田 玥,王 墨,李 巖,沙麗麗,吳咚咚,侯志濤,徐文源,邵 霜

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 1500040；3.黑龍江省中醫(yī)研究院，黑龍江 哈爾濱 150036)

血管性癡呆(Vascular dementia，VD)是指由缺血性、出血性腦卒中和相應(yīng)腦區(qū)低灌注損害記憶、認(rèn)知與行為所致的嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙綜合征[1],其臨床表現(xiàn)為執(zhí)行功能受損顯著，如制訂目標(biāo)、計(jì)劃性、主動(dòng)性、組織性和抽象思維以及沖突的能力下降；常有近記憶力和計(jì)算力的減低。常伴焦慮、抑郁或欣快等異常精神癥狀。嚴(yán)重影響病人的工作和生活，并給患者家屬和社會(huì)造成了很大的負(fù)擔(dān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合中醫(yī)學(xué)優(yōu)勢(shì)，采用通督醒神針?lè)ㄡ槾讨委熝苄园V呆。針刺可加強(qiáng)經(jīng)脈之間的聯(lián)系，激發(fā)經(jīng)氣、疏通經(jīng)氣脈絡(luò)、調(diào)整臟腑氣血功能。本研究采用國(guó)際通認(rèn)的大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法建立VD損傷模型[2]，從整體水平研究通督醒神針?lè)筕D的有效性，并從細(xì)胞、分子水平等層面探討通督醒神針?lè)ㄖ委烿D損傷的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供更為堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，為通督醒神針?lè)▽?duì)血管性癡呆模型大鼠海馬神經(jīng)再生的影響提供新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心供應(yīng)，動(dòng)物合格編號(hào)：SCXK(黑)2008-004。

1.2 主要儀器與試劑

安迪牌針灸針(0.25 mm×25 mm,貴州安迪藥械有限公司)；JJ3000型精密電子天平(常熟雙杰測(cè)試儀器廠)；Morris水迷宮(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所)；奧林巴斯BX51顯微鏡(奧林巴斯BS-51顯微鏡)；德國(guó)菜卡2135型切片機(jī)(美國(guó)moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng));上海一恒電熱恒溫箱;醫(yī)用微波爐;兔抗BDNF多克隆抗體(北京博奧森)；DAB顯色劑(北京中山)；國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 主要藥品

水合氯醛(天津華津制藥)；鹽酸多奈哌齊片[安理申,衛(wèi)材(中國(guó))藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20160978]。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及模型制作

將SD大鼠60只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法建立VD損傷模型。用水迷宮檢測(cè)法篩選成模大鼠納入實(shí)驗(yàn)。將造模成功大鼠36只，隨機(jī)分為模型組、藥物組、空白組、針刺1天組、針刺3天組、針刺7天組，每組6只。

2.2 干預(yù)方法

藥物組按體重1 mg/(kg·d)鹽酸多奈哌齊溶于2 mL生理鹽水中灌胃，以后每日早晨灌胃，連續(xù)給藥14天。

針刺1天組用通督醒神針?lè)ㄈ“贂?huì)、神庭、人中針刺(參照林文注等編著的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》選穴)針刺方向?yàn)樾贝蹋疃?.2～0.3 mm，針后捻轉(zhuǎn)，200～220 r/min，捻轉(zhuǎn)1 min，留針30 min，每日1次，連續(xù)治療1天。針刺3天組治法同上，連續(xù)治療3天。針刺7天組治法同上，連續(xù)治療7天。

空白組和模型組大鼠不針刺，但捕捉和束縛同針刺組。

2.3 觀察指標(biāo)與檢測(cè)

2.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)本采集 藥物組、針刺1天組、針刺3天組、針刺7天組分別治療結(jié)束后，大鼠灌注取腦，用10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉，斷頭取腦，沿枕骨下剪斷鼠頭，剪開(kāi)鼠枕骨，用止血鉗撬開(kāi)鼠頭骨，充分暴露腦組織，操作謹(jǐn)慎，勿傷及腦組織，后用止血鉗經(jīng)過(guò)顱底分離腦組織。分別用4%多聚甲醛溶液固定。

2.3.2 檢測(cè)指標(biāo) 大鼠行為學(xué)觀察：在大鼠造模前、造模后、藥物治療后、針刺治療相應(yīng)時(shí)間后，均運(yùn)用Morris水迷宮觀察各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)分為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn):①定位航行實(shí)驗(yàn)：將大鼠面向池壁放入水中,放入位置隨機(jī)取第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限的起始位置之一，平臺(tái)位置為第Ⅰ象限,記錄大鼠120 s內(nèi)從入水到爬上平臺(tái)所需時(shí)間,超過(guò)120 s記為120 s，即逃避潛伏期;②空間探索實(shí)驗(yàn)：大鼠學(xué)會(huì)尋找平臺(tái)后撤除水下平臺(tái)，開(kāi)始90 s的探索訓(xùn)練。將大鼠由原平臺(tái)的對(duì)側(cè)，即第Ⅲ象限固定位置面向池壁放入水中，記錄大鼠在90 s內(nèi)穿越原平臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù)。

大鼠經(jīng)灌注取腦后，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，組織修塊后，采用免疫組化PV二步法檢測(cè)海馬組織CA1區(qū)腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、酪氨酸蛋白激酶受體B(TrkB)表達(dá)，PV二步法免疫組化，顯微鏡下觀察。

2.3.3 顯微鏡觀察 Motic3000顯微攝影系統(tǒng)于400倍下攝片，采用Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)行分析，以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目代表蛋白表達(dá)量，每組隨機(jī)分析6個(gè)高倍鏡視野。染色結(jié)果細(xì)胞核呈藍(lán)色，蛋白表達(dá)位于神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)中，陽(yáng)性表達(dá)為棕褐色。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 各組Morris水迷宮測(cè)定結(jié)果

各組Morris水迷宮測(cè)定結(jié)果：與空白組比較，模型組大鼠測(cè)定有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型組大鼠潛伏時(shí)間增長(zhǎng)，穿越次數(shù)減少；與模型組比較，藥物組、針刺組大鼠測(cè)定有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，藥物組、針刺組大鼠潛伏時(shí)間縮短，穿越次數(shù)增加；與藥物組比較，針刺組大鼠測(cè)定有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，針刺組大鼠潛伏時(shí)間縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增加。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠平臺(tái)逃避潛伏期和穿越次數(shù)測(cè)定

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與藥物組比較，#P<0.05。

3.2 各組大鼠海馬組織CA1區(qū)BDNF表達(dá)結(jié)果比較

大鼠BDNF表達(dá)結(jié)果：與空白組相比，模型組具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，模型組大鼠海馬組織CA1區(qū)BDNF具有神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用；與模型組比較，藥物組、針刺組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，藥物組、針刺組大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元受BDNF促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用；與藥物組比較，針刺組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠海馬組織CA1區(qū)BDNF表達(dá)結(jié)果比較

注：與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05；與藥物組比較，▲P>0.05。

3.3 各組大鼠海馬組織CA1區(qū)TrkB表達(dá)結(jié)果比較

大鼠TrkB表達(dá)結(jié)果：與空白組相比，模型組具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，模型組大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元存活；與模型組比，藥物組、針刺組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，藥物組、針刺組大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)再生通路被激活；與藥物組比，針刺組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠海馬組織CA1區(qū)TrkB表達(dá)結(jié)果比較

注：與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05；與藥物組比較，▲P>0.05。

3.4 各組大鼠海馬組織CA1區(qū)免疫組化檢測(cè)結(jié)果

由圖1可見(jiàn)，各組大鼠海馬組織CA1區(qū)內(nèi)均可見(jiàn)BDNF蛋白表達(dá)，與空白組相比，模型組大鼠BDNF蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)；與模型組對(duì)比，針刺組、藥物組大鼠BDNF蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)；與藥物組比較，針刺組的BDNF蛋白表達(dá)水平未見(jiàn)明顯上調(diào)。

圖1 各組大鼠海馬組織中BDNF蛋白表達(dá)(400×)

4 討論

血管性癡呆(VD)是腦血管病導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的重要臨床類型[3]。缺血導(dǎo)致腦部血流中止，引起腦能量缺失和離子動(dòng)態(tài)平衡的紊亂，啟動(dòng)腦內(nèi)大規(guī)模的級(jí)聯(lián)損傷反應(yīng)[4]，其病理機(jī)制復(fù)雜[5]，目前國(guó)際通認(rèn)的主要機(jī)制有能量代謝障礙、興奮性氨基酸毒性、炎癥介質(zhì)、細(xì)胞凋亡、氧自由基堆積等；在VD腦組織中，氧和葡萄糖代謝障礙、Ca2+大量?jī)?nèi)流等原因，是導(dǎo)致組織細(xì)胞死亡的根本原因。腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)，對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)和其他中樞和外周神經(jīng)是一個(gè)有效的生長(zhǎng)因子,主要分布于腦，在心、肺和脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的外周靶組織中也有一定分布。BDNF主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)合成,對(duì)促進(jìn)神經(jīng)元的存活至關(guān)重要。腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子BDNF可以作為信號(hào)傳導(dǎo)通路的配體與其受體酪氨酸蛋白激酶(TrkB)特異性結(jié)合，結(jié)合后可激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路參與促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)育、分化、再生[6]。BDNF最初是從豬腦中純化出來(lái)的堿性蛋白，生理狀態(tài)下以二聚體形式存在。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)新生小鼠的BDNF能夠阻止受損傷誘導(dǎo)的面部神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡。同時(shí)還改善組織學(xué)變化，促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)[7]。

BDNF促進(jìn)受損神經(jīng)元的再生及分化，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)中具有重要的作用。BDNF是通過(guò)與其特異性受體TrkB結(jié)合而實(shí)現(xiàn)對(duì)缺血區(qū)域神經(jīng)再生、損傷修復(fù)等效應(yīng)。研究表明，腦缺血后BDNF/TrkB水平增高能夠提高神經(jīng)元的抗損傷能力[8]。另有學(xué)者認(rèn)為，針刺可促進(jìn)上調(diào)腦缺血損傷大鼠的BDNF表達(dá)水平保護(hù)和修復(fù)受損神經(jīng)元[9]。另有研究表明，頭穴叢刺法可能通過(guò)上調(diào)缺血區(qū)腦組織中的BDNF蛋白表達(dá)水平，從而起到對(duì)腦組織神經(jīng)保護(hù)作用[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，針刺和鹽酸多奈哌齊片(安理申)治療均可以提高血管性癡呆模型大鼠海馬組織內(nèi)BDNF與TrkB蛋白的表達(dá)水平，通督醒神針?lè)苊黠@改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[11]。通督醒神針?lè)ㄍㄟ^(guò)針刺督脈神庭、百會(huì)、人中穴，刺激腦部，影響缺血海馬組織神經(jīng)元，使其缺血CA1區(qū)BDNF與TrkB蛋白表達(dá)水平提高。相關(guān)研究表明,BNDF基因能有效抑制細(xì)胞凋亡，與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，激活非增殖細(xì)胞，延長(zhǎng)細(xì)胞存活時(shí)間。因此這可能是針刺抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞再生的主要因素。綜上，血管性癡呆模型大鼠海馬內(nèi)細(xì)胞凋亡明顯增加,海馬細(xì)胞凋亡可能是血管性癡呆的病理生理機(jī)制之一,針刺干預(yù)時(shí)海馬組織BDNF與TrkB蛋白的表達(dá)水平增高，可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生，具有防治血管性癡呆的能力。