丁謙謙,樓定進(jìn),王海英

丁謙謙,義烏市中心醫(yī)院急診科 浙江省義烏市 322000

樓定進(jìn),義烏市中心醫(yī)院全科醫(yī)學(xué) 浙江省義烏市 322000

王海英,義烏市中心醫(yī)院消化內(nèi)科 浙江省義烏市 322000

核心提要： miR-216a-5p在急性胰腺炎模型細(xì)胞中高表達(dá),miR-216a-5p靶向負(fù)調(diào)控XIAP,抑制miR-216a-5p表達(dá)可以通過(guò)上調(diào)XIAP的表達(dá)抑制胰腺炎腺泡細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞增殖.

0 引言

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是一種臨床常見(jiàn)的急腹癥,發(fā)病急,進(jìn)展快,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[1].細(xì)胞凋亡是AP的一個(gè)重要病理特征,參與其發(fā)病過(guò)程,是胰腺炎發(fā)病后對(duì)機(jī)體有利的一種反應(yīng),凋亡能減輕炎癥反[2,3].微小RNA(microRNA,miRNA)具有組織特異性且涉及調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá),在AP中的作用機(jī)制及臨床實(shí)用性的研究有助于為AP的診斷和治療提供新的思路和方法[4].已有研究表明AP患者血清miR-216a表達(dá)水平明顯升高,可作為AP輔助診斷及預(yù)后監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物[5].miR-216a-5p是致癌基因,miR-216-5p有助于宮頸癌細(xì)胞的腫瘤發(fā)生[6],在胃癌中miR-216a-5p促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡[7].miR-216a-5p通過(guò)下調(diào)MMP16表達(dá)抑制人肺癌細(xì)胞的侵襲能力[8].X-連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP) 是凋亡抑制基因家族中重要的成員之一,可通過(guò)抑制caspase-3,caspase-7和caspase-9,并參與其他途徑來(lái)抑制細(xì)胞的凋亡,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)[9].但miR-216a-5p及XIAP在AP表達(dá)及對(duì)其分化、增殖、凋亡的影響和作用機(jī)制等尚未清楚,本文旨在研究miR-216a-5p對(duì)XIAP的調(diào)控機(jī)制及對(duì)AP腺泡細(xì)胞分化、增殖、凋亡的影響.為AP的診斷和治療提供一定的理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料 胰腺腺泡細(xì)胞株AR42J購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù).雨蛙素(caerulein,CAE)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司; 胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司; RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司; Western Blot試劑盒購(gòu)自上海信裕生物技術(shù)有限公司; BCA試劑盒、MTT試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所; LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司; 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司; 細(xì)胞板、流式細(xì)胞儀購(gòu)自賽默飛公司; 兔抗人Bax多克隆抗體、兔抗人Bcl-2多克隆抗體、兔抗人Cyclin D1多克隆抗體、兔抗人p21多克隆抗體、兔抗人XIAP多克隆抗體、兔抗人GAPDH 多克隆抗體、山羊抗兔IgG-辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)的均購(gòu)自上海煊翎生物科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及CAE處理構(gòu)建AP模型：胰腺腺泡AR42J細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基,置于37 ℃,含5%CO2恒溫箱培養(yǎng).每2-3 d傳代一次.取正常AR42J細(xì)胞接種于6孔板上,培養(yǎng)24 h后加入10 nmol/L的CAE,震蕩混勻后繼續(xù)培養(yǎng),即AP細(xì)胞,記為AR42J+CAE組.

說(shuō)起來(lái)好笑，因?yàn)闀?huì)寫(xiě)幾個(gè)字，總會(huì)有些看起來(lái)和文學(xué)有關(guān)的飯局。一天省書(shū)協(xié)的朋友喬樹(shù)約我吃飯，說(shuō)是一位富翁請(qǐng)客。

1.2.2 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染：將miR-NC、miR-216a-5p、antimiR-NC、anti-miR-216a-5p轉(zhuǎn)染至正常培養(yǎng)的AR42J細(xì)胞中記為miR-NC組、miR-216a-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-216a-5p組; 將anti-miR-NC、anti-miR-216a-5p、pcDNA3.1、pcDNA3.1-XIAP分別轉(zhuǎn)染至CAE處理后的胰腺腺泡AR42J細(xì)胞中,記為AR42J+CAE+antimiR-NC組、AR42J+CAE+anti-miR-216a-5p組、AR42J+CAE+pcDNA3.1組、AR42J+CAE+pcDNA3.1-XIAP組; 將anti-miR-216a-5p分別和si-NC、si-XIAP共轉(zhuǎn)染至CAE處理后的胰腺腺泡AR42J細(xì)胞中,分別記為AR42J+CAE+anti-miR-216a-5p+si-NC組、AR42J+CAE+anti-miR-216a-5p+si-XIAP組,轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000試劑盒進(jìn)行操作.

1.2.3 qRT-PCR分析miR-216a-5p的表達(dá)水平：按照Trizol說(shuō)明書(shū)提取總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,按照AceQ qPCR SYBR?Green Mix說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR方法擴(kuò)增.循環(huán)條件為95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s; 72 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán); 60 ℃延長(zhǎng)5 min.相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算.

1.2.4 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)：提取各組細(xì)胞蛋白,用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量.各組蛋白上樣量60 μg,SDS-PAGE后,經(jīng)電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上.用5%脫脂牛奶室溫封閉90 min,分別加入相應(yīng)的一抗：兔抗人Bax多克隆抗體、兔抗人Bcl-2多克隆抗體、兔抗人Cyclin D1多克隆抗體、兔抗人p21多克隆抗體、兔抗人XIAP多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體,4 ℃孵育過(guò)夜,PBS洗滌3次,每次5 min; 再加入相對(duì)應(yīng)的二抗HRP,室溫孵育2 h,PBS洗滌3次,每次10 min,后在暗室中曝光顯影,再浸入定影,最后洗去殘液晾干,將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理,測(cè)定各組蛋白條帶的吸光度,以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平.

1.2.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性：在各組細(xì)胞培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h時(shí)加入20 μL(5 g/L)的MTT溶液,繼續(xù)孵育4 h;棄去多余培養(yǎng)基并加入150 μL DMSO振蕩反應(yīng)10 min,酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度(OD)值.細(xì)胞增殖活力(%)= 實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值×100%.

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞,離心收集各組細(xì)胞,PBS漂洗2次,加結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞.依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū),先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育.流式細(xì)胞儀檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)488 nm和發(fā)射波長(zhǎng)530 nm處的熒光強(qiáng)度.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

圖1 miR-216a-5p在細(xì)胞AR42J及CAE作用的細(xì)胞AR42J中的表達(dá).aP＜0.05,vs AR42J組.

1.2.7 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-216a-5p對(duì)XIAP的靶向調(diào)控：TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)顯示XIAP 3′UTR區(qū)域有miR-7結(jié)合位點(diǎn).構(gòu)建野生型和突變型基因靶點(diǎn)XIAP的3′UTR-熒光素酶表達(dá)載體(WT-XIAP和MUTXIAP),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大鼠胰腺腺泡AR42J細(xì)胞接種于24孔板(5×104個(gè)/孔),待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí),用LipofectamineTM2000將WT-XIAP和MUT-XIAP組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-216a-5p.依據(jù)說(shuō)明書(shū)要求,使用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)儀進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)測(cè)定.實(shí)驗(yàn)結(jié)果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.00進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.計(jì)量資料以mean±SD表示,兩組比較行t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 miR-216a-5p在AP腺泡細(xì)胞中的表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果(圖1)顯示,與正常的AR42J細(xì)胞相比,CAE處理后的AR42J細(xì)胞中miR-216a-5p的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05).可見(jiàn),CAE處理可以提高miR-216a-5p的表達(dá)水平.

2.2 抑制miR-216a-5p對(duì)AP腺泡細(xì)胞增殖的影響 qRTPCR檢測(cè)結(jié)果(圖2A)顯示,與AR42J+CAE+anti-miR-NC組相比,AR42J+CAE+anti-miR-216a-5p組miR-216a-5p的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05).MTT法檢測(cè)結(jié)果(圖2B)顯示,與AR42J組相比,AR42J+CAE組細(xì)胞活性顯著降低,與AR42J+CAE+anti-miR-NC組相比,AR42J+CAE+antimiR-216a-5p組細(xì)胞活性顯著升高(P＜0.05).Western Blot檢測(cè)結(jié)果(圖2C,D)顯示,與AR42J+CAE+anti-miR-NC組相比,AR42J+CAE+anti-miR-216a-5p組Cyclin D1蛋白的表達(dá)水平顯著升高,P21蛋白的表達(dá)水平顯著下降(P＜0.05).可見(jiàn),抑制miR-216a-5p可促進(jìn)AP腺泡細(xì)胞增殖.

2.3 抑制miR-216a-5p對(duì)AP腺泡細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果(圖3A,B)顯示,與AR42J組相比,AR42J+CAE組細(xì)胞凋亡率顯著升高; 與AR42J+CAE+anti-miR-NC組相比,AR42J+CAE+anti-miR-216a-5p組CAE作用的AR42J細(xì)胞的凋亡率顯著降低(P＜0.05).Western Blot檢測(cè)結(jié)果(圖3C,D)顯示,與AR42J組相比,AR42J+CAE組Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低,Bax蛋白的表達(dá)水平顯著升高; 與AR42J+CAE+antimiR-NC組相比,AR42J+CAE+anti-miR-216a-5p組Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著升高,Bax蛋白的表達(dá)水平顯著下降(P＜0.05).可見(jiàn),抑制miR-216a-5p可抑制AP腺泡細(xì)胞凋亡.

2.4 miR-216a-5p靶向、調(diào)控XIAP的表達(dá) 通過(guò)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到XIAP與miR-216a-5p存在結(jié)合位點(diǎn)(圖4A).熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4B)顯示,轉(zhuǎn)染野生型XIAP基因表達(dá)載體WT-XIAP后,相較于miRNC組,miR-216a-5p組AR42J細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P＜0.05); 而轉(zhuǎn)染突變型XIAP基因表達(dá)載體MUTXIAP后,相較于miR-NC組,miR-216a-5p組AR42J細(xì)胞的熒光素酶活性差異不顯著.qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果(圖4C)顯示,相較于miR-NC組,miR-216a-5p組AR42J細(xì)胞中XIAP mRNA的表達(dá)水平顯著降低; 而相較于anti-miR-NC組,anti-miR-216a-5p組AR42J細(xì)胞中XIAP mRNA的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05).Western Blot檢測(cè)結(jié)果(圖4D)顯示,相較于miR-NC組,miR-216a-5p組AR42J細(xì)胞中XIAP蛋白的表達(dá)水平顯著降低; 而相較于anti-miR-NC組,antimiR-216a-5p組AR42J細(xì)胞中XIAP蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05).可見(jiàn),miR-216a-5p可以靶向調(diào)控XIAP.

2.5 過(guò)表達(dá)XIAP對(duì)AP腺泡細(xì)胞增殖、凋亡的影響 MTT法檢測(cè)結(jié)果(圖5A)顯示,與AR42J組相比,AR42J+CAE組細(xì)胞活性顯著降低; 與AR42J+CAE+pcDNA3.1組相比,AR42J+CAE+pcDNA3.1-XIAP組細(xì)胞活性顯著升高(P＜0.05).流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果(圖5B)顯示,與AR42J組相比,AR42J+CAE組細(xì)胞的凋亡率顯著升高; 與AR42J+CAE+pcDNA3.1組相比,AR42J+CAE+pcDNA3.1-XIAP組細(xì)胞的凋亡率顯著降低(P＜0.05).Western Blot檢測(cè)結(jié)果(圖5C,D)顯示,與AR42J組相比,AR42J+CAE組XIAP、Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著下降,P21、Bax蛋白的表達(dá)水平顯著升高; 與AR42J+CAE+pcDNA3.1組相比,AR42J+CAE+pcDNA3.1-XIAP組中XIAP、Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著升高,P21、Bax蛋白的表達(dá)水平顯著下降(P＜0.05).可見(jiàn),過(guò)表達(dá)XIAP促進(jìn)AP腺泡細(xì)胞增殖,抑制其凋亡.

2.6 抑制XIAP表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-216a-5p對(duì)AP腺泡細(xì)胞增殖、凋亡的作用 MTT法檢測(cè)結(jié)果(圖6A)顯示,與AR42J+CAE+anti-miR-NC組相比,AR42J+CAE+antimiR-216a-5p組細(xì)胞活性顯著升高,與AR42J+CAE+antimiR-216a-5p+si-NC組相比,AR42J+CAE+anti-miR-216a-5p+si-XIAP組細(xì)胞活性顯著降低(P＜0.05).流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果(圖6B)顯示,與AR42J+CAE+anti-miR-NC組相比,AR42J+CAE+anti-miR-216a-5p組細(xì)胞的凋亡率顯著降低,與AR42J+CAE+anti-miR-216a-5p+si-NC組相比,AR42J+CAE+anti-miR-216a-5p+si-XIAP組細(xì)胞的凋亡率顯著升高(P＜0.05).Western Blot檢測(cè)結(jié)果(圖6C,D)顯示,與AR42J+CAE+anti-miR-NC組相比,AR42J+CAE+anti-miR-216a-5p組中XIAP、Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著升高,P21、Bax蛋白的表達(dá)水平顯著下降; 與AR42J+CAE+anti-miR-216a-5p+si-NC組相比,AR42J+CAE+anti-miR-216a-5p+si-XIAP組中XIAP、Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著下降,P21、Bax蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05).可見(jiàn),抑制XIAP表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-216a-5p對(duì)AP腺泡細(xì)胞增殖促進(jìn)、凋亡抑制的作用.

圖2 抑制miR-216a-5p對(duì)急性胰腺炎腺泡細(xì)胞增殖的影響.A：miR-216a-5p的表達(dá); B：抑制miR-216a-5p對(duì)急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)腺泡細(xì)胞增殖的影響; C,D：抑制miR-216a-5p對(duì)AP腺泡細(xì)胞增殖蛋白表達(dá)的影響.aP＜0.05,vs AR42J組; cP＜0.05,vs AR42J+CAE+anti-miR-NC

圖3 抑制miR-216a-5p對(duì)急性胰腺炎腺泡細(xì)胞凋亡的影響.A、B：抑制miR-216a-5p對(duì)急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)腺泡細(xì)胞凋亡的影響; C,D：抑制miR-216a-5p對(duì)AP腺泡細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響.aP＜0.05,vs AR42J組; cP＜0.05,vs AR42J+CAE+anti-miR-NC組.

圖4 miR-216a-5p靶向、調(diào)控XIAP的表達(dá).A：XIAP的3’UTR含有miR-216a-5p互補(bǔ)序列; B：雙分子熒光素酶實(shí)驗(yàn); C：miR-216a-5p調(diào)控XIAP mRNA的表達(dá); D：XIAP蛋白的表達(dá).aP＜0.05,vs miR-NC組; cP＜0.05,vs anti-miR-NC組.

圖5 過(guò)表達(dá)XIAP對(duì)急性胰腺炎腺泡細(xì)胞增殖、凋亡的影響.A：過(guò)表達(dá)XIAP對(duì)急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)腺泡細(xì)胞增殖的影響; B：過(guò)表達(dá)XIAP對(duì)AP腺泡細(xì)胞凋亡的影響; C、D：過(guò)表達(dá)XIAP對(duì)AP腺泡細(xì)胞增殖、凋亡蛋白表達(dá)的影響.aP＜0.05,vs AR42J組; cP＜0.05,vs AR42J+CAE+pcDNA3.1組.

圖6 抑制XIAP表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-216a-5p對(duì)急性胰腺炎腺泡細(xì)胞增殖、凋亡的作用.A：抑制XIAP表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-216a-5p對(duì)急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)腺泡細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用; B：抑制XIAP表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-216a-5p對(duì)AP腺泡細(xì)胞凋亡的抑制作用; C、D：抑制XIAP表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-216a-5p對(duì)AP腺泡細(xì)胞增殖、凋亡蛋白表達(dá)的作用.aP＜0.05,vs AR42J+CAE+anti-miR-NC組; cP＜0.05,vs AR42J+CAE+anti-miR-216a-5p+si-NC組.

3 討論

AP是由多種病因誘發(fā)的一種急腹病,發(fā)病率及病死率高,嚴(yán)重影響人們生命健康[10].近些年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA在AP中異常表達(dá),在其診斷、預(yù)后和發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[11].miR-216a為急性胰腺損傷的標(biāo)志物,在AP大鼠模型中上調(diào)表達(dá)[12].Ku?nierz等[13]研究發(fā)現(xiàn)miR-216a-5p在AP患者表達(dá)升高,可以預(yù)測(cè)AP的嚴(yán)重程度.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor,TGF)-β誘導(dǎo)的miR-216a-5p通過(guò)Akt和TGF-β通路加重小鼠AP[14].miR-216a-5p在膀胱癌中低表達(dá),可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15].miR-216a-5p通過(guò)Bcl-2家族蛋白抑制小細(xì)胞肺癌的惡性進(jìn)展[16].上調(diào)miR-216a-5p也能抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲[17]; 還可通過(guò)靶向RUNX1激活NF-κB信號(hào)通路抑制人胃癌細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲[18].本研究結(jié)果顯示,miR-216a-5p在CAE處理的AR42J細(xì)胞中表達(dá)水平顯著升高,抑制表達(dá)miR-216a-5p可提高細(xì)胞活性,降低細(xì)胞凋亡率.miR-216a-5p靶向負(fù)調(diào)控XIAP表達(dá).

XIAP是凋亡抑制蛋白家族中最強(qiáng)的內(nèi)源性的抑制因子,可通過(guò)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及調(diào)控相關(guān)凋亡蛋白酶的表達(dá)產(chǎn)生抗凋亡作用,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系[19].XIAP下調(diào)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡,逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞化療的敏感性[20].研究發(fā)現(xiàn)AP病情輕重程度與XIAP蛋白表達(dá)有關(guān),AP病情越重XIAP表達(dá)越高[21],XIAP參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)[22].李富龍等[23]研究發(fā)現(xiàn)清下化瘀方可通過(guò)下調(diào)Survivin、XIAP的表達(dá)而起到治療AP的作用.XIAP的下調(diào)與大鼠中CAE誘導(dǎo)的AP中的細(xì)胞凋亡相關(guān)[24].XIAP會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的AP[25],而XIAP的缺失則能降低AP的嚴(yán)重程度[26].XIAP在CAE刺激的大鼠胰腺腺泡細(xì)胞中負(fù)向調(diào)控AR42J細(xì)胞的凋亡[27].本研究結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)XIAP促進(jìn)CAE處理的AR42J細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表達(dá),抑制P21、Bax蛋白的表達(dá).抑制XIAP表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制miR-216a-5p對(duì)CAE處理的AR42J細(xì)胞增殖促進(jìn)、凋亡抑制的作用.

綜上所述,抑制miR-216a-5p表達(dá)可以抑制胰腺炎腺泡細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞增殖,其機(jī)制可能與靶向調(diào)控XIAP有關(guān).可為AP診斷和治療提供新靶點(diǎn)和新思路.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,并發(fā)癥較多,對(duì)人生命健康危害加大.根據(jù)其嚴(yán)重程度的不同,可分為輕型急性胰腺炎(mild acute pancreatitis,MAP)和重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP).MAP較容易治愈,但SAP因?yàn)樵缙诓∏殡[匿,后期發(fā)展快,發(fā)現(xiàn)時(shí)已很?chē)?yán)重,所以死亡率較高.早診斷、早發(fā)現(xiàn)、早治療是對(duì)SAP具有重要意義.AP主要病因有膽源性,高脂血癥性,酒精性,暴飲暴食性等.早期主要采用非手術(shù)個(gè)體化治療,包括液體復(fù)蘇、抗生素的使用、早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)、特效藥物和我國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)治療等.更為精準(zhǔn)高效的治療需要清楚其進(jìn)展機(jī)制,研究miRNA可以作為AP的生物標(biāo)志物,預(yù)測(cè)并且判定AP的發(fā)生、發(fā)展、并發(fā)癥發(fā)生等,還可以調(diào)控AP的程序性細(xì)胞死亡,并且可以作為AP的治療靶點(diǎn).而本文主要是從miRNA方面研究其對(duì)AP凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

本研究的主題是miR-216a-5p對(duì)AP增殖凋亡的影響,擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題是了解miR-216a-5p是如何影響AP細(xì)胞的增殖和凋亡,以及其和XIAP之間的關(guān)系及它們對(duì)AP的影響,在AP中的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,為以后臨床上的診斷治療等提供新思路和新靶點(diǎn).

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

研究的主要目標(biāo)即miR-216a-5p,XIAP,AP之間的關(guān)系,研究得到miR-216a-5p和XIAP均在AP中異常表達(dá),抑制miR-216a-5p表達(dá)和過(guò)表達(dá)XIAP均可抑制雨蛙素(caerulein,CAE)處理AR42J細(xì)胞凋亡,且miR-216a-5p靶向負(fù)調(diào)控XIAP.可以從調(diào)控AP凋亡的途徑來(lái)調(diào)控其進(jìn)展,為其治療提供新思路.

實(shí)驗(yàn)方法

本研究首先是用CAE處理大鼠胰腺腺泡來(lái)構(gòu)建AP的模型.轉(zhuǎn)染miR-216a-5p抑制表達(dá)和XIAP過(guò)表達(dá)的載體質(zhì)粒,MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,Western blot檢測(cè)XIAP蛋白表達(dá),qRT-PCR檢測(cè)miR-216a-5p和XIAP mRNA表達(dá)水平,熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-216a-5p與XIAP之間的靶向關(guān)系.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是在CAE構(gòu)建的AP模型細(xì)胞中,miR-216a-5p的表達(dá)水平升高.抑制miR-216a-5p表達(dá)、過(guò)表達(dá)XIAP腺泡細(xì)胞凋亡率降低.miR-216a-5p靶向負(fù)調(diào)控XIAP,抑制XIAP表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-216a-5p對(duì)CAE處理AR42J細(xì)胞的凋亡抑制作用; 達(dá)到了本實(shí)驗(yàn)的目的,對(duì)該領(lǐng)域AP的發(fā)病進(jìn)展機(jī)制又增加了相關(guān)的理論依據(jù),以后可以進(jìn)一步在臨床方面進(jìn)行研究應(yīng)用.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

miR-216a-5p靶向負(fù)調(diào)控XIAP; 抑制miR-216a-5p表達(dá)、過(guò)表達(dá)XIAP抑制腺泡細(xì)胞凋亡.可以通過(guò)調(diào)控XIAP影響AP的進(jìn)展.從miRNA角度去研究其對(duì)AP的影響拓寬了研究的范圍,更多的miRNA影響AP的進(jìn)展,增加了可治療的靶點(diǎn).不同的miRNA在AP中的表達(dá)不同,可通過(guò)研究不同的miRNA及其不同的靶基因影響AP的進(jìn)展進(jìn)而拓展研究思路.miR-216a-5p可以調(diào)控XIAP影響腺泡細(xì)胞凋亡.通過(guò)上調(diào)或下調(diào)miRNA可以影響AP的細(xì)胞的凋亡及其嚴(yán)重程度.對(duì)未來(lái)臨床實(shí)踐提供了新的靶點(diǎn)和思路.

展望前景

只是在理論層面上對(duì)小鼠模型的研究,到臨床上的研究和應(yīng)用還相差甚遠(yuǎn).進(jìn)一步深入的研究調(diào)控miR-216a-5p和XIAP對(duì)治療AP小鼠的影響及其可能會(huì)產(chǎn)生的現(xiàn)象以及進(jìn)一步往臨床方向進(jìn)行相關(guān)研究.尋找更接近于真實(shí)AP的小鼠或者與人AP更為相似的受體,再次基礎(chǔ)上進(jìn)行治療,同時(shí)觀(guān)察其后期的反應(yīng)和狀況.