孟德梅,石林,李文娟,孫雪晴,郭雅君,賈雪霞,樊振川
(省部共建食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,大健康生物技術(shù)國(guó)際科技合作基地,天津市大健康生物技術(shù)國(guó)際聯(lián)合研究中心,天津 300457)
抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是一種來源于動(dòng)物、植物及真菌等先天免疫組織的有抑菌活性的小分子短肽[1],它可有效御防病原體入侵,大部分抗菌肽具有廣譜抗菌活性和抑制細(xì)菌、真菌、寄生蟲和病毒生長(zhǎng)的功能,有些抗菌肽對(duì)腫瘤具有選擇性殺傷作用[2-4].抗菌肽與傳統(tǒng)抗生素相比,其作用機(jī)理獨(dú)特,不易產(chǎn)生耐藥性,因此成為了有望替代抗生素的理想藥物[5].目前,基因工程法是生產(chǎn)抗菌肽的主要方法之一[6],其中利用畢赤酵母表達(dá)體系生產(chǎn)抗菌肽是一種重要方式.該表達(dá)體系相比于原核表達(dá)體系具有諸多優(yōu)點(diǎn)[7-9],如可以將蛋白分泌到胞外,在蛋白質(zhì)的加工、折疊、翻譯后修飾等方面具有諸多優(yōu)勢(shì),從而能較好地保持目的蛋白的生物活性.現(xiàn)在已有諸多來源的抗菌肽在畢赤酵母表達(dá)體系中成功表達(dá),如人源抗菌肽human cathelicidin[10]、雞源抗菌肽Fowlicidin-3[11]和植物源抗菌肽PaDef[12]等.
抗菌肽Hydramacin-1 來源于大乳頭水螅的上皮防御組織,氨基酸序列與已發(fā)現(xiàn)的抗菌肽氨基酸序列具有極低的相似性,是一種新型抗菌肽[13].該抗菌肽含有60 個(gè)氨基酸殘基,凈電荷為+6,結(jié)構(gòu)中具有一個(gè)二硫鍵橋.二硫鍵橋?qū)⒃撾闹械囊粋€(gè)α-螺旋和β-折疊連接在一起,形成一個(gè)結(jié)扣式的結(jié)構(gòu),有利于維持該結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定.疏水性氨基酸的比例為33%,分布在兩側(cè),由于帶正電荷的殘基被夾在兩個(gè)疏水區(qū)域的中間,疏水區(qū)域的基團(tuán)與細(xì)胞膜上的疏水基團(tuán)相互作用插到磷脂雙分子層中,從而使得細(xì)胞聚集在一起,因此它的抑菌機(jī)制被描述為聚集效應(yīng)模型.Jung等[13]鑒定了由大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組抗菌肽Hydramacin-1 的抗菌活性,結(jié)果顯示Hydramacin-1具有廣譜抗菌特性,對(duì)革蘭氏陰性菌具有較好的抑制效果,但對(duì)革蘭氏陽性菌的抑制效果并不理想,其中對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度高于100 μg/mL.因此,本文將抗菌肽Hydramacin-1 在畢赤酵母系統(tǒng)中表達(dá),獲得重組抗菌肽Hydramacin-1,并檢測(cè)其表達(dá)產(chǎn)量和抗菌活性.
1.1.1 菌株和質(zhì)粒
畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115 和質(zhì)粒pPICZαA 購(gòu)于Invitrogen 公司;大腸桿菌(Escherichia coli)O157 ATCC35150、大腸埃希氏菌(Escherichia coli)ATCC10305、單增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC21633 和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC25923 均購(gòu)于美國(guó)菌種保藏中心;枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)LZZ-133 由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)申琳教授惠贈(zèng).
1.1.2 主要試劑
博來霉素(Zeocin),Invitrogen 公司;慶大霉素(Gen)、超低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)marker 和BCA Protein Assay Kit,北京索萊寶科技有限公司;限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、KpnⅠ和Taq DNA 聚合酶,F(xiàn)ermentas公司;限制性核酸內(nèi)切酶SacⅠ、dNTPs、1 kbp DNA Ladder、100 bp DNA Ladder 和DNA marker Trans 2 K,全式金生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.
1.2.1 Hydramacin-1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建
依據(jù)畢赤酵母密碼子的偏好性[14]優(yōu)化抗菌肽Hydramacin-1 的DNA 序列,在Hydramacin-1 DNA序列的 5′端添加酶切位點(diǎn) EcoRⅠ,起始密碼子ATG,3′端添加終止密碼子TAA,酶切位點(diǎn)KpnⅠ,最終順序?yàn)椋篍coRⅠ-ATG-Hydramacin-1 目的基因-TAA-KpnⅠ.將以上設(shè)計(jì)好的目的基因送往蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行全基因合成,并通過EcoRⅠ和KpnⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)將合成的目的基因克隆至載體pPICZαA 上,最終得到含有重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-Hydramacin-1 的穿刺菌.
挑取含有重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-Hydramacin-1的穿刺菌接種于含有 Zeocin(終質(zhì)量濃度為25 μg/mL)的LB 培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜.使用北京索萊寶生物科技有限公司的質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒.提取的質(zhì)粒用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和KpnⅠ對(duì)其進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,并送往北京奧科生物公司測(cè)序驗(yàn)證.
1.2.2 重組抗菌肽Hydramacin-1 的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定
使用限制性核酸內(nèi)切酶SacⅠ對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-Hydramacin-1 在37 ℃進(jìn)行單酶切2 h,使其線性化.經(jīng)DNA 產(chǎn)物回收試劑盒收集的線性化質(zhì)粒與畢赤酵母GS115 感受態(tài)細(xì)胞混勻,置于預(yù)冷的2 mm 電轉(zhuǎn)杯中,以電壓1 500 V、電容25 μF、電阻200 ? 的條件進(jìn)行電擊,最后將電轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有Zeocin(終質(zhì)量濃度為200 μg/mL)的YPD 平板上,30 ℃培養(yǎng)3~4 d,觀察轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng).
利用菌落PCR 驗(yàn)證的方法[15]進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)化子的篩選.挑取不同酵母轉(zhuǎn)化子于0.2% SDS 溶液中,混勻,沸水浴 10 min,使菌體細(xì)胞膜破裂釋放出基因組DNA,12 000 r/min 離心10 min,取上清液作為實(shí)驗(yàn)組的PCR 模板;用未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的畢赤酵母GS115 單克隆作陰性對(duì)照,同樣上述處理;用重組質(zhì)粒pPICZαA-Hydramacin-1 作陽性對(duì)照.利用軟件(Primer premier 5.0)設(shè)計(jì)的特異性引物 P1(5'-GAAGCTGTCATCGGTTACTCA-3')和 P2(5'-TCC GCACAAACGAAGGTC-3')進(jìn)行PCR 驗(yàn)證.PCR 反應(yīng)結(jié)束后,取5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳,檢測(cè)抗菌肽基因是否成功插入到畢赤酵母基因組中.
挑取不同陽性轉(zhuǎn)化子于5 mL BMGY 培養(yǎng)基中,28 ℃、220 r/min 培養(yǎng)18~24 h 后,按20%的比例轉(zhuǎn)接于25 mL BMGY 培養(yǎng)基中培養(yǎng);待A600達(dá)8.0~10.0 時(shí),收集菌體,離心棄上清液,用甲醇體積分?jǐn)?shù)為1.0%的25 mL BMMY 培養(yǎng)基重懸菌體,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá);每隔24 h 補(bǔ)加甲醇,96 h 后,離心收集上清液進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE 凝膠電泳[16],檢測(cè)目的蛋白是否表達(dá).
1.2.3 表達(dá)條件的優(yōu)化
將擴(kuò)大培養(yǎng)后的重組酵母轉(zhuǎn)化子離心收集,重懸于甲醇體積分?jǐn)?shù)分別為 0.5%、1%、1.5%、2%的BMMY 培養(yǎng)基中培養(yǎng),每隔24 h 取樣,并補(bǔ)加甲醇至各自的終濃度,144 h 后終止培養(yǎng),最后通過BCA Protein Assay Kit 測(cè)定發(fā)酵上清液中的總蛋白含量,同時(shí)進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE 凝膠電泳和銀染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)目的蛋白,并結(jié)合ImageJ 1.8.0 軟件對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行灰度分析,比較不同發(fā)酵時(shí)間、不同甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響.
1.2.4 重組抗菌肽Hydramacin-1 的純化
通過離子交換層析的方法,使用1 mL HiTrap SP柱(GE Healthcare,USA)純化抗菌肽 Hydramacin-1.首先,將發(fā)酵上清液在4 ℃、8 000 g 的條件下離心10 min,去除菌體,并用0.22 μm 的水系濾器過濾發(fā)酵上清液;然后用3 個(gè)柱體積的50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)對(duì)發(fā)酵上清液透析置換.HiTrap SP 柱先用5 倍柱體積的含有1 mol/L NaCl 的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)洗滌,再用5 倍柱體積的50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)平衡.用注射器將樣品以1 mL/min 的速度注入柱中,用5 倍柱體積的50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)漂洗;最后用5 倍柱體積的含有150 mmol/L NaCl 的50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)洗脫目的蛋白,通過Tricine-SDSPAGE 凝膠電泳和銀染實(shí)驗(yàn),結(jié)合ImageJ 1.8.0 軟件進(jìn)行灰度分析,檢測(cè)純化后的抗菌肽純度.將純化后的抗菌肽真空冷凍干燥,保存.
1.2.5 重組抗菌肽Hydramacin-1 的抑菌活力測(cè)定
通過測(cè)定抗菌肽質(zhì)量濃度分別為30、60、80、100 μg/mL 時(shí)對(duì)各指示菌的抑制率,進(jìn)而評(píng)價(jià)其抗菌活性的高低.挑取指示菌于1 mL LB 培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,再用LB 培養(yǎng)基稀釋菌體至1×105mL-1左右,待用.用無菌的50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)將抗菌肽溶解至所需濃度,將20 μL 的各濃度抗菌肽加入96 孔板中,再向每個(gè)孔中加入100 μL 稀釋完畢的菌液,每個(gè)樣品3 個(gè)平行,37 ℃過夜振蕩培養(yǎng)16 h,通過酶標(biāo)儀在600 nm 下測(cè)定樣品的吸光度.實(shí)驗(yàn)組 A600值記為 A,20 μL 無菌的50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)和100 μL 的新鮮LB 培養(yǎng)基混合液吸光度為 A1,20 μL 無菌的50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)與100 μL 的受試菌混合液吸光度為A0,按照式(1)計(jì)算抑制率.
抗菌肽 Hydramacin-1 的 DNA 序列全長(zhǎng)為180 bp,具有60 個(gè)氨基酸,根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏好性(http://www.kazusa.or.jp/codon/)對(duì)其基因序列進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)(圖1).
圖1 pPICZαA-Hydramacin-1重組表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.1 Construction of P.pastoris expression plasmid pPICZαA-Hydramacin-1
優(yōu)化后的DNA 序列如圖1(a)所示;在優(yōu)化后的DNA 序列前加上EcoRⅠ酶切位點(diǎn)和ATG 起始密碼子,序列后加上TAA 終止密碼子和KpnⅠ酶切位點(diǎn),序列長(zhǎng)度為198 bp,如圖1(b)所示;再將其連接至畢赤酵母外泌型表達(dá)載體pPICZαA 中,如圖1(c)所示.
用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和KpnⅠ對(duì)獲得的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,得到兩條大小分別約為200 bp和3 500 bp 的條帶,與理論上設(shè)計(jì)的載體長(zhǎng)度一致(圖2).此后將質(zhì)粒送往北京奧科公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果同樣證明重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-Hydramacin-1 構(gòu)建成功.
圖2 pPICZαA-Hydramacin-1的雙酶切驗(yàn)證Fig.2 Restriction identification of pPICZαA-Hydramacin-1
采用菌落PCR 的方法進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證,結(jié)果如圖3 所示.泳道1 為陰性對(duì)照,無條帶出現(xiàn),證明實(shí)驗(yàn)的可靠性;泳道2 為陽性對(duì)照,重組質(zhì)粒作模板,擴(kuò)增出750 bp 的單一目的條帶;泳道3—9 為驗(yàn)證的7 個(gè)不同酵母轉(zhuǎn)化子,其所出現(xiàn)的條帶與陽性對(duì)照條帶相一致,說明Hydramacin-1 基因已整合到畢赤酵母基因組中,它們均為陽性轉(zhuǎn)化子.
圖3 菌落PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子Fig.3 Positive transformant screening by colony-PCR
由于不同轉(zhuǎn)化子中插入的目的基因片段數(shù)目不相同,導(dǎo)致拷貝數(shù)不同;拷貝數(shù)越高,表達(dá)量越高,因此進(jìn)一步篩選獲得的陽性轉(zhuǎn)化子.取等體積的不同陽性轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵上清液進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE 凝膠電泳檢測(cè),并對(duì)不同轉(zhuǎn)化子的目的蛋白條帶進(jìn)行灰度分析比較,結(jié)果如圖4 所示.7 個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子表達(dá)的目的蛋白大小均在7.0×103左右,證明其得到了準(zhǔn)確表達(dá);通過對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度分析比較,最終選取了蛋白表達(dá)量最高的6 號(hào)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究.
圖4 重組抗菌肽Hydramacin-1在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.4 Expressing recombinant Hydramacin-1 in P.pastoris
2.3.1 誘導(dǎo)表達(dá)條件對(duì)總蛋白表達(dá)量的影響
由于實(shí)驗(yàn)中所用載體為外泌型表達(dá)載體,蛋白主要富集在發(fā)酵上清液之中,并且GS115 菌株分泌的自身蛋白量很低[17],所以通過BCA 法測(cè)定上清液中總蛋白的表達(dá)量情況,也可在一定程度上反映目的蛋白的表達(dá)量情況.誘導(dǎo)表達(dá)條件對(duì)總蛋白表達(dá)量的影響如圖5 所示.由圖5 可知:轉(zhuǎn)化空白質(zhì)粒的畢赤酵母在不同體積分?jǐn)?shù)甲醇的誘導(dǎo)下,總蛋白表達(dá)水平在72 h 后趨于穩(wěn)定,最高表達(dá)量小于100 μg/mL;而在4 個(gè)不同體積分?jǐn)?shù)甲醇的誘導(dǎo)下,轉(zhuǎn)化重組表達(dá)載體的陽性轉(zhuǎn)化子的總蛋白表達(dá)水平均呈上升趨勢(shì),并在144 h 時(shí)達(dá)到最高,在甲醇體積分?jǐn)?shù)為1.5%時(shí),陽性轉(zhuǎn)化子分泌的總蛋白量已達(dá)200 μg/mL,是轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒畢赤酵母蛋白表達(dá)量的2 倍.
圖5 誘導(dǎo)表達(dá)條件對(duì)總蛋白表達(dá)量的影響Fig.5 Effect of expression conditions on total protein expression
2.3.2 誘導(dǎo)表達(dá)條件對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響
通過Tricine SDS-PAGE 凝膠電泳結(jié)合灰度分析,在甲醇體積分?jǐn)?shù)為1.5%時(shí),目的蛋白表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,在誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)為120 h 時(shí),灰度分析值最大,目的蛋白表達(dá)量達(dá)到最高(圖6).
圖6 誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響Fig.6 Expression of recombinant Hydramacin-1 at different induction time
在誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為120 h 的條件下,目的蛋白表達(dá)量隨甲醇體積分?jǐn)?shù)的提高而增加,在甲醇體積分?jǐn)?shù)為1.5%時(shí),目的蛋白表達(dá)量達(dá)到最高(圖7).
圖7 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響Fig.7 Expression of recombinant Hydramacin-1 induced with different methanol concentrations
因此,甲醇體積分?jǐn)?shù)為1.5%,發(fā)酵時(shí)間為120 h為發(fā)酵最優(yōu)條件,總蛋白表達(dá)量可達(dá)166 μg/mL.由灰度分析得知,目的蛋白表達(dá)量占總蛋白量的50%以上,由此可計(jì)算出目的蛋白的產(chǎn)量可達(dá)83 mg/L.
通過HiTrap SP 柱對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行純化,得到了純度較高的目的蛋白,如圖8 所示.
圖8 陽離子交換柱純化重組抗菌肽Hydramacin-1Fig.8 Cation exchange column purified recombinant Hydramacin-1
泳道1 為流穿液,雜蛋白流出,目的蛋白僅有微小損失;泳道2 為漂洗液,未見目的蛋白被洗下來,可見漂洗液的離子強(qiáng)度與pH 條件選擇正確;泳道3—5 為洗脫液對(duì)目的蛋白進(jìn)行洗脫的結(jié)果,得到單一目的條帶,經(jīng)灰度分析,蛋白純度達(dá)90%以上.
使用純化后的目的蛋白進(jìn)行抑菌活力測(cè)定,結(jié)果如圖9 所示.由圖9 可知:重組抗菌肽Hydramacin-1具有廣譜抗菌特性,8 0 μ g/m L 的重組抗菌肽Hydramacin-1 可將大腸桿菌O157 ATCC35150 全部抑制,抑制率達(dá)100%;100 μg/mL 的重組抗菌肽Hydramacin-1 對(duì)大腸埃希氏菌ATCC10305 的抑制率為100%,而對(duì)革蘭氏陽性菌單增李斯特氏菌ATCC 21633、金黃色葡萄球菌ATCC25923 和枯草芽胞桿菌LZZ-133 的抑制率僅分別為38%、72%和64%.由此可見,相比于革蘭氏陽性菌,重組抗菌肽Hydramacin-1 對(duì)革蘭氏陰性菌具有更好的抑制作用.
圖9 不同蛋白質(zhì)量濃度下的重組抗菌肽Hydramacin-1對(duì)指示菌的抑制率Fig.9 Inhibition rate of the purified recombinant Hydramacin-1 with different concentration against the tested bacterial strains
抗菌肽來源廣泛,穩(wěn)定性好,并且不易產(chǎn)生耐藥性,可應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料等不同領(lǐng)域,因此抗菌肽成為了當(dāng)前研究的熱點(diǎn).例如,由于Nisin[18]可以很好地抑制單增李斯特菌和梭狀肉毒桿菌的生長(zhǎng),進(jìn)而有效保證食品安全,延長(zhǎng)貨架期,很多國(guó)家如美國(guó)、中國(guó)等均允許其應(yīng)用到食品防腐保鮮上,尤其是應(yīng)用于易被單增李斯特菌污染的乳制品上.本研究中的抗菌肽Hydramacin-1 若直接從生物體Hydra magnipapillata 中分離制備,存在著成本高、效率低、分離難度大等諸多問題.為解決這個(gè)問題,本實(shí)驗(yàn)選用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng),制備了可高效表達(dá)重組抗菌肽Hydramacin-1 的基因工程菌株.通過多次實(shí)驗(yàn)以及對(duì)總蛋白表達(dá)量和目的蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析,120 h為最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間.超過120 h,目的蛋白表達(dá)量降低,分析原因可能為發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng),目的蛋白發(fā)生降解,雜蛋白增多所致.此外,誘導(dǎo)所使用的甲醇體積分?jǐn)?shù)也不宜過高,這是因?yàn)榧状俭w積分?jǐn)?shù)過高會(huì)對(duì)細(xì)胞造成毒害作用.本實(shí)驗(yàn)顯示重組抗菌肽Hydramacin-1 在畢赤酵母中的最優(yōu)表達(dá)條件是:培養(yǎng)溫度為28 ℃,甲醇體積分?jǐn)?shù)為1.5%,發(fā)酵時(shí)間為120 h.在此條件下,目的蛋白表達(dá)量可達(dá)83 mg/L.許多其他類型的抗菌肽,如 Mytichitin-A[19]、Scygonadin[20]和VpDef[21]也已在畢赤酵母中成功表達(dá),并且在最佳培養(yǎng)條件下,這些重組肽的產(chǎn)量分別可達(dá)到45.5、70、60 mg/L.以上結(jié)果均可表明,畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)有利于重組抗菌肽Hydramacin-1 的高效表達(dá).后續(xù)可通過發(fā)酵及進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件的方式提高其產(chǎn)量.
重組抗菌肽Hydramacin-1 的高抗菌活力非常重要.本文測(cè)定了不同濃度下的重組抗菌肽Hydramacin-1 對(duì)5 株受試菌的抑制率,可知其具有廣譜抗菌活性,對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌效果明顯優(yōu)于革蘭氏陽性菌,大腸桿菌O157 對(duì)其最為敏感.這一特點(diǎn)與大腸桿菌體系所表達(dá)的Hydramacin-1[22]的抗菌特點(diǎn)相一致.本研究中的重組抗菌肽Hydramacin-1 相比于Defensing-TK[23](對(duì)金黃色葡萄球菌的 MIC 為3 μg/mL)和rMP1106[24](對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為0.06 μg/mL)等抗菌肽的抗菌活性,還需進(jìn)一步提高.目前主要是通過分子設(shè)計(jì)與結(jié)構(gòu)改造的方法來提高肽的生物活性[25-26],例如氨基酸的替換,將一個(gè)或多個(gè)氨基酸經(jīng)定點(diǎn)突變技術(shù)替換為精氨酸、賴氨酸等帶正電的氨基酸,增加抗菌肽的帶正電性,進(jìn)而提高抗菌肽的生物活性.目前本實(shí)驗(yàn)室也正在對(duì)抗菌肽進(jìn)行定向改造,以期獲得活性更高的抗菌肽.
綜上所述,本研究首次成功制備了具有高效表達(dá)能力和較好生物活性的重組抗菌肽Hydramacin-1 的畢赤酵母表達(dá)菌株,為后續(xù)抗菌肽Hydramacin-1 更深入的科學(xué)研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).