曹 華，馮美果，侯 帥，滕金艷

(1.咸寧市中心醫(yī)院，湖北 咸寧 437100；2.湖北省中醫(yī)院，湖北 武漢 430061)

圍絕經(jīng)期(perimenopausal period)是指女性從絕經(jīng)過(guò)渡期至絕經(jīng)后1年，出現(xiàn)與絕經(jīng)相關(guān)的潮熱汗出、情緒改變、記憶力減退、睡眠障礙等臨床特征的期間[1]。其中，失眠是圍絕經(jīng)期女性尋求治療的核心癥狀之一[2]。研究顯示，中醫(yī)學(xué)防治失眠具有良好的療效，尤其是利用中醫(yī)外治療法之一的針灸治療圍絕經(jīng)期失眠(Menopause Insomnia，MI)更是近年來(lái)關(guān)注的焦點(diǎn)之一。其配穴及方法多樣，在臨床上發(fā)揮著較大的優(yōu)勢(shì)[3-5]。因此，深度挖掘中醫(yī)理論防治MI，提高針灸對(duì)MI的療效，對(duì)于闡明針灸治療圍絕經(jīng)期失眠的作用機(jī)理有著重要的價(jià)值。本研究選擇電針三陰交治療MI，觀察電針三陰交對(duì)MI模型大鼠睡眠時(shí)相及海馬區(qū)5-HT、5-HIAA、5-HT1A受體水平和5-HIAA/5-HT比值的影響，探討電針治療圍絕經(jīng)期失眠可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

選取12月齡清潔級(jí)(CL)Sprague Dawley(SD)雌性大鼠36只，體質(zhì)量(300±20)g，由長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0011，飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房，溫度保持在(24±3)℃，濕度40%～60%左右。普通飼料正常飼養(yǎng)，自由攝食飲水，光照12 h/12 h明暗交替。

1.2 主要儀器和試劑

“華佗牌”針灸針(蘇州醫(yī)療用品有限公司，0.35 mm×25 mm)；G6805型電針治療儀(上海醫(yī)用電子儀器廠)；16道生理記錄儀(美國(guó)Biopac公司)；大鼠腦立體定位儀(美國(guó)Stoelting 公司產(chǎn)品)；生理電刺激儀(上海艾研生物科技有限公司)；Elisa 試劑盒(R&D Systems，Inc，批號(hào): 20180501A)

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組方法及卵巢摘除

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和電針組，每組12只。模型組和電針組依照文獻(xiàn)方法[6]摘除雙側(cè)卵巢，消毒后，縫合皮膚。假手術(shù)組術(shù)式相同，但只切除卵巢周圍與卵巢等重的脂肪組織，不摘除卵巢。各組術(shù)后恢復(fù)15天，自術(shù)后恢復(fù)3天起，大鼠逐只檢查陰道涂片，連續(xù)5天，以不出現(xiàn)角化細(xì)胞為卵巢摘除成功。

2.2 腦電肌電電極埋置術(shù)

待卵巢摘除手術(shù)恢復(fù)后，各組大鼠用40 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，固定于腦立體定位儀上依照文獻(xiàn)方法[7]進(jìn)行大鼠腦內(nèi)微電極植入手術(shù)，并于術(shù)后恢復(fù)15天。

2.3 成模標(biāo)準(zhǔn)

待電極手術(shù)恢復(fù)后，將模型組和電針組大鼠放置于失眠刺激器中，通過(guò)底部電柵間歇性電刺激大鼠足底部8 h。同時(shí)記錄大鼠腦電圖和肌電圖(8:00—16:00間進(jìn)行連續(xù)記錄8 h)。刺激參數(shù):頻率1 Hz，波寬15 ms，電流0.5 mA，每隔30 min刺激30 s。其中快速眼球運(yùn)動(dòng)睡眠(Rapid eyes movement sleep，REMS)、漫波睡眠淺睡期(Slow wave sleep，SWS1)和慢波睡眠深睡期(Slow wave sleep，SWS2) 均減少，表明模型復(fù)制成功。

2.4 干預(yù)方法

電針組造模完成第1天開始電針三陰交穴治療，1次/天，連續(xù)14天，取穴定位參照李忠仁主編《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》，三陰交位于后肢內(nèi)踝尖直上10 mm。選用0.35 mm×25 mm毫針，直刺4～5 mm，電針治療儀施以密波，頻率為50 r/s，刺激強(qiáng)度以大鼠針刺穴位局部肌肉可見輕微抽搐、大鼠保持安靜為度，治療20 min。于末次治療30 min后，將大鼠置于失眠刺激器內(nèi)，記錄在電刺激的8 h內(nèi)腦電圖和肌電圖(8:00—16:00間進(jìn)行連續(xù)記錄8 h) 。

2.5 觀察指標(biāo)

分別觀察各組大鼠腦電圖變化情況，主要項(xiàng)目為睡眠時(shí)相中SWS1、SWS2和REMS等各期時(shí)長(zhǎng)。待各組腦電實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將實(shí)驗(yàn)大鼠斷頭取腦，在冰浴上分離大鼠海馬區(qū)，在分析天平中精密稱重后，加入9倍量的生理鹽水在冰浴中勻漿，將勻漿液在離心機(jī)上離心，3 000 r/min，離心10 min，分離上層血清，置于低溫冰箱中保存。嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫試劑盒說(shuō)明書采用雙抗體夾心法測(cè)定各組海馬區(qū)5-HT、5-HIAA、5-HT1A受體的水平，并計(jì)算5-HIAA/5-HT比值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠睡眠各時(shí)相持續(xù)時(shí)間的變化比較

表1 各組大鼠睡眠各時(shí)相持續(xù)時(shí)間的變化比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

由表1結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組 SWS1、SWS2和REMS均明顯縮短(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，電針組可延長(zhǎng)電刺激圍絕經(jīng)期大鼠的REMS、SWS1時(shí)間(P<0.05或P<0.01)，SWS2有延長(zhǎng)的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) 。

3.2 各組大鼠海馬區(qū)5-HT、5-HIAA、5-HT1A受體水平和5-HIAA/5-HT比值比較

由表2可知，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬區(qū)5-HT、5-HIAA、5-HT1A受體水平明顯降低(P<0.05)，5-HIAA/5-HT比值明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，電針組大鼠海馬區(qū)5-HT、5-HT1A受體水平顯著升高(P<0.05)，5-HIAA/5-HT比值明顯降低(P<0.05)，5-HIAA雖然有升高的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

組別n5-HT(ng/mL)5-HIAA(pg/mL)5-HIAA/5-HT5-HT1A(ng/mL)假手術(shù)組1273.47±24.7910.83±0.790.17±0.0814.13±0.99模型組1212.39±4.52?6.53±1.24?0.58±0.20?9.15±1.01?電針組1220.12±5.44#8.12±1.440.39±0.16#13.12±1.44#

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

4 討論

圍絕經(jīng)期是女性由中年到老年的過(guò)度時(shí)期，通常會(huì)伴隨潮熱、心悸、食欲下降、睡眠障礙等癥狀表現(xiàn)，嚴(yán)重的甚至?xí)霈F(xiàn)煩躁、焦慮、抑郁等不良心理情緒，給患者身心帶來(lái)重大痛苦，影響生活質(zhì)量[8]，其中有關(guān)圍絕經(jīng)期失眠是女性尋求治療的核心癥狀之一，由于機(jī)制不清，目前西醫(yī)治療MI尚無(wú)特殊的治療方法，多以鎮(zhèn)靜催眠藥為主，這類藥物雖然能使MI患者的失眠癥狀得到緩解，但這種緩解是暫時(shí)的，且療效也不確定，久服耐藥[9]。因此需要深入研究，探討其致病機(jī)理，尋找新的治療方法。

基礎(chǔ)研究表明，通常使用卵巢切除術(shù)(Ovariectomy，OVX)模型研究睡眠[10]，近年來(lái)國(guó)內(nèi)研究者客觀細(xì)致的記錄了OVX小鼠模型的睡眠情況[11-12]。并在OVX的基礎(chǔ)上合并電刺激，造成動(dòng)物神經(jīng)緊張進(jìn)而產(chǎn)生失眠的癥狀。對(duì)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的研究表明，圍絕經(jīng)期失眠可能與大腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺、去甲腎上腺素、多巴胺等有密切關(guān)系[13]，其中5-HT在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的分布十分廣泛, 參與了各種精神活動(dòng)的調(diào)節(jié)，被認(rèn)為可以觸發(fā)睡眠[14]，而5-HIAA又是5-HT最主要的代謝產(chǎn)物[15]。有研究表明，同一腦區(qū)5-HIAA/5-HT的比值反應(yīng)了這一腦區(qū)5-HT神經(jīng)系統(tǒng)的活躍程度[16]。而在腦內(nèi)5-HT受體亞型的研究方面，發(fā)現(xiàn)廣泛分布在海馬、杏仁核、側(cè)間腦與腦皮層邊緣腦區(qū)的5-HT1A 受體與睡眠關(guān)系密切。有研究表明，適當(dāng)增加腦內(nèi)5-HT1A 受體激動(dòng)劑(8-OHDPAT)可延長(zhǎng)NREMS包括SWS、減少清醒，對(duì)REMS無(wú)明顯影響，而大劑量則抑制睡眠(包括REMS和SWS)、促進(jìn)清醒[17]。

中醫(yī)學(xué)并無(wú)“圍絕經(jīng)期失眠”之病名，但根據(jù)臨床觀察MI最常見的失眠癥狀仍屬于入睡難、早醒、通宵難眠、多夢(mèng)、易驚等范疇。其病機(jī)多為心脾兩虛證、心膽氣虛證、肝郁脾虛證、脾腎陽(yáng)虛證、腎虛肝郁證、腎陰陽(yáng)兩虛證等。中醫(yī)藥對(duì)于治療MI具有較好的療效，其針灸因其歷史悠久、配穴方法多樣、副作用小在臨床上發(fā)揮較大的優(yōu)勢(shì)，成為近年來(lái)治療圍絕經(jīng)期失眠關(guān)注的焦點(diǎn)之一。三陰交是人體重要穴位，是十總穴之一，為足太陰脾經(jīng)、足少陰腎經(jīng)、足厥陰肝經(jīng)交會(huì)之處，具有健脾益血、調(diào)肝補(bǔ)腎的功效，臨床上常用于治療月經(jīng)不調(diào)、更年期綜合癥等，此外此穴還具有安神的功能，如《針灸甲乙經(jīng)》說(shuō):“三陰交主足下熱痛，不能久坐，濕痹不能行，驚不得眠?！?，研究表明針灸三陰交對(duì)于治療肝氣郁結(jié)、肝血不足、痰濕中阻等失眠療效確切[18-19]，且明代李言聞刪補(bǔ)改訂本《四言舉要》云:“婦人之脈，以血為本”，可見治療絕經(jīng)期失眠取穴應(yīng)以疏肝養(yǎng)血的穴位為準(zhǔn)。

綜上，本研究通過(guò)觀察電針三陰交對(duì)OVX失眠模型大鼠睡眠時(shí)相以及海馬區(qū)5-HT、5-HIAA、5-HT1A受體水平和5-HIAA/5-HT比值，探討其治療圍絕經(jīng)期失眠可能的作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，OVX失眠模型大鼠的SWS1、SWS2和REMS均明顯縮短，表明模型復(fù)制成功，大鼠處于圍絕經(jīng)期失眠。電針大鼠三陰交穴可明顯延長(zhǎng)OVX失眠模型大鼠REMS、SWS1期的睡眠時(shí)間，表明電針三陰交穴能夠改善大鼠圍絕經(jīng)期失眠，其作用機(jī)制可能與增加海馬區(qū)5-HT、5-HIAA和5-HT1A受體含量、降低5-HIAA/5-HT比值有關(guān)。