算出每張切片的平均光密度值(AOD),AOD=積分光密度(IOD)/陽(yáng)性目標(biāo)陽(yáng)性面積(Area)。

1.6.3 TRIF、IKK蛋白表達(dá)的檢測(cè)

采用免疫印跡檢測(cè)法檢測(cè)。取大鼠結(jié)腸組織經(jīng)研磨、RIPA裂解、離心取上清等流程后,采用BCA蛋白定量法測(cè)定各樣本蛋白濃度,調(diào)整各樣本濃度一致、變性后,經(jīng)電泳,轉(zhuǎn)膜后加入封閉液(5%脫脂奶粉)室溫封閉 1 h,加入一抗：TRIF(濃度為 1：1000);IKK(濃度為1：2000),4℃孵育過(guò)夜,洗膜后分別加入對(duì)應(yīng)的二抗,室溫孵育1 h,于暗室中用X膠片感光、顯影、定影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差分析法;不符合正態(tài)性分布者以中位數(shù)(四分位數(shù))[Median(P25, P75)]表示,組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)法。所有檢驗(yàn)采用雙側(cè)檢驗(yàn),以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察結(jié)果

正常組可見(jiàn)結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)清晰,上皮組織完整,腺體排列整齊,杯狀細(xì)胞清晰可見(jiàn),無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),未見(jiàn)充血、水腫;模型組可見(jiàn)結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)不清,上皮脫落,腺體破壞,杯狀細(xì)胞基本消失,黏膜及黏膜下層可見(jiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),伴有充血、水腫;隔藥灸預(yù)處理組、溫和灸預(yù)處理組結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)亦有不同程度的破壞,上皮均較為完整,腺體部分破壞,杯狀細(xì)胞部分消失,黏膜及黏膜下層可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),伴有輕度充血、水腫(圖1)。

圖1 大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.2 各組大鼠結(jié)腸組織TLR4免疫組化檢測(cè)結(jié)果

TLR4蛋白主要表達(dá)在黏膜層、黏膜下層及固有層的胞質(zhì)及胞膜中,為彌漫性棕黃色顆粒。正常組 TLR4蛋白表達(dá)較弱;模型組TLR4蛋白大量表達(dá)于黏膜層、黏膜下層及固有層的胞質(zhì)及胞膜中,且染色深,分布密集;隔藥灸預(yù)處理組、溫和灸預(yù)處理組大鼠結(jié)腸組織TLR4蛋白在黏膜層、黏膜下層及固有層的胞質(zhì)及胞膜亦有不同程度的陽(yáng)性表達(dá)(圖2)。定量結(jié)果表明,與正常組比較,模型組大鼠結(jié)腸組織TLR4蛋白表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與模型組比較,隔藥灸預(yù)處理組、溫和灸預(yù)處理組大鼠結(jié)腸組織TLR4蛋白表達(dá)均顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與隔藥灸預(yù)處理組比較,溫和灸預(yù)處理組大鼠結(jié)腸組織TLR4蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(表1)。

表1 各組大鼠結(jié)腸組織TLR4蛋白表達(dá) (±s)

表1 各組大鼠結(jié)腸組織TLR4蛋白表達(dá) (±s)

注：與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

組別 n 平均光密度(AOD)正常組 7 0.217±0.015模型組 7 0.294±0.0301)隔藥灸預(yù)處理組 7 0.239±0.0182)溫和灸預(yù)處理組 7 0.254±0.0142)

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織TLR4免疫組化檢測(cè)結(jié)果

2.3 各組大鼠結(jié)腸組織TRIF免疫印跡檢測(cè)結(jié)果

表2 各組大鼠結(jié)腸組織TRIF蛋白表達(dá) (±s)

注：與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

組別 n 蛋白表達(dá)量(Fold change)正常組 7 0.418±0.451模型組 7 1.287±0.8631)隔藥灸預(yù)處理組 7 0.529±0.5222)溫和灸預(yù)處理組 7 0.522±0.2372)

與正常組比較,模型組大鼠結(jié)腸組織TRIF蛋白表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與模型組比較,隔藥灸預(yù)處理組、溫和灸預(yù)處理組大鼠結(jié)腸組織TRIF蛋白表達(dá)均顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與隔藥灸預(yù)處理組比較,溫和灸預(yù)處理組大鼠結(jié)腸組織TRIF蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(表2,圖 3)。

圖3 各組大鼠結(jié)腸組織TRIF免疫印跡檢測(cè)結(jié)果

2.4 各組大鼠結(jié)腸組織TRAF6免疫組化檢測(cè)結(jié)果

TRAF6蛋白主要表達(dá)在黏膜層胞質(zhì)及胞膜中,為棕黃色顆粒。正常組僅有少量TRAF6蛋白表達(dá)在黏膜層胞質(zhì)及胞膜中;模型組 TRAF6蛋白大量表達(dá)于黏膜層胞質(zhì)及胞膜中,部分呈胞核表達(dá),且染色深,分布密集;隔藥灸預(yù)處理組、溫和灸預(yù)處理組大鼠結(jié)腸組織TRAF6蛋白大量表達(dá)在黏膜層胞質(zhì)及胞膜中有不同程度的陽(yáng)性表達(dá),亦可見(jiàn)少量胞核表達(dá)(圖4)。定量結(jié)果表明,與正常組比較,模型組大鼠結(jié)腸組織TRAF6蛋白表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與模型組比較,隔藥灸預(yù)處理組、溫和灸預(yù)處理組大鼠結(jié)腸組織 TRAF6的表達(dá)均顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),與隔藥灸預(yù)處理組比較,溫和灸預(yù)處理組大鼠結(jié)腸組織 TRAF6蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(表 3)。

表3 各組大鼠結(jié)腸組織TRAF6蛋白表達(dá) (±s)

表3 各組大鼠結(jié)腸組織TRAF6蛋白表達(dá) (±s)

注：與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

組別 n 平均光密度(AOD)正常組 7 0.223±0.018模型組 7 0.368±0.0491)隔藥灸預(yù)處理組 7 0.281±0.0302)溫和灸預(yù)處理組 7 0.274±0.0202)

圖4 各組大鼠結(jié)腸組織TRAF6免疫組化檢測(cè)結(jié)果

2.5 各組大鼠結(jié)腸組織IRF3免疫組化檢測(cè)結(jié)果

IRF3蛋白主要表達(dá)在黏膜層的胞漿及胞膜中,為棕黃色顆粒。正常組IRF3蛋白均勻表達(dá)在黏膜層胞漿及胞膜中,未見(jiàn)胞核表達(dá);模型組 IRF3蛋白部分表達(dá)于黏膜層胞漿及胞膜中,部分呈胞核表達(dá),且染色深,分布密集;隔藥灸預(yù)處理組、溫和灸預(yù)處理組結(jié)腸組織IRF3蛋白在黏膜層胞質(zhì)及胞膜中均有不同程度的表達(dá),亦可見(jiàn)少量胞核表達(dá)(圖 5)。定量結(jié)果表明,與正常組比較,模型組大鼠結(jié)腸組織IRF3蛋白表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與模型組比較,隔藥灸預(yù)處理組、溫和灸預(yù)處理組大鼠結(jié)腸組織IRF3的表達(dá)均顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與隔藥灸預(yù)處理組比較,溫和灸預(yù)處理組大鼠結(jié)腸組織IRF3蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(表4)。

表4 各組大鼠結(jié)腸組織IRF3表達(dá) (±s)

表4 各組大鼠結(jié)腸組織IRF3表達(dá) (±s)

注：與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

組別 n 平均光密度(AOD)正常組 7 0.236±0.024模型組 7 0.319±0.0231)隔藥灸預(yù)處理組 7 0.283±0.0242)溫和灸預(yù)處理組 7 0.290±0.0252)

圖5 各組大鼠結(jié)腸組織IRF3免疫組化檢測(cè)結(jié)果

2.6 各組大鼠結(jié)腸組織IKK免疫印跡檢測(cè)結(jié)果

與正常組比較,模型組大鼠結(jié)腸組織 IKK蛋白表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較,隔藥灸預(yù)處理組大鼠結(jié)腸組織 IKK蛋白表達(dá)顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);溫和灸預(yù)處理組大鼠結(jié)腸組織 IKK蛋白表達(dá)雖降低,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(表5,圖6)。

表5 各組大鼠結(jié)腸組織IKK蛋白表達(dá)[Median(P25,P75)]

圖6 各組大鼠結(jié)腸組織IKK免疫印跡檢測(cè)結(jié)果

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎屬于臨床難治病,西醫(yī)治療主要采用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素等藥物,但此類(lèi)藥物臨床療效不理想且反復(fù)使用后會(huì)打亂機(jī)體正常的免疫機(jī)制。作為中醫(yī)藥特色療法中的一種,艾灸療法經(jīng)過(guò)數(shù)千年的更迭,仍生生不息。隔藥灸療法屬于艾灸療法的一種,通過(guò)艾火的溫?zé)嶂圆f(xié)同藥物功效來(lái)共同發(fā)揮治療作用[14-15];溫和灸療法因具有治療安全、有效、無(wú)毒副反應(yīng)、經(jīng)濟(jì)、易操作、患者依從性高等多種優(yōu)點(diǎn),臨床應(yīng)用也較為廣泛[16-17]。兩種艾灸療法均是在經(jīng)絡(luò)理論的指導(dǎo)下應(yīng)用于臨床治療疾病，通過(guò)刺激腧穴局部,促進(jìn)腧穴局部氣血的恢復(fù),并通過(guò)經(jīng)絡(luò)的作用調(diào)節(jié)全身,溫養(yǎng)臟腑,達(dá)到溫經(jīng)散寒、活血通絡(luò)、調(diào)和陰陽(yáng)的作用。天樞穴作為大腸之募穴,能疏調(diào)腸腑、理氣行滯,善治腸腑疾病。古代天樞穴常應(yīng)用于泄瀉、痢疾、腹痛、便秘的治療,善于健脾和胃、理氣散寒補(bǔ)虛;現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),天樞穴用于治療消化系統(tǒng)相關(guān)性疾病的比例最高,是治療UC最常用的腧穴之一[18-20]。

艾灸治療 UC的療效顯著,在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡,改善腸道黏膜病變,控制腸道炎癥中起重要作用[21-23]。艾灸治療UC的機(jī)制研究結(jié)果提示,艾灸可糾正結(jié)腸黏膜的病理性改變,重建人體免疫系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的平衡及穩(wěn)定性,調(diào)整黏蛋白比例,有效地糾正結(jié)腸黏膜病變,控制 UC腸道炎癥[24-26]。艾灸預(yù)處理即“逆灸”,它以中醫(yī)學(xué)“治未病”思想為主要理論基礎(chǔ),通過(guò)艾灸穴位激發(fā)經(jīng)絡(luò)之氣,提高機(jī)體抗病能力,從而達(dá)到防止疾病的發(fā)生、減輕后續(xù)疾病的損害和保健延年的目的[27-29]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中,“針灸良性預(yù)應(yīng)激假說(shuō)”較好地闡釋了艾灸預(yù)處理的作用機(jī)制,認(rèn)為艾灸預(yù)處理的作用機(jī)制可能與現(xiàn)代應(yīng)激學(xué)說(shuō)密切相關(guān)[30]。

研究表明 TLRs最突出的生物學(xué)功能是促進(jìn)細(xì)胞因子的合成與釋放,引發(fā)炎癥反應(yīng)。TLR4是TLRs家族中研究最為廣泛的一種,與UC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。TLR4C端包含一個(gè) Toll/IL-1受體(Toll/IL-1receptor, TIR)結(jié)構(gòu)域,TIR與IL-1受體家族成員具有較高的同源性,主要用來(lái)激活下游信號(hào)通路,在免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)和炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。TRIF是和MyD88同樣具有TIR結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的接頭蛋白,因此,本研究聚焦TLR4介導(dǎo)的MyD88非依賴(lài)途徑開(kāi)展研究,即從TLR4/TRIF通路探討艾灸預(yù)處理干預(yù)UC的免疫機(jī)制。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)UC模型組大鼠TLR4蛋白明顯升高,病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示模型組大鼠黏膜層有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),潰瘍,炎癥反應(yīng)明顯,與既往研究結(jié)果一致;而隔藥灸預(yù)處理組和溫和灸預(yù)處理組大鼠 TLR4蛋白明顯降低,病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和潰瘍面積較模型組明顯減少,表明艾灸預(yù)處理參與調(diào)控TLR4蛋白的表達(dá),且與UC炎癥反應(yīng)相關(guān)。TRIF在TLR4介導(dǎo)的MyD88非依賴(lài)途徑中具有關(guān)鍵作用,其N(xiāo)末端結(jié)合結(jié)構(gòu)域可與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子 6(TNF receptorassociated factor 6, TRAF6)結(jié)合,激活I(lǐng)KK復(fù)合體,活化IκB,導(dǎo)致NF-κB入核引起炎癥反應(yīng)[31-33]。本研究通過(guò)對(duì)TLR4/TRIF通路中TRAF6和IKK蛋白的觀察發(fā)現(xiàn),隔藥灸預(yù)處理組可以降低這兩種蛋白的表達(dá),溫和灸預(yù)處理組能降低TRAF6蛋白表達(dá)。以上結(jié)果提示艾灸預(yù)處理可能通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4/TRIF通路中相關(guān)蛋白的表達(dá),降低UC的炎癥反應(yīng)。

IRF3是調(diào)節(jié)Ⅰ型IFN表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)Ⅰ型 IFN的分泌,在機(jī)體抵御外來(lái)微生物入侵的固有免疫中發(fā)揮重要作用。研究表明,當(dāng)細(xì)胞受到炎癥刺激后,IRF3可被激活并發(fā)生核轉(zhuǎn)位,在核內(nèi) IRF3通過(guò)誘導(dǎo)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[34]。IRF3參與了TLR4介導(dǎo)TRIF依賴(lài)的Ⅰ型IFN的分泌,TRIF通過(guò)招募TRAF3,調(diào)節(jié)IRF-3的活化和核轉(zhuǎn)位,誘導(dǎo) IFN-β的表達(dá),引起炎癥反應(yīng)[35]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠IRF3蛋白表達(dá)明顯增加,且部分呈核表達(dá),而隔藥灸預(yù)處理組和溫和灸預(yù)處理組大鼠結(jié)腸IRF3蛋白的表達(dá)量較模型組均明顯減少,且僅有少量核表達(dá),提示艾灸預(yù)處理可能通過(guò)調(diào)節(jié) IRF-3的活化和核轉(zhuǎn)位,預(yù)防了UC的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。

綜上所述,本研究觀察了艾灸預(yù)處理天樞穴干預(yù)UC大鼠結(jié)腸TLR4/TRIF通路的變化,結(jié)果表明艾灸預(yù)處理可調(diào)節(jié)結(jié)腸 TLR4/TRIF通路中相關(guān)蛋白的表達(dá),減輕UC的炎癥反應(yīng),研究結(jié)果可為UC的防治提供一定的研究依據(jù)。