邵淑君，鄔繼紅△，唐銀杉，高譽(yù)珊，張淑靜，向杜煉

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州 310009)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是最常見的神經(jīng)性皮質(zhì)癡呆，是造成老年人癡呆的最常見原因。AD患者多伴有學(xué)習(xí)記憶障礙，且易受情緒波動(dòng)的影響，嚴(yán)重者晚期生活不能自理，極大程度上威脅老年人的生活品質(zhì)[1]。相關(guān)研究表明，近年來(lái)發(fā)達(dá)國(guó)家的癡呆發(fā)病率逐年趨于穩(wěn)定[2]，但發(fā)展中國(guó)家的癡呆發(fā)病率仍然呈現(xiàn)逐年上漲的趨勢(shì)[3]，給社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展造成了極大的負(fù)擔(dān)和壓力。

老年斑(Senile plaque，SP)又稱神經(jīng)炎性斑塊，是AD病理診斷的重要標(biāo)志物分子。β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)是老年斑的主要成分，Aβ具有神經(jīng)毒性，當(dāng)其含量升高時(shí)，誘導(dǎo)淀粉樣斑塊和神經(jīng)元損傷的形成[4]，加速細(xì)胞凋亡。淀粉樣前體蛋白β-分泌酶1(β-amyloid cleaving enzyme，BACE1)是一種啟動(dòng)Aβ產(chǎn)生的跨膜型天冬氨酰蛋白酶，通過(guò)異常切割淀粉樣蛋白前體蛋白(Amyloid precursor protein，APP)，使Aβ在腦內(nèi)的沉積增加或清除減少[5-6]。

本次實(shí)驗(yàn)以7月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠為模型，觀察電針“百會(huì)”“印堂”“人中”穴對(duì)皮層細(xì)胞形態(tài)的影響，并檢測(cè)皮層APP、BACE1的表達(dá)情況，以探求電針治療AD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

購(gòu)入7月齡雄性SPF級(jí)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠30只，體質(zhì)量(30±2)g。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為模型組、電針組和藥物組，每組10只。相同遺傳背景的C57BL/6小鼠10只作為正常對(duì)照組。以上實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由北京華阜康生物科技股份有限公司提供[許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004]。于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)單籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性的喂養(yǎng)1周，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.2 主要儀器與試劑

生物組織自動(dòng)包埋機(jī)(浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠，貨號(hào)：YD-6L);自動(dòng)化智能型正置研究級(jí)顯微鏡(中國(guó)Olympus公司，貨號(hào)：BX53);穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司,貨號(hào)：PowerPacTM1645050);垂直電泳槽(美國(guó)Bio-Rad公司,貨號(hào)：Mini-PROTEAN Tetra System 1658999);化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Azure Biosystems公司，貨號(hào)：C600);常溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司，貨號(hào)：5702);臺(tái)式恒溫振蕩器(江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠，貨號(hào)：THZ-D);酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司，貨號(hào)：MK3);HANS-LH202型韓氏電針儀(南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司);無(wú)菌針灸針(規(guī)格為0.25 mm×13 mm,北京中研太和醫(yī)療器械有限公司)；病理級(jí)載玻片(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司，貨號(hào)：10127105P);SP600125(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)：420119);多聚賴氨酸(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司,貨號(hào)：GLU-0040);PBS磷酸鹽緩沖液(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司,粉劑，貨號(hào)：PBS-0060);枸櫞酸鹽緩沖液(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司,粉劑，貨號(hào)：MVS-0066);ECL發(fā)光液(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào)：PE0010);Tris-甘氨酸電泳緩沖液(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào)：T1070);電泳轉(zhuǎn)移緩沖液(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào)：D1060-500);TBST緩沖液(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào)：T1081-500);鼠抗單克隆APP抗體(美國(guó)Millipore公司,貨號(hào)：MAB348);PVDF膜(美國(guó)Millipore公司,貨號(hào)：C3117);兔抗單克隆BACE1抗體(美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab183612);β-actin一抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：TA09);抗兔二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,貨號(hào)：bs-40295G)；抗小鼠二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,貨號(hào)：bs40296G);一抗稀釋液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：P0023A)。

1.3 干預(yù)措施

鼠套制作：材料：紙板、灰色紗網(wǎng)、透明膠帶、訂書機(jī)。將紙板裁剪成小鼠大小(7 cm×9 cm)，紙板頂部按照小鼠頭型剪成弧形，用透明膠帶將紙板纏繞包裹兩圈，防止針刺時(shí)鼠尿浸濕紙板。將黑色紗網(wǎng)雙層覆蓋在紙板上，用訂書機(jī)沿紙板邊緣訂在紙板上，紗網(wǎng)的活動(dòng)度以兩手指可伸入至頂部為最佳。束縛時(shí)，使小鼠鉆入鼠套，僅尾部暴露在紙板外，迅速用活動(dòng)夾固定住紙板邊緣，防止小鼠在鼠套內(nèi)翻轉(zhuǎn)。見圖1。

圖1 自制鼠套

電針組：選取“百會(huì)”“印堂”“人中”(參照“十一五”《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》第2版)，用自制鼠套進(jìn)行束縛，將穴位和針具進(jìn)行常規(guī)消毒，使用無(wú)菌針灸針進(jìn)行針刺干預(yù)，“百會(huì)”“印堂”皆向下平刺進(jìn)針，兩針互不觸碰，進(jìn)針深度為0.2～0.3 cm，針柄接電針治療儀，電針輸出頻率設(shè)置為1 Hz，電流強(qiáng)度為1 mA，每次干預(yù)20 min后快速點(diǎn)刺“人中”，隔天針刺干預(yù)1次，共15次。

藥物組：每次束縛前30 min進(jìn)行腹腔注射SP600125溶液，由2%DMSO溶液配制而成，按30 mg/kg進(jìn)行腹腔注射，在電針組治療時(shí)，采用同等強(qiáng)度的束縛干預(yù)，20 min/天，隔天1次，共15次。

對(duì)照組：在其他治療組治療的同時(shí)，抓取1次，并用相同規(guī)格的鼠套進(jìn)行束縛干預(yù)，20 min/天，隔天1次，共15次。

模型組：同正常對(duì)照組。

1.4 腦組織取材

電針干預(yù)結(jié)束后，水合氯醛20 g/0.1 mL腹腔麻醉小鼠，進(jìn)行取材。隨機(jī)的從每組選取3只小鼠，打開胸腔，充分暴露小鼠心臟，將灌注針頭經(jīng)左心室插入升主動(dòng)脈，同時(shí)剪開右心耳，快速滴注100 mL生理鹽水，至小鼠肝臟完全變白以及右心耳流出澄清的液體后，再快速灌注4%多聚甲醛，至小鼠的肢體和尾巴僵硬后，立刻斷頭取出全腦，迅速將腦放入固定液(4%多聚甲醛)中，6 h后將皮層組織進(jìn)行石蠟包埋，用于HE染色，切片厚度為5 μm。每組剩下的7只小鼠直接提取皮層蛋白置于EP管中，迅速凍存于-80℃環(huán)境，待WB檢測(cè)用。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 HE染色觀察小鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)變化 二甲苯脫蠟，3×15 min；100%乙醇(Ⅰ)5 min，100%乙醇(Ⅱ)5 min，95%乙醇5 min，90%乙醇5 min，80%乙醇5 min,70%乙醇5 min；蒸餾水洗3×3 min；蘇木素染色3 min；1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒；自來(lái)水沖洗1 min；伊紅復(fù)染30 s；自來(lái)水沖洗2×5 min；90%、95%、100%乙醇梯度脫水；二甲苯干燥2×15 min；中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的變化，并拍照。

1.5.2 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)皮層APP、BACE1蛋白含量 每組其余7只小鼠取新鮮皮層組織，稱重，迅速放入1.5 mL離心管，加入100 mg/mL裂解液(10%上清)，冰上研磨。冰上放置20 min，每隔5 min用旋渦儀震蕩混勻。然后行4℃離心10 min，10 000 rpm，吸取上清。BCA法測(cè)定組織蛋白含量，制備蛋白樣品。配置10%SDS-PAGE凝膠，每孔加樣10 μL，初始電壓為80 V，20 min，待溴酚藍(lán)燃料進(jìn)入分離膠上緣后提高電壓至100 V，60 min。濕轉(zhuǎn)80 V，90 min至PVDF膜；轉(zhuǎn)膜后以5%TBST脫脂奶粉封閉，室溫震蕩60 min。封閉結(jié)束后，加入一抗APP抗體(以1∶2 000一抗稀釋液稀釋)，一抗BACE1抗體(以1∶2 000一抗稀釋液稀釋)室溫孵育過(guò)夜。TBST洗膜，3×10 min。TBST0.5%脫脂奶粉孵育二抗(以1∶2000TBST稀釋)60 min，TBST洗膜，3×10 min。將PVDF入ECL(1∶1混)超敏發(fā)光液中曝光，觀察條帶，以β-actin作為蛋白內(nèi)參。采用Image-J software分析掃描后目的條帶的灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠皮層細(xì)胞形態(tài)HE染色結(jié)果

對(duì)照組皮層神經(jīng)細(xì)胞染色清楚且均勻，細(xì)胞排列整齊，神經(jīng)元數(shù)量多，細(xì)胞核呈圓形，核仁清晰；模型組皮層神經(jīng)細(xì)胞排列散亂，整個(gè)細(xì)胞染色不均勻，多數(shù)細(xì)胞胞核固縮，核仁不清晰；與模型組比較，電針組神經(jīng)細(xì)胞排列較為規(guī)則整齊，核固縮現(xiàn)象明顯改善，藥物組核固縮現(xiàn)象略為改善，說(shuō)明電針能有效緩解神經(jīng)細(xì)胞損傷和核固縮現(xiàn)象。見圖2。

圖2 各組小鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)(HE染色，200×)

2.2 各組小鼠皮層APP、BACE1蛋白western blot的表達(dá)結(jié)果比較

與對(duì)照組比較，模型組皮層APP、BACE1蛋白表達(dá)水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；與模型組比較，電針組APP、BACE1蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；與模型組比較，藥物組APP蛋白表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，BACE1表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示電針和藥物SP600125均能降低APP/PS1癡呆小鼠皮層APP、BACE1蛋白水平，但電針效果優(yōu)于SP600125。見圖3。

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05。圖3 各組小鼠皮層APP、BACE1蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為阿爾茨海默病屬于“癡呆”“善忘”范疇，由髓海失養(yǎng)、痰邪瘀阻引起的神志疾病，其病在腦，以表情淡漠、沉默少言，甚者終日不語(yǔ)、行為失常為主要臨床表現(xiàn)?！侗静菥V目·辛夷·發(fā)明》云：“腦為元神之府”。《甲乙經(jīng)·卷二》曰：“督脈者，起于下極之俞，并于脊里，上至風(fēng)府，入屬于腦，上巔循額至鼻柱，陽(yáng)脈之海也”。因此督脈的主干與分支均與腦聯(lián)系密切，故素有“病變?cè)谀X，首取督脈”之說(shuō)?！巴ǘ絾⑸瘛狈ㄈ　鞍贂?huì)”“印堂”“人中”3穴，發(fā)揮通經(jīng)活絡(luò)、醒神開竅之功[7]，延緩記憶衰老過(guò)程。為此本次研究采用“通督啟神”電針，并采用自制鼠套固定小鼠，可以減少小鼠在電針治療時(shí)產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)，降低應(yīng)激反應(yīng)對(duì)蛋白表達(dá)的影響，以便觀察電針干預(yù)對(duì)癡呆小鼠的治療作用。

APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模擬AD的病理過(guò)程，是一種廣泛用于AD研究的可靠動(dòng)物模型。研究表明，該動(dòng)物模型會(huì)損害淀粉樣蛋白加工過(guò)程，導(dǎo)致Aβ1-42沉積增加[8]，加速溶酶體蛋白水解和軸突缺陷，腦區(qū)功能連接減少[9]。APP/PS1小鼠在癡呆后期，主要病理表現(xiàn)為腦萎縮[10]、腦葡萄糖代謝減少以及明顯的空間記憶學(xué)習(xí)障礙[11]。以往報(bào)道指出，5月齡雙轉(zhuǎn)基因小鼠Morris水迷宮逃避潛伏期與對(duì)照組無(wú)明顯差異，7～8月齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦區(qū)開始出現(xiàn)廣泛的Aβ病理表現(xiàn)、神經(jīng)纖維營(yíng)養(yǎng)不良、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞損傷以及學(xué)習(xí)記憶行為障礙[12-14]，提示7月齡APP/PS1癡呆小鼠模型空間學(xué)習(xí)記憶受損，適用于本次實(shí)驗(yàn)研究。

Aβ級(jí)聯(lián)學(xué)是當(dāng)今比較公認(rèn)的阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制學(xué)說(shuō)，此學(xué)說(shuō)認(rèn)為Aβ的神經(jīng)毒性和沉積是AD發(fā)病的重要事件。當(dāng)Aβ含量升高時(shí)，并不能被細(xì)胞完全代謝掉，反而會(huì)在細(xì)胞中大量沉積，導(dǎo)致Aβ老年斑形成，促使神經(jīng)原纖維纏結(jié)或神經(jīng)元死亡的病理過(guò)程。Aβ可能通過(guò)影響參與細(xì)胞內(nèi)吞過(guò)程的蛋白分子的正常功能，從而導(dǎo)致突觸囊泡循環(huán)和神經(jīng)遞質(zhì)釋放的異常，引發(fā)記憶力減退及認(rèn)知功能障礙等癥狀。實(shí)驗(yàn)研究表明，APP/PS1癡呆小鼠皮層Aβ清除能力減弱，不能被內(nèi)皮細(xì)胞向外周轉(zhuǎn)移或被周細(xì)胞吞噬，Aβ表達(dá)增加，小鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知能力下降[15-17]。APP加工及代謝的關(guān)鍵酶包括α、β、γ-分泌酶。在AD的發(fā)病過(guò)程中，α-分泌酶途徑受到抑制，β-分泌酶成為APP主導(dǎo)代謝途徑，β-分泌酶通過(guò)異常切割A(yù)PP，產(chǎn)生可溶性APP-β片段和膜結(jié)合型的C-99片段，后經(jīng)γ-分泌酶作用于C-99片段以產(chǎn)生Aβ的C端。研究發(fā)現(xiàn)在AD患者腦中β-分泌酶的表達(dá)顯著增加[18-19]，并明顯加速AD相關(guān)病理表現(xiàn)。BACE1又稱Ⅰ型跨膜天冬氨酸蛋白酶，是β-分泌酶在腦內(nèi)的主要表現(xiàn)形式，通過(guò)異常切割A(yù)PP，主要產(chǎn)生3種氨基酸大小的Aβ，而其中Aβ1-42氨基酸片段較長(zhǎng)，較其他形式的Aβ具有更高的自聚性，其神經(jīng)毒性也更高[20]。BACE1主要在神經(jīng)元軸突中運(yùn)輸，并積累在AD中淀粉樣蛋白沉積附近的營(yíng)養(yǎng)不良性神經(jīng)突起[21]。研究表明，敲除BACE1基因小鼠的β-分泌酶活性喪失，其組織形態(tài)、腦組織化學(xué)、神經(jīng)肌肉效應(yīng)與野生型同窩小鼠并無(wú)明顯差異[22]，為BACE1作為AD治療靶點(diǎn)提供了依據(jù)。

相關(guān)研究表明，SP600125可以通過(guò)特異性的抑制JNK信號(hào)通路，降低APP/PS1癡呆小鼠大腦皮層p-APP(Thr668)的含量，降低APP/PS1小鼠皮層組織中BACE1的表達(dá)，促進(jìn)APP非淀粉蛋白樣途徑并抑制其淀粉蛋白途徑代謝過(guò)程，使可溶性APP-β片段減少，從而抑制腦內(nèi)Aβ1-42的表達(dá)，減少Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡反應(yīng)，可有效改善癡呆等退行性疾病的學(xué)習(xí)記憶障礙[23-24]。本次研究通過(guò)對(duì)比觀察SP600125和電針干預(yù)的作用，檢測(cè)其靶點(diǎn)蛋白BACE1 和APP 的表達(dá)含量，進(jìn)一步佐證督脈電針對(duì)AD的治療作用。

本實(shí)驗(yàn)HE染色顯示，電針組和藥物組核固縮現(xiàn)象較模型組改善，但電針組細(xì)胞排列較為整齊，提示電針和藥物均可減少神經(jīng)細(xì)胞損傷現(xiàn)象，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的再生和重新排列，但電針治療效果優(yōu)于阻斷劑SP600125。Western blot結(jié)果顯示，與模型組比較，電針組和藥物組APP、BACE1的表達(dá)均減少，而藥物組APP表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示督脈電針和藥物均可有效減少APP、BACE1蛋白表達(dá)，但電針的有效性明顯優(yōu)于SP600125。電針抗癡呆的作用機(jī)制復(fù)雜多樣，可能通過(guò)減少BACE1的表達(dá)、下調(diào)APP的異常切割、抑制Aβ的過(guò)度生成以起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。另有相關(guān)研究提出，BACE1不僅通過(guò)異常切割A(yù)PP使Aβ沉積增加，同時(shí)通過(guò)參與其他引發(fā)記憶力減退的細(xì)胞過(guò)程來(lái)抑制小鼠記憶形成，即使在Aβ神經(jīng)毒性不存在的情況下[25]，此還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。