趙鳳娟,宋淑莉,王志剛,姬永娟

結(jié)直腸癌是第三大常見癌癥，也是癌癥死亡的第三大原因[1]。預(yù)后與早期診斷密切相關(guān)，結(jié)直腸局部病變患者5年生存率高達(dá)90%，而伴隨腫瘤轉(zhuǎn)移的5年生存率降至13%[2]。有研究認(rèn)為這種高死亡率是由于結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞對(duì)常規(guī)化療藥物或靶向治療藥物產(chǎn)生了獲得性抵抗[3]。 目前針對(duì)靶向治療藥物的預(yù)測性反應(yīng)主要受突變狀態(tài)的影響：抗表皮生長因子受體(EGFR)單克隆抗體對(duì)腫瘤不含KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA的患者有效[4]。解聚素-金屬蛋白酶17(ADAM17，又稱腫瘤壞死因子-α轉(zhuǎn)化酶，TACE)是新近發(fā)現(xiàn)的ADAM蛋白家族的成員之一，被認(rèn)為可以在大多數(shù)組織中表達(dá)，并在炎癥、腫瘤生長和血管生成過程中顯著上調(diào)[5]，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。因此，本研究擬通過檢測ADAM17結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)，旨在初步探討其在腫瘤增殖過程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人結(jié)腸癌SW840、HT29、SW620細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。結(jié)腸癌組織來源于我院手術(shù)治療所取得的病理標(biāo)本。DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購自美國Gibco公司，Trizol 試劑和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國ThermoFisher公司，鼠抗人ADAM17單克隆抗體購自武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司，鼠抗人GAPDH抗體購自美國Proteintech公司，即用型鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶免疫組化超敏試劑盒(小鼠)購自福州邁新公司，二氨基聯(lián)苯胺(DAB) 顯色劑購自上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)公司。慢病毒ADAM17-shRNA 購自上海吉瑪公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

解凍人結(jié)腸癌SW480、SW620、HT29細(xì)胞株，接種于含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%以上時(shí)，酶消化備用。ADAM17小干擾RNA(ADAM17-shRNA)及對(duì)照序列由上海吉瑪公司合成，將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種到6孔板中，隨機(jī)分為轉(zhuǎn)染組(加入ADAM17-shRNA)、陰性對(duì)照組(加入無意義序列-shRNA 的慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞)，和空白對(duì)照組(加入等量PBS)，48 h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。當(dāng)MOI 值為80 時(shí)，表明細(xì)胞轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)。

1.2.2 熒光定量PCR檢測

提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，引物均采用Primer 5 設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì), ADAM17基因的上游引物序列為5’-AGAGCTGACCCAGATCCCAT-3’, 下游引物序列為5’-TACTCTCTTCCCCTCTGCCC-3’。內(nèi)參照基因GAPDH 的上游引物序列為5’-CCCCTTCATTGACCTCAACT-3’,下游引物序列為5’-ATGAGTCCTTCCACGATACC-3’。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性15 min,94 ℃15 s,55 ℃退火30 s, 70 ℃延伸30 s,40個(gè)循環(huán)。PCR目的產(chǎn)物大小213 bp，內(nèi)參產(chǎn)物420 bp。采用 2-ΔΔCT法計(jì)算 ADAM17 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 Western blot 檢測

取12 μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物于2%瓊脂糖上電泳分析。將目的條帶的灰度與內(nèi)參條帶GAPDH 的灰度比作為ADAM17的相對(duì)表達(dá)量。用5%脫脂牛奶在室溫下封閉2 h，加入一抗(1∶100稀釋)，4 ℃下孵育過夜。用洗滌液(TBST)洗膜3次，加人辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h；再用TBST洗膜3次，最后用化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)光，在凝膠成像系統(tǒng)上拍照分析。

1.2.4 細(xì)胞增殖能力比較

細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h 后，用完全培養(yǎng)基重懸各組細(xì)胞，以1.5×104/孔接種于96孔板中，各組設(shè)8 個(gè)復(fù)孔。每孔滴加10 μL濃度為5 g/L的MTT溶液，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)基，每孔滴加100 μL二甲基亞砜，37 ℃靜置15 min后，用酶標(biāo)儀(570 nm波長)測定各孔吸光度(OD)值。

1.2.5 細(xì)胞周期觀察

細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，用PBS 緩沖液重懸細(xì)胞，加入預(yù)冷的70%乙醇2 mL充分懸浮細(xì)胞，置于4 ℃固定細(xì)胞24 h。加入含RNA 酶的碘化丙啶(PI)染色，常溫下避光孵育30 min，上流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期，并重復(fù)檢測3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包完成，符從正態(tài)分布的計(jì)量資料采用進(jìn)行描述，如方差齊，采用單因素方差分析及LSD-t法進(jìn)行組間比較，如方差不齊選用近似方法(Welch法和Brown-forsythe法)。所有檢驗(yàn)以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌細(xì)胞系中ADAM17的表達(dá)

所有細(xì)胞系均在局部表達(dá)ADAM17。SW480細(xì)胞系顯示出ADAM17的高表達(dá)，SW620細(xì)胞系中盡管蛋白質(zhì)印跡顯示該蛋白的強(qiáng)帶，但ADAM17的免疫組織化學(xué)表達(dá)顯示較弱(見圖1)。而且各細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染組的ADAM17 mRNA與蛋白表達(dá)均較顯著低于陰性對(duì)照組和空白組(P均<0.05)?？瞻讓?duì)照組和陰性對(duì)照組之間均無顯著差異(P均>0.05),見表1、圖2。

2.2 不同細(xì)胞系中ADAM17細(xì)胞增殖能力比較

HT29、SW480和SW620細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖能力均顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P均<0.001)。HT29和SW480細(xì)胞系的空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但SW620細(xì)胞系中陰性對(duì)照組也顯著高于空白對(duì)照組(P<0.001)。各細(xì)胞系之間比較，轉(zhuǎn)染組在HT29的增殖能力顯著低于SW480和SW620細(xì)胞系(P均<0.05),見表2。

圖1 ADAM17在不同細(xì)胞系中的表達(dá)情況(HE染色200倍)

圖2 ADAM17在不同細(xì)胞系中的蛋白表達(dá)

2.3 不同細(xì)胞系中細(xì)胞周期比較

在各細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染組處于靜止期(G0/G1期)的比例均顯著高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P均<0.001)，表現(xiàn)為明顯的G0/G1阻滯。處于G2/M期的比例顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P均<0.05)?？瞻讓?duì)照組和陰性對(duì)照組在各細(xì)胞周期中的百分比無顯著差異(P均>0.05),見表3。

3 討論

既往研究證實(shí)ADAM17在結(jié)直腸癌中強(qiáng)烈表達(dá)，并與EGFR共同表達(dá)[6]。EGFR配體合成為跨膜前體細(xì)胞，可被細(xì)胞表面蛋白酶切割，特別是ADAM(去整合素和金屬蛋白酶)家族的成員，ADAM將膜相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)化為可溶性效應(yīng)物，同時(shí)迅速降低表面表達(dá)水平[7-8]。ADAM17/TACE(腫瘤壞死因子-α(TNF-α)轉(zhuǎn)化酶)是一種膜結(jié)合酶，涉及EGFR和TNFR反式激活以及白細(xì)胞介素-6(IL-6)信號(hào)傳導(dǎo)[9-10]。在食管鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(TNM)分期有關(guān)[11]。此外，ADAM17與胃癌和非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后不良有關(guān)，ADAM17過表達(dá)可誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞增生[12-13]。并且既往研究已經(jīng)證實(shí)ADAM17是EGFR軸的重要組成部分，癌基因KRAS通過ADAM17促進(jìn)化療誘導(dǎo)的生長因子凋亡、生長因子受體活化以及生成耐藥性[14]。因此，本研究旨在評(píng)估ADAM17 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)及對(duì)增殖能力的影響來初步探討ADAM17在腫瘤發(fā)展過程中的作用機(jī)制。

表1 不同細(xì)胞系中ADAM17mRNA與蛋白的表達(dá)

注：a采用Welch校正；與轉(zhuǎn)染組比較，*P<0.05

表2 不同細(xì)胞系中OD值比較

注：a采用Welch校正；與轉(zhuǎn)染組比較，*P<0.05；與HT29比較，#P<0.05

表3 不同細(xì)胞系中細(xì)胞周期分布(%)(n=3)

注：a采用Welch校正；與轉(zhuǎn)染組比較，*P<0.05

本研究結(jié)果顯示ADAM17 在結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29，SW480和SW620細(xì)胞均有表達(dá)，但在SW620中表達(dá)較弱，這可能與不同抗體的敏感性有關(guān)。此外，轉(zhuǎn)染后的ADAM17在各細(xì)胞系中均表現(xiàn)出明顯的G0/G1阻滯能力下降，這與既往研究相似，均證明沉默ADAM17基因可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[15-16]。盡管如此，目前有關(guān)ADAM17在結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制尚不明確。研究認(rèn)為ADAM17控制許多底物的釋放，包括幾種前EGFR配體[17]。盡管其他ADAM17和底物的作用在腫瘤發(fā)展方面仍然不確定，但越來越多的證據(jù)表明EGFR配體對(duì)結(jié)腸癌發(fā)展起重要作用[18-19]。既往研究認(rèn)為ADAM17的定位和活性由4個(gè)半LIM結(jié)構(gòu)域蛋白2(FHL2，一種參與多種蛋白質(zhì)相互作用的LIM結(jié)構(gòu)域蛋白)調(diào)節(jié)[20]。這種相互作用涉及到721-739位ADAM17的氨基酸序列。既往研究已經(jīng)證實(shí)FHL2蛋白在結(jié)直腸癌，乳腺癌，前列腺癌和卵巢癌中表達(dá)上調(diào)。高FHL2表達(dá)與結(jié)直腸癌的整體和無轉(zhuǎn)移生存率密切有關(guān)。這種不良預(yù)后可能與FHL2在上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用有關(guān)，其中FHL2可以通過與Snail1(一種強(qiáng)效的EMT誘導(dǎo)劑)相互作用來調(diào)節(jié)E-鈣粘蛋白轉(zhuǎn)錄[20-21]。并且研究也證實(shí)ADAM17/FHL2 信號(hào)軸在結(jié)直腸癌中比在腺瘤和正常結(jié)腸粘膜中更頻繁，提示這些蛋白在結(jié)直腸癌發(fā)生的最后階段相互作用[22]。此外，Reba Mustafi等利用結(jié)腸癌的遺傳和化學(xué)模型，首次證明ADAM 17是調(diào)節(jié)EGFR配體釋放的主要酶，具有促癌作用。并且發(fā)現(xiàn)CXCL12-CXCR4軸作為上游信號(hào)激活A(yù)DAM17，這為ADAM17作為結(jié)腸癌預(yù)防的潛在治療靶點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)[23]。隨著已鑒定的ADAM17底物的數(shù)量增加，有證據(jù)表明ADAM17幾乎在每種細(xì)胞功能中發(fā)揮作用。

綜上所述，結(jié)合既往研究和本研究我們認(rèn)為ADAM17蛋白對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，但是由于酶的普遍存在，對(duì)于控制ADAM17活性的機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。