胡思文 ，何汝嘉 ，周淇 ，王樹人 ，黃睿 ，曹新益 ，丁浩 ，曾巾，趙大勇 *

1. 河海大學(xué)/水文水資源與水利工程科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河海大學(xué)全球變化與水循環(huán)國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210098；2. 湖泊與環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國(guó)科學(xué)院南京地理與湖泊研究所，江蘇 南京 210008；3. 河海大學(xué)水利學(xué)科專業(yè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，江蘇 南京210098

蘆葦（Phragmites australis），禾本科蘆葦屬多年生草本植物，分布廣泛，在濕地生態(tài)系統(tǒng)中承擔(dān)重要的生態(tài)功能。作為濕地生態(tài)系統(tǒng)中最常見的優(yōu)勢(shì)種之一，蘆葦具有凈化水體的作用，也是水體生態(tài)系統(tǒng)中物流和能流的物質(zhì)基礎(chǔ)，其較高的生產(chǎn)力可以被湖泊濕地中初級(jí)消費(fèi)者利用，蘆葦?shù)那o稈和地下莖可以防止沉積物流失和河岸腐蝕，能夠維持生態(tài)系統(tǒng)多樣性和環(huán)境穩(wěn)定性（岑璐瑤等，2019；Saltonstall et al．，2016）。近年來，我國(guó)的一些蘆葦濕地出現(xiàn)了種群退化現(xiàn)象，當(dāng)前，保護(hù)我國(guó)蘆葦?shù)倪z傳資源，探討不同生態(tài)型蘆葦?shù)倪z傳差異應(yīng)當(dāng)成為研究熱點(diǎn)。

不同生境中的蘆葦在長(zhǎng)期進(jìn)化、適應(yīng)特異生境的過程中，產(chǎn)生了可遺傳的性狀差異，并隨繁衍演替形成了種間豐富的生態(tài)型（楊允菲等，1998）。由于不同地理區(qū)域蘆葦種群所處的環(huán)境差異較大，互有明顯界限，在水深、鹽度、水分、土壤等環(huán)境因子的作用下，蘆葦?shù)幕鶑?、株高、穗長(zhǎng)等性狀會(huì)發(fā)生顯著變化。例如，新疆蘆葦在不同生境適應(yīng)的過程中形成的多種生態(tài)型，在形態(tài)及營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)器官上有著顯著差異（劉明智等，2011）。黃河三角洲的蘆葦根據(jù)生境的鹽分差異被分為4種生態(tài)型：淡水沼澤蘆葦、咸水沼澤蘆葦、低鹽草甸蘆葦和高鹽草甸蘆葦（趙可夫等，1998）。河西走廊地區(qū)不同生境的蘆葦根據(jù)形態(tài)、生理生化等特征被分為水生蘆葦、輕度鹽化草甸蘆葦、重度鹽化草甸蘆葦及沙丘蘆葦4個(gè)生態(tài)型（任東濤等，1992）。任東濤等（1994）結(jié)合前人數(shù)據(jù)及其實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用主分量分析及模糊聚類的方法指出劃分蘆葦生態(tài)型的綜合指標(biāo)體系包括形態(tài)、生態(tài)、遺傳代謝及抗逆性生理等4個(gè)方面。

表型可塑性和遺傳變異是植物適應(yīng)異質(zhì)性生境的重要策略，因此，同種植物的不同居群可根據(jù)外部形態(tài)與生理特征進(jìn)行生態(tài)型的基本劃分，但僅著眼于表觀差異可能會(huì)低估或高估生態(tài)型的變異程度，形態(tài)相似的種群極容易被忽略（莊瑤等，2010）。Theunissen提出：植物不同生態(tài)型的基因差異是自然選擇下遺傳變異的結(jié)果（Theunissen，1997）?？梢娺z傳變異是不同生態(tài)型形成的基礎(chǔ)，隨著分子技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記能夠?yàn)樯鷳B(tài)型的識(shí)別提供更為可靠、穩(wěn)定的參考指標(biāo)，越來越多的研究使用分子技術(shù)對(duì)蘆葦生態(tài)型進(jìn)行更為細(xì)致的劃分。張淑萍（2001）以形態(tài)特征和遺傳變異為基礎(chǔ)，通過聚類分析將黃河下游典型濕地的蘆葦種群分為鹽生蘆葦、淡水蘆葦和巨型蘆葦。林文芳等（2007）使用ISSR和RAPD技術(shù)對(duì)河西走廊4種生態(tài)型蘆葦?shù)倪z傳相似度進(jìn)行分析，進(jìn)一步證實(shí)了4種生態(tài)型蘆葦由水生生境經(jīng)鹽漬生境向沙丘生境逐漸演化的趨勢(shì)特點(diǎn)。目前關(guān)于蘆葦?shù)难芯恳呀?jīng)有了良好的生態(tài)基礎(chǔ)，主要集中在蘆葦基礎(chǔ)理論的研究、蘆葦病蟲害的防治、蘆葦在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用以及蘆葦?shù)拈_發(fā)利用（宋金枝等，2018）。但關(guān)于不同蘆葦居群遺傳差異的研究區(qū)域多集中于小空間尺度，如：黃河三角洲、河西走廊等鹽度梯度顯著的地區(qū)，或生境差異顯著的蘆葦居群，如：旱生蘆葦和水生蘆葦，以及形態(tài)差異顯著的蘆葦居群等。針對(duì)不同地理區(qū)域的淡水湖泊蘆葦?shù)南嚓P(guān)研究還比較少，且一些根據(jù)形態(tài)及地域生境差異劃分的生態(tài)型并沒有遺傳分化方面的證據(jù)。

葉綠體基因組（chloroplast DNA，cpDNA），是僅次于核基因組的第二大基因組，廣泛存在于植物葉綠體內(nèi)（Zhou et al.，2014）。作為植物中一個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞器，葉綠體擁有一套完整的基因組，基因含量較為保守、易于測(cè)序，且 cpDNA的一些特定非編碼區(qū)由于序列結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，極易發(fā)生突變（李健仔等，2002）。因此，cpDNA對(duì)于種間類群系統(tǒng)發(fā)育的研究有重要意義。rpl16基因?qū)儆赾pDNA非編碼區(qū)，具有高度的AT重復(fù)莖環(huán)變異和序列長(zhǎng)度變異，相較于編碼區(qū)的基因片段進(jìn)化速率更高，可為低分類群間的系統(tǒng)發(fā)育研究提供更多的信息。

空間上廣泛分離的生態(tài)型可以顯示出由基因確定的不同特征，并且局限于它們發(fā)生的地理區(qū)域，因?yàn)榭缍容^大的地理區(qū)域易形成具有高度異質(zhì)性的生境，需要種群內(nèi)基因型多樣化以提供足夠的變異類型來適應(yīng)特定的自然條件，因此，遺傳變異是蘆葦適應(yīng)異質(zhì)環(huán)境的重要方法（顏忠誠(chéng)，2001）。我國(guó)湖濱帶蘆葦居群廣布的淡水湖泊集中分布于長(zhǎng)江中下游和云貴高原，且這兩個(gè)地理區(qū)域經(jīng)度和緯度跨度都比較大（在年平均氣溫、降水、日照等氣候特征上有一定差異，具有一定的地理隔離），蘆葦居群易形成大幅度的生境差異，種群間遺傳多樣性可能較高，進(jìn)而形成不同的生態(tài)型，因此，地理區(qū)域選取長(zhǎng)江中下游和云貴高原，在淡水湖泊的蘆葦研究中具有一定的代表性。本研究以不同地理區(qū)域?yàn)閯澐种笜?biāo)，通過分析蘆葦葉綠體基因組中的rpl16基因序列探討地理區(qū)域跨度較大的長(zhǎng)江中下游和云貴高原共19個(gè)湖濱帶蘆葦居群的親緣關(guān)系、遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，并分析了不同湖泊蘆葦?shù)男螒B(tài)差異與遺傳差異的異同，以期在分子水平為不同地理區(qū)域蘆葦生態(tài)型的劃分提供遺傳分化方面的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本實(shí)驗(yàn)所有蘆葦樣品于2018年7－8月采自長(zhǎng)江中下游平原淡水湖泊和云貴高原淡水湖泊中的規(guī)模較大的典型天然湖泊，長(zhǎng)江中下游選取：鄱陽湖（Poyang Lake）、石臼湖（Shijiu Lake）、巢湖（Chaohu Lake）、長(zhǎng)蕩湖（Changdang Lake）、淀山湖（Dianshan Lake）、滆湖（Gehu Lake）、高郵湖（Gaoyou Lake）、洪澤湖（Hongze Lake）、升金湖（Shengjin Lake）、太湖梅梁灣（Taihu Meiliang Bay）和陽澄湖（Yangcheng Lake），共12個(gè)蘆葦居群，32個(gè)個(gè)體；云貴高原選取：滇池（Dianchi Lake）、撫仙湖（Fuxian Lake）、毛板橋水庫（Maobanqiao Reservoir）、青山嘴水庫（Qingshanzui Reservoir）和陽宗海（Yangzong Lake），共7個(gè)蘆葦種群，23個(gè)個(gè)體。每個(gè)湖泊一個(gè)采樣點(diǎn)，其中巢湖、撫仙湖、滇池是比較重要的淡水湖泊，故設(shè)置了兩個(gè)采樣點(diǎn)。

樣點(diǎn)的樣地框定在10 m×10 m的只有蘆葦、或者蘆葦為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)植物種的方形樣地，且蘆葦密度每平方米大于5株，每個(gè)采樣點(diǎn)按照常規(guī)采樣方式選取生長(zhǎng)狀態(tài)健康的數(shù)株蘆葦，用10 m卷尺量取記錄每株蘆葦基徑、株高、最大葉長(zhǎng)、最大葉寬、中部節(jié)長(zhǎng)和節(jié)數(shù)作為表型數(shù)據(jù)，每株蘆葦采集的葉片置于封口袋中，并于4 ℃保存運(yùn)輸，蘆葦葉樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后保存于-20 ℃。

本研究所用樣品的信息編號(hào)及采樣點(diǎn)分布圖分別見表1和圖1。

表1 樣品來源信息Table 1 Information of the sample source

圖1 長(zhǎng)江中下游及云貴高原蘆葦樣品分布圖Fig. 1 Distribution of sampling sites in the middle and lower reaches of the Yangtze River and the Yunnan-Guizhou Plateau

1.2 樣品DNA提取及PCR擴(kuò)增

所有蘆葦樣品的總DNA采用HP Plant DNA Kit（D2485-01）試劑盒提取，提取前先用液氮充分研磨樣品，提取后于-20 ℃冰箱內(nèi)保存，采用引物rpl16-F71（GCTATGCTTAGTGTGTGACTCGTTG）和 rpl16-R1661（CGTACCCATATTTTTCCACCA CGAC）擴(kuò)增rpl16序列（龔曉潔，2009）。所有樣品rpl16基因的PCR反應(yīng)均采用Ex Taq DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，體系為25 μL。包括：0.25 μL TaKaRa Ex Taq （5 U·μL-1），2.5 μL 10·Buffer，4 μL dNTP Mixture，上下游引物（10 μmol·L-1）各 0.5 μL，0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)無降解的DNA模板1 μL，用ddH2O補(bǔ)充至25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)Marker確認(rèn)產(chǎn)物片段大小，取明亮單一的目的片段條帶交由生物公司（南京金斯瑞生物科技有限公司）進(jìn)行DNA測(cè)序和拼接。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)測(cè)序獲得的序列在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，確定為目的序列，并將序列上傳至Genbank獲取登錄號(hào)。使用 Clustalx 1.8軟件進(jìn)行多序列的比對(duì)排列，采用MEGA 7進(jìn)行居群間遺傳距離分析，并采用最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建基于rpl16基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，用啟發(fā)式搜索最簡(jiǎn)約樹，Gaps/missing做完全缺失狀態(tài)處理，自展法（Bootstrap-method）檢驗(yàn)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)化枝的可靠程度，參數(shù)選擇Tree-Bisection-Regrafting （TBR）法，共循環(huán)1000次重復(fù)。利用DNAsp 6.0軟件計(jì)算居群總的核苷酸多樣性 Pi、單倍型多樣性 Hd以及單倍型統(tǒng)計(jì)（王成樹等，2002）。通過Arlequin軟件的AMOVA程序進(jìn)行不同地理居群間和居群內(nèi)的遺傳變異組成分析，及不同地理居群間分化系數(shù) Fst，并根據(jù) Fst計(jì)算基因流 Nm=0.25(1-Fst)·Fst-1（張曉蕓等，2018）。對(duì)不同湖泊蘆葦樣品的形態(tài)指標(biāo)使用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 rpl16基因序列分析

本研究獲得了 55個(gè)蘆葦樣品的 rpl16基因序列，包含了內(nèi)含子和兩翼外顯子以及部分編碼區(qū)，得到的長(zhǎng)江中下游蘆葦樣品的Genbank登錄號(hào)為：MK648345-MK648367，云貴高原蘆葦樣品的Genbank登錄號(hào)為：MK648373-MK648395。樣品的rpl16基因序列片段的G+C含量平均為31.65%，明顯低于 A+T的平均含量：68.35%，這與一些文獻(xiàn)中非編碼區(qū)的A+T含量較高結(jié)果一致（李毳，2016；王寧等，1999）。經(jīng)DNAsp 6.0檢測(cè)，序列對(duì)齊后空白/缺失位點(diǎn)79個(gè)，保守位點(diǎn)1110個(gè)，變異位點(diǎn)4個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)3個(gè)。通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，存在以堿基顛換為主的遺傳變異類型，同時(shí)還有一些位點(diǎn)存在堿基的缺失和插入。如：與長(zhǎng)江中下游所有蘆葦樣品相比，云貴高原的所有蘆葦樣品均在第293－299位點(diǎn)發(fā)生缺失突變，且在第413和第421位點(diǎn)發(fā)生了顛換突變；毛板橋水庫和青山嘴水庫的蘆葦樣品在第340個(gè)位點(diǎn)發(fā)生顛換突變；淀山湖的一株蘆葦樣品在第777位點(diǎn)插入堿基T。同一湖泊采集的淹水和非淹水生境中的蘆葦樣品的rpl16序列無差異，可見地理隔離是造成不同蘆葦居群遺傳差異的主要原因，因此在后續(xù)的分析中不再將水淹條件作為考慮指標(biāo)之一。

2.2 聚類分析

序列比對(duì)后，利用MEGA 7軟件基于rpl16基因序列重建了（MP）最簡(jiǎn)約系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行了不同地理區(qū)域蘆葦居群間的遺傳距離分析。

2.2.1 系統(tǒng)發(fā)育分析

序列比對(duì)后，利用MEGA 7基于rpl16基因序列重建最簡(jiǎn)約系統(tǒng)發(fā)育樹（MP），分支上的數(shù)字表示自展支持率。由圖2可以看出，長(zhǎng)江中下游的樣品被歸類為一個(gè)置信度為91%的大支，與云貴高原的蘆葦樣品區(qū)分開，其中鄱陽湖和滆湖樣品在支上的分布較分散，說明這兩個(gè)居群的蘆葦樣品間具有較高的分散性，而太湖梅梁灣、升金湖、洪澤湖、高郵湖、淀山湖、長(zhǎng)蕩湖、巢湖和和石臼湖的蘆葦樣品均聚類在一起，說明這些居群樣品間的分散度較小。云貴高原的蘆葦樣品中，毛板橋和青山嘴水庫的蘆葦樣品被歸類為一個(gè)置信度為 68%的單獨(dú)亞支，結(jié)合序列堿基差異比對(duì)，推測(cè)與序列個(gè)別位點(diǎn)的突變有關(guān)。滇池、撫仙湖及陽宗海的每株蘆葦樣品各聚為一類的置信度達(dá)到 100%，且相同居群間樣品的分布均較為分散，可能是這3個(gè)地方的蘆葦進(jìn)化時(shí)間較長(zhǎng)，具有更高的遺傳可塑性，相對(duì)來說比較獨(dú)立所致，屬于同一地理區(qū)域的毛板橋和青山嘴水庫的蘆葦雖然單獨(dú)形成一個(gè)分支，但與其親緣關(guān)系仍較近，長(zhǎng)江中下游的蘆葦樣品與其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可能是因?yàn)椴煌牡乩砦恢眯纬闪瞬煌纳姝h(huán)境，使蘆葦產(chǎn)生了基因水平的變異，并隨著居群的繁衍保留，從而形成了不同的地理生態(tài)型。總的來說，不同地理區(qū)域之間的蘆葦樣品在進(jìn)化時(shí)間和系統(tǒng)發(fā)育上存在一定差異，以地理區(qū)域?yàn)閰^(qū)分指標(biāo)，可將長(zhǎng)江中下游和云貴高原的蘆葦居群分為兩個(gè)單系。

圖2 基于rpl16 序列重建的最簡(jiǎn)約系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Maximum parsimony tree reconstruction based on rpl16 sequence

2.2.2 遺傳距離分析

遺傳距離是用來衡量物種間或同一物種不同群體間遺傳分化的指標(biāo)，可用來描述群體的遺傳結(jié)構(gòu)和居群間的差異，一般認(rèn)為群體分化時(shí)間越短，遺傳距離越?。S椰林，2002；李欣，2008）。利用 MEGA 7計(jì)算本研究樣品居群間的遺傳距離。長(zhǎng)江中下游各居群間以及云貴高原的滇池、撫仙湖、陽宗海兩兩之間的遺傳距離較小，說明其有共同的祖先來源，且遺傳跨度較小，不再在表2中列出。

由表2可以看出，19個(gè)湖濱帶蘆葦居群間的遺傳距離在0.0009－0.0035之間，其中毛板橋居群與長(zhǎng)江中下游各居群間的遺傳差異最大，相對(duì)遺傳距離為0.0034－0.0035；其次是青山嘴居群與長(zhǎng)江中下游各居群間的相對(duì)遺傳距離：0.0026－0.0027。云貴高原的滇池居群、撫仙湖居群、陽宗海居群和毛板橋居群與青山嘴居群之間的遺傳差異最小，相對(duì)遺傳距離為0.0009。除毛板橋居群和青山嘴居群外，云貴高原各居群與長(zhǎng)江中下游各居群間的遺傳距離均為 0.0017－0.0018。這些結(jié)果符合 Koppitz（1999）對(duì)全球蘆葦研究得出的結(jié)論：地理距離增加，克隆間的遺傳距離增加。本研究中毛板橋水庫和淀山湖蘆葦居群的地理距離最大，約為：2031 km。總的分析來說：同一地理生態(tài)型居群間的蘆葦遺傳跨度較小，沒有明顯的遺傳距離差異，不同地理區(qū)域居群間存在一定的差異，但差異不大。Nei et al.（1979）通過研究得出：同一物種在地理居群間遺傳距離變動(dòng)在0－0.05之間，亞種間的遺傳距離在 0.02－0.2之間，種間遺傳距離變動(dòng)在 0.013－0.052之間。因此，本研究中不同地理區(qū)域居群間蘆葦?shù)淖儺惾栽趤喎N到種間的變化范圍內(nèi)。

2.3 遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 遺傳多樣性分析

物種的遺傳多樣性是指種內(nèi)個(gè)體之間或一個(gè)群體內(nèi)不同遺傳變異的總和。大量理論和實(shí)驗(yàn)研究表明，生物居群中遺傳變異的大小與其進(jìn)化速率成正比，因此，遺傳多樣性可以揭示居群的進(jìn)化歷史（沈浩等，2001）。本研究利用DNAsp 6.0軟件從居群的核苷酸多樣性（Pi）和單倍型多態(tài)性（Hd）分析 19個(gè)湖濱帶蘆葦居群的遺傳多樣性。結(jié)果表明：19個(gè)湖濱帶蘆葦居群共計(jì)4種單倍型，除云貴高原毛板橋居群的一株蘆葦單獨(dú)為一單倍型外，其余單倍型分類與聚類結(jié)果一致，不同地理居群間無共享單倍型，這符合常見的種群分布規(guī)律，即：不同大小的多個(gè)種群分布在不同區(qū)域，分隔開來的種群會(huì)獨(dú)立進(jìn)化，突變產(chǎn)生新的單倍型，且新的單倍型在其他種群中不存在（徐剛標(biāo)，2011）。Saltonstall（2003）、Lynch et al.（2002）研究得出：蘆葦每個(gè)葉綠體單倍型代表一種母系遺傳的譜系，可見不同的地理區(qū)域的蘆葦已經(jīng)形成了不同的基因型。居群總核苷酸多樣性 Pi=0.00113，平均核苷酸差異數(shù)k=1.254，居群總單倍型多態(tài)性Hd=0.575，從不同地理居群來看，長(zhǎng)江中下游居群核苷酸多樣性和單倍型多態(tài)性均為 0，云貴高原居群核苷酸多樣性Pi=0.00047，單倍型多態(tài)性Hd=0.466，遺傳多樣性水平較高，可能與其起源較早有關(guān)，積累了更多的變異，這一點(diǎn)與聚類分析結(jié)果一致。總的分析，不同地理區(qū)域的群體遺傳多樣性水平相差較大。

表2 不同蘆葦居群間的遺傳距離Table 2 Genetic distance between different Phragmites australis populations

2.3.2 遺傳結(jié)構(gòu)分析

物種的遺傳結(jié)構(gòu)是指居群間和居群內(nèi)的遺傳變異在空間和時(shí)間上的分布特征和格局，是研究植物適應(yīng)性、物種形成過程及其進(jìn)化機(jī)制的重要基礎(chǔ)（何薇，2014）。將19個(gè)湖濱帶蘆葦居群根據(jù)地理位置分為長(zhǎng)江中下游和云貴高原兩類，進(jìn)行分子方差分析（AMOVE），由表3可得：53.54%的遺傳變異來自于不同地理居群間，46.46%的遺傳變異來自于同一地理居群間，計(jì)算遺傳差異指數(shù)Fst，居群總遺傳差異指數(shù)Fst=0.53537，長(zhǎng)江中下游蘆葦居群的遺傳差異指數(shù)Fst=0.53724，基因流Nm=0.21534，云貴高原蘆葦居群的遺傳差異指數(shù)Fst=0.53278，基因流 Nm=0.21923，兩個(gè)地理區(qū)域居群間的基因流Nm均小于1，說明不同的地理格局會(huì)對(duì)種系的遺傳分化產(chǎn)生一定的影響，不同地理種群之間存在一定分歧，根據(jù)Buso et al.（2010）的研究結(jié)果：Nm小于1，說明居群間的遺傳分化較強(qiáng)烈。

表3 不同蘆葦居群間的分子方差分析（AMOVE）Table 3 Analysis of molecular variance (AMOVE) between different Phragmites australis populations

2.4 形態(tài)差異與遺傳差異的異同

蘆葦?shù)男螒B(tài)作為其表型特征，具有一定的變異性和穩(wěn)定性，受到來自基因和環(huán)境兩方面的影響，由環(huán)境導(dǎo)致的形態(tài)變異稱之為“可塑性”，而基因差異也會(huì)導(dǎo)致形態(tài)差異。在采集蘆葦樣品時(shí)記錄了每株蘆葦?shù)幕鶑?、株高、最大葉長(zhǎng)、最大葉寬、中部節(jié)長(zhǎng)和節(jié)數(shù)作為表型數(shù)據(jù)，由于每一個(gè)湖泊采樣點(diǎn)的蘆葦分布都比較均勻，認(rèn)為每個(gè)湖泊的蘆葦所處的環(huán)境變量一致，故取每個(gè)湖泊蘆葦樣品表型數(shù)據(jù)的平均值來探討形態(tài)差異與遺傳差異的異同。表4列出了不同湖泊蘆葦樣品的表型數(shù)據(jù)平均值，并對(duì)不同湖泊間蘆葦?shù)男螒B(tài)變異程度使用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析。

根據(jù)不同湖泊蘆葦樣品的表型數(shù)據(jù)平均值及單因素方差分析，不同湖泊蘆葦在6個(gè)形態(tài)指標(biāo)上差異顯著，差異程度依次是：最大葉寬＞最大葉長(zhǎng)＞節(jié)數(shù)＞株高＞基徑＞中部節(jié)長(zhǎng)。最大葉寬的差異主要體現(xiàn)在洪澤湖、滇池和青山嘴水庫的蘆葦樣品的最大葉寬明顯小于其他湖泊，同時(shí)洪澤湖和滇池的蘆葦樣品的基徑也明顯小于其他湖泊；最大葉長(zhǎng)的差異表現(xiàn)為陽澄湖和撫仙湖的最大葉長(zhǎng)顯著高于其他湖泊；淀山湖和太湖的蘆葦樣品的節(jié)數(shù)明顯多于其他湖泊；淀山湖和毛板橋水庫的蘆葦樣品株高較高；不同湖泊蘆葦樣品的中部節(jié)長(zhǎng)也存在差異?？偟膩碚f，不同地理區(qū)域和同一地理區(qū)域的蘆葦存在均一定的形態(tài)差異，結(jié)合遺傳差異分析，本研究中蘆葦?shù)牡男螒B(tài)變異有一定的遺傳基礎(chǔ)，且在形態(tài)變異上“可塑性”的影響更大，但僅根據(jù)形態(tài)差異來劃分生態(tài)型具有片面性，“可塑性”和遺傳基礎(chǔ)對(duì)形態(tài)變異的貢獻(xiàn)比率也有待進(jìn)一步研究。

表4 不同湖泊蘆葦樣品的表型數(shù)據(jù)平均值Table 4 Mean value of phenotypic data of Phragmites australis samples collected from different lakes

種群間的遺傳變異反映的是物種對(duì)不同生境的適應(yīng)情況，種群的遺傳多樣性越高，其對(duì)不同生境的適應(yīng)力越強(qiáng)，利用分子技術(shù)可以從微觀角度探索不同生境中的蘆葦遺傳分化的程度及進(jìn)化關(guān)系。龔曉潔（2009）利用rpl16等基因證實(shí)了河西走廊4種生態(tài)型蘆葦?shù)膭澐?，并從遺傳多樣性角度分析了4種生態(tài)型蘆葦?shù)倪M(jìn)化關(guān)系。何薇（2014）通過rpl16基因?qū)χ袊?guó)各個(gè)省的櫻桃居群進(jìn)行了遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析，討論了不同省櫻桃居群間的親緣關(guān)系。張儷文等（2018）結(jié)合了遺傳變異和生境鹽度分析得出黃河三角洲濱海地區(qū)蘆葦群體的遺傳多樣性與生境鹽度具有正相關(guān)關(guān)系。邱天（2018）從蘆葦?shù)谋硇妥儺惤Y(jié)合分子生態(tài)學(xué)的角度分析了小空間尺度上蘆葦?shù)倪z傳變異與表觀遺傳變異有顯著相關(guān)性。本研究利用分子技術(shù)，選取地理區(qū)域?yàn)槲覈?guó)淡水湖泊較為集中的長(zhǎng)江中下游和云貴高原，提取采集蘆葦樣品的總DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后測(cè)序得到cpDNA非編碼區(qū)的rpl16基因序列，并基于rpl16序列分析發(fā)現(xiàn)不同地理區(qū)域的蘆葦居群在序列堿基、親緣關(guān)系、遺傳距離和遺傳結(jié)構(gòu)均存在一定差異，證明了兩種地理生態(tài)型蘆葦具有遺傳上的差異，且地理隔離可能是引起差異的主要原因。

3 結(jié)論

（1）本研究得到的55個(gè)蘆葦樣品的rpl16基因序列，遺傳變異類型主要是堿基的缺失和顛換，且長(zhǎng)江中下游蘆葦居群基因水平上的變異程度較云貴高原的低。

（2）蘆葦居群的親緣關(guān)系和地理距離成負(fù)相關(guān)，長(zhǎng)江中下游和云貴高原的蘆葦居群在發(fā)育樹上形成不同分支，且滇池、撫仙湖及陽宗海的蘆葦是較為古老的居群，居群間的遺傳距離在 0.0017－0.0035之間，和地理距離成正相關(guān)。

（3）不同地理區(qū)間的群落遺傳多樣性水平差異明顯，云貴高原居蘆葦居群的核苷酸多樣性Pi=0.00047，單倍型多態(tài)性Hd=0.466，顯著高于長(zhǎng)江中下游Pi=0，Hd=0。分子方差分析（AMOVE）顯示：53.54%的遺傳變異來自于不同地理居群間，高于同一地理居群間的遺傳變異46.46%。兩個(gè)地理區(qū)域居群間的基因流Nm均小于1，居群間的遺傳分化較強(qiáng)烈。

（4）不同湖泊蘆葦在形態(tài)指標(biāo)上差異顯著，差異程度依次是：最大葉寬＞最大葉長(zhǎng)＞節(jié)數(shù)＞株高＞基徑＞中部節(jié)長(zhǎng)，結(jié)合遺傳差異分析本研究中蘆葦?shù)牡男螒B(tài)變異有一定的遺傳基礎(chǔ)，且在形態(tài)變異上“可塑性”的影響更大，但僅根據(jù)形態(tài)差異來劃分生態(tài)型具有片面性，“可塑性”和遺傳基礎(chǔ)對(duì)形態(tài)變異的貢獻(xiàn)比率也有待進(jìn)一步研究。