李雪龍，李 改，謝東奇，金 鵬，毛淑紅，王正祥，劉曉光

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津科技大學(xué)化工與材料學(xué)院，天津 300457)

甾體藥物在臨床上主要用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、抗病毒、抗腫瘤和生育控制，此外還用于麻醉和心血管、淋巴白血病等疾病的治療，是僅次于抗生素的第二大類藥物[1-3].

孕激素中孕二烯酮避孕效果好、副作用小，是第三代高效口服避孕藥的主要成分[4-5].15α-羥基左旋乙基甾烯雙酮是合成口服避孕藥孕二烯酮的關(guān)鍵中間體，過(guò)去主要通過(guò)有機(jī)合成來(lái)完成；但化學(xué)合成具有反應(yīng)步驟多且專一性不強(qiáng)、得率低、使用大量有機(jī)溶劑等缺點(diǎn)[6].目前工業(yè)上已采用微生物轉(zhuǎn)化的生產(chǎn)工藝，主要利用絲狀真菌雷斯青霉(Penicillium raistrickii)細(xì)胞催化直接在左旋乙基甾烯雙酮的C15α位引入羥基，合成15α-羥基左旋乙基甾烯雙酮[7].

課題組前期根據(jù)該菌種轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果，從預(yù)測(cè)的61 個(gè)細(xì)胞色素P450 基因中篩選出15 個(gè)候選C15α-羥化酶CYP 基因，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量擴(kuò)增考察了甾體底物誘導(dǎo)與非誘導(dǎo)條件下候選基因的表達(dá)差異情況，最終確定了12820 和6138 兩個(gè)基因受甾體底物的高度誘導(dǎo).甾體轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)表明，6138 基因(簡(jiǎn)稱8 號(hào))對(duì)左旋乙基甾烯雙酮沒(méi)有轉(zhuǎn)化活性，而12820 基因能夠轉(zhuǎn)化左旋乙基甾烯雙酮，生成15α-羥基左旋乙基甾烯雙酮，表明12820 基因?yàn)?5α-羥化酶基因.從雷斯青霉ATCC10490 中克隆鑒定了參與左旋乙基甾烯雙酮C15α-羥化反應(yīng)的基因12820 (PRH)，該基因編碼一種細(xì)胞色素P450 羥化酶[8]，其羥化反應(yīng)所需的電子由雷斯青霉NADPH-細(xì)胞色素P450 還原酶提供[9].

轉(zhuǎn)化效率偏低是目前工業(yè)上利用雷斯青霉轉(zhuǎn)化左旋乙基甾烯雙酮急需解決的問(wèn)題(底物投料2 g/L，轉(zhuǎn)化60 h，摩爾轉(zhuǎn)化率75%).為了增加左旋乙基甾烯雙酮C15α-羥化效率，本文通過(guò)增加C15α-羥化酶基因PRH 的拷貝數(shù)以提高其表達(dá)水平.考慮大多數(shù)真菌的細(xì)胞色素P450 酶位于微球體的膜上，而8號(hào)預(yù)測(cè)編碼一個(gè)受甾體底物高度誘導(dǎo)的P450 酶，將PRH 基因定點(diǎn)整合至雷斯青霉ATCC10490 基因組的8 號(hào)基因位點(diǎn)，導(dǎo)致8 號(hào)基因失活.這樣一方面增加了15α-羥化酶基因的拷貝數(shù)，另一方面微球體膜可能有多余的空間容納過(guò)表達(dá)的目標(biāo)C15α-羥化酶.鑒于雷斯青霉C15α-羥化酶基因的表達(dá)受底物左旋乙基甾烯雙酮的高度誘導(dǎo)[9-10]，分別構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體pPZP-p800-PRH 和pPZP-TrpC-PRH，使PRH 基因的表達(dá)受本身的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或外源組成型啟動(dòng)子的控制，通過(guò)同源重組的方法定點(diǎn)整合到雷斯青霉的基因組，達(dá)到增加基因拷貝數(shù)的目的，以期獲得轉(zhuǎn)化效率提高的基因工程菌株.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

雷斯青霉(Penicillium raistrickii)ATCC10490、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)AGL-1，天津科技大學(xué)微生物菌種保藏中心.大腸桿菌(Escherichia coli)JM109 以及質(zhì)粒pCSN44、pPZP-HYG2 均為本實(shí)驗(yàn)保存.

1.1.2 酶與試劑

限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ、NotⅠ、SacⅠ、HindⅢ、KpnⅠ)、SolutionⅠ連接試劑盒及Pyrobest DNA 聚合酶，Takara 公司；甲醇、乙腈、乙酸乙酯及石油醚，天津市化學(xué)試劑六廠；其他常規(guī)試劑為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純.引物的合成及序列的測(cè)定由北京華大公司完成.

1.1.3 主要溶液及緩沖液

K buffer：用 1.25 mol/L K2HPO4溶液調(diào)節(jié)1.25 mol/L KH2PO4溶液的 pH=4.8，121 ℃滅菌20 min 備用.

MN buffer：3.0 g MgSO4·7H2O、1.5 g NaCl 溶于去離子水，定容至100 mL，121 ℃滅菌20 min 備用.

IM Trace elements：0.1 g ZnSO4·7H2O、0.1 g CuSO4·5H2O、0.1 g H3BO3、0.1 g MnSO4、0.1 g Na2MoO4·2H2O 溶于去離子水，定容至 100 mL，121 ℃滅菌20 min 備用.

APS+N：2.61 g KCl、7.48 g KH2PO4、29.75 g NaNO3用去離子水溶解，定容至100 mL，用5 mol/L的KOH 溶液調(diào)節(jié)pH=5.5，121 ℃滅菌20 min 備用.

CM Trace elements：2.1 g ZnSO4·7H2O、1.1 g H3BO3、0.5 g MnCl2·4H2O、0.5 g FeSO4·7H2O、0.17 g CuSO4·5H2O、0.15 g Na2MoO4·2H2O、5.1 g EDTA 用去離子水溶解，定容至100 mL，121 ℃滅菌20 min備用.

1.1.4 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基(g/L)：土豆200，葡萄糖20，115 ℃滅菌15 min.

LB 培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，NaCl 10，酵母粉5，121 ℃滅菌20 min.

YPD 培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20，115 ℃滅菌20 min.

誘導(dǎo)培養(yǎng)基(IM)：900 mL 去離子水，121 ℃滅菌20 min.加入預(yù)先滅菌的K buffer 0.8 mL、MN buffer 20 mL、1%CaCl2溶 液 1 mL、0.01%FeSO4溶液10 mL、IM Trace elements 5 mL、20%NH4NO3溶液2.5 mL、1 mol/L MES 40 mL、50%甘油10 mL、20%葡萄糖10 mL，搖勻備用.固體培養(yǎng)基將去離子水中加入15 g 瓊脂粉，121 ℃滅菌20 min 備用.

真菌生長(zhǎng)完全培養(yǎng)基(CM)：在900 mL 去離子水中加入瓊脂粉15 g，121 ℃滅菌20 min.使用前用微波爐加熱至瓊脂完全溶解，然后加入預(yù)先滅菌的APS+N 20 mL、1 mol/L MgSO4溶液2 mL、CM Trace elements 1 mL、10%酪蛋白水解物10 mL、10%酵母浸出物50 mL、50%葡萄糖20 mL.

1.1.5 甾體化合物

左旋乙基甾烯雙酮(底物，英文縮寫 GD)和15α-羥基左旋乙基甾烯雙酮(產(chǎn)物，英文縮寫15α-OH-GD)均由北京紫竹藥業(yè)有限公司提供.

1.2 方法

1.2.1 雷斯青霉ATCC10490 重組菌的構(gòu)建

為了將C15α-羥化酶基因PRH 定點(diǎn)整合至雷斯青霉ATCC10490 基因組的8 號(hào)位點(diǎn)[8]，以雷斯青霉的8 號(hào)基因?yàn)橥幢?，設(shè)計(jì)引物(8-L-F/R 和8-RF/R)，以雷斯青霉基因組為模板，PCR 得到同源臂.用HindⅢ和XbaⅠ雙酶切質(zhì)粒pCSN44，膠回收后得到潮霉素抗性基因(HYG，2.2 kbp).用SacⅠ和KpnⅠ雙酶切質(zhì)粒pBluescript Ⅱ KS+，回收后得到3.0 kbp 的線性載體骨架片段.用引物(PRH-TT-F/R、p800-PRH-TT-F/R)，以雷斯青霉基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到 PRH-TT 和p800-PRH-TT，用XbaⅠ和HindⅢ雙酶切HYG，獲得TrpC 啟動(dòng)子.將上述酶切體系進(jìn)行切膠回收，獲得目的片段與載體.

引物序列為 8-L-F：GGTACCTTCACTTTGCT TGGATTGAGCG，8-L-R：AAGCTTACTTGAGAT TACTGAGGATGATGG；8-R-F：GAATTCGCCGAAT AAGCAAGTCGAATG，8-R-R：GAGCTCGATAGTC TCGAACTTACTTGCGTC；PRH-TT-F：AAGCTTAT GGCTGTCCTCACCGAATTG，PRH-TT-R：GAATTC TTGTGCGGTCTGGAGTTCATG；p800-PRH-TT-F：TCTAGAGAGACTCAAGGCGTAGCTCCAG，p800-P RH-TT-R：GAATTCTTGTGCGGTCTGGAGTTCATG.

將回收的目的片段與載體連接分別得到重組質(zhì)粒 pBlue-L-HYG、pBlue-p800-PRH-TT-R 和 pBlue-TrpC-PRH-TT-R.使用SacⅠ和XbaⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pBlue-L-HYG，膠回收片段pBlue-L-HYG；使用SacⅠ和 XbaⅠ分別雙酶切重組質(zhì)粒 pBlue-p800-PRH-TT-R 和 pBlue-TrpC-PRH-TT-R，膠回收片段p800-PRH-TT-R 和 TrpC-PRH-TT-R.將 pBlue-LHYG 分別與p800-PRH-TT-R 和TrpC-PRH-TT-R 兩個(gè)片段進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化 E.coli JM109，得到相應(yīng)的重組質(zhì)粒：pBlue-L-HYG-p800-PRH-TT-R 和pBlue-L-HYG-TrpC-PRH-TT-R.

采取DNA 體外重組的方法分別構(gòu)建雷斯青霉甾體15α-羥化酶的2 個(gè)表達(dá)載體：pPZP-L-HYGp800-PRH-TT-R 和pPZP-L-HYG-TrpC-PRH-TT-R.

1.2.2 雷斯青霉ATCC10490 孢子懸液的制備

用接種環(huán)將雷斯青霉ATCC10490 的孢子劃線接種于PDA 試管斜面上，28 ℃培養(yǎng)3～5 d.待孢子成熟后，用預(yù)先滅菌的1 mol/L 山梨醇溶液洗滌，用滅菌的玻璃珠將其打散(震蕩約15～30 min)，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，再稀釋至相應(yīng)濃度，分裝，4 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.3 根癌農(nóng)桿菌AGL-1 的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)

將重組菌(pPZP-L-HYG-p800-PRH-TT-R 和pPZP-L-HYG-TrpC-PRH-TT-R)通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌AGL-1 感受態(tài)中，挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證.PCR 引物為HYGF/HYG-R，HYG-F：GTACCTGTGCATTCTGGGTAA ACG，HYG-R：TGTTTATCGGCACTTTGCATCGGC.

將驗(yàn)證成功的陽(yáng)性單克隆轉(zhuǎn)化子在LB(含卡那霉素50 μg/mL)平板上劃線，28 ℃培養(yǎng)72 h 后放于4 ℃?zhèn)溆?

將根癌農(nóng)桿菌接種于5 mL LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)24 h 后，轉(zhuǎn)接于裝有50 mL LB 液體培養(yǎng)基的250 mL 的搖瓶中，28 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)至A600=0.8；5 000 r/min 離心10 min，棄上清液.使用IM 培養(yǎng)基重懸菌體，28 ℃、200 r/min 搖床誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h.將誘導(dǎo)好的根癌農(nóng)桿菌與雷斯青霉孢子懸液按體積比1：1 均勻混合，涂布于IM 平板上，25 ℃共培養(yǎng)48 h.用1 mL 生理鹽水將菌絲洗下，并用涂布器打碎涂布于CM 平板上.

1.2.4 雷斯青霉過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子的篩選與驗(yàn)證

待CM 平板上生長(zhǎng)出單菌落，在其產(chǎn)孢前，隨機(jī)挑選雷斯青霉陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子于含300 μg/mL HYG 抗性的PDA 平板進(jìn)行復(fù)篩，于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d.挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的菌落于含有300 μg/mL HYG 抗性的PDA 試管斜面中，28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4 d.待試管中轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生孢子后，用生理鹽水將孢子洗下并保菌.余下的孢子懸液接種于PDA 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌絲，提取雷斯青霉轉(zhuǎn)化子的基因組，并以雷斯青霉出發(fā)菌株基因組作為對(duì)照，以L-F、HYG-R 為引物進(jìn)行PCR 驗(yàn)證.L-F：CAGAAACTTCTCGACAGACG T，HYG-R：GATCTTCCAAACCACATAGGTG.

1.2.5 重組雷斯青霉PRH 基因的拷貝數(shù)檢測(cè)

本課題組前期從雷斯青霉ATCC10490 中克隆鑒定了參與左旋乙基甾烯雙酮C15α-羥化反應(yīng)的基因12820(PRH)，根據(jù)PRH 基因的cDNA 的序列設(shè)計(jì)目的基因的引物PRH-F 和PRH-R，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中提供的內(nèi)參cDNA 基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物tublin-F 和tublin-R，該基因是雷斯青霉整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因.PRH-F：GAATTCATG GCTGTCCTCACCGAAT，PRH-R：CTCGAGCTACT CTCCCAAGAAACTCA；Tublin-F：AACCATCTCCG GTGAGCACG，Tublin-R：GCATGCAGATATCGTAC AGAGC.

將過(guò)表達(dá)PRH 基因與內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(Real-time PCR).反應(yīng)體系(20 μL)：2×SYBR Green Mix 10 μL，ROX 0.4 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，模板(基因組)1 μL，dd H2O 7.6 μL.反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃1 min，40 個(gè)循環(huán).實(shí)驗(yàn)過(guò)程中Ct 值表明擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，利用每個(gè)模板的Ct 值與該模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在的線性關(guān)系，以檢測(cè)不同菌株之間表達(dá)差異.表達(dá)差異倍數(shù)按照文獻(xiàn)[11]方法計(jì)算.

1.2.6 雷斯青霉重組菌的甾體轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

鑒于雷斯青霉C15α-羥化酶基因的表達(dá)受底物左旋乙基甾烯雙酮的高度誘導(dǎo)，其PRH 基因前面是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子.為提高雷斯青霉對(duì)甾體底物的轉(zhuǎn)化效率，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中在PRH 基因前面添加一個(gè)組成型啟動(dòng)子TrpC.為了初步探索重組菌的甾體15α-羥基化活性，將雷斯青霉出發(fā)菌株、誘導(dǎo)型PRH-p800 重組菌株和組成型PRH-TrpC 重組菌株各1 mL(計(jì)數(shù)為107)到30 mL YPD 培養(yǎng)基中，24 h 后加入2 g/L 的左旋乙基甾烯雙酮，分別誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化12、24、36、48、60、72、84 h，28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)，適時(shí)取樣測(cè)定轉(zhuǎn)化率.

1.2.7 硅膠薄層層析(TLC)分析

取1 mL 菌體發(fā)酵液，加入500 μL 的乙酸乙酯混勻，12 000 r/min 離心3 min，取上清液(乙酸乙酯層)200 μL，用直徑為0.2 mm 的毛細(xì)管點(diǎn)樣于硅膠層析板上.在距層析板邊緣 1 cm 處點(diǎn)樣，樣點(diǎn)間距0.5 cm.在展開之前用展開劑將層析缸飽和30 min.將點(diǎn)有樣品的硅膠板放入層析缸中展開，加蓋，密封，待展開劑前沿快到頂端時(shí)，取出點(diǎn)樣板，烘干.采用紫外檢測(cè)儀觀察轉(zhuǎn)化產(chǎn)物.

1.2.8 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的高效液相色譜(HPLC)分析

取樣萃取后靜置，取100 μL 上層有機(jī)相于干凈的1.5 mL EP 管中，待乙酸乙酯揮發(fā)完，加入100 μL乙腈溶解后用0.22 μm 膜過(guò)濾.色譜條件：色譜柱為C18 柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水溶液(體積比為4：1)，流量0.8 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm.

1.2.9 雷斯青霉重組菌轉(zhuǎn)化效率測(cè)定

通過(guò)色譜圖中生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物曲線下的峰面積確定獲得的HGD 的質(zhì)量.GD 到15α-OH-GD(HGD)的摩爾轉(zhuǎn)化率按照式(1)計(jì)算[12].

式中：mHGD和mGD分別為HGD 和GD 的質(zhì)量，MHGD和MGD分別為HGD 和GD 的相對(duì)分子質(zhì)量.

2 結(jié)果與分析

2.1 雷斯青霉ATCC10490 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子與組成型啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

為了改進(jìn)現(xiàn)有生產(chǎn)菌種雷斯青霉ATCC10490 轉(zhuǎn)化GD 合成15α-OH-GD 的效率，探討增加目標(biāo)基因PRH 拷貝數(shù)對(duì) GD 轉(zhuǎn)化活性的影響.首先構(gòu)建GD15α-羥化酶基因PRH 的表達(dá)載體，表達(dá)載體構(gòu)建示意圖如圖1 所示.

圖1 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建示意圖Fig.1 Schema of overexpression vector construction

構(gòu)建的過(guò)表達(dá)載體，將重組質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切分析.載體pPZP 為6.7 kbp，其中HYG 抗性基因及其啟動(dòng)子為 2.2 kbp，p800-PRH-TT 片段為 3.3 kbp，TrpC-PRH-TT 片段為2.8 kbp.經(jīng)XhoⅠ/XbaⅠ雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖2(a))顯示約10 kbp的載體片段和3.3 kbp 的目的基因片段，證實(shí)過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建成功，命名為pPZP-L-HYG-p800-PRH-TTR.而經(jīng)HindⅢ單酶切后3 個(gè)片段應(yīng)為7.9、2.7、2.5 kbp.酶切電泳結(jié)果(圖2(b))顯示所得片段大小與理論值一致，證實(shí)PRH 基因組成型過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建成功，表達(dá)載體命名為pPZP-L-HYG-TrpC-PRHTT-R.

圖2 過(guò)表達(dá)載體的酶切驗(yàn)證Fig.2 Enzymatic digestion verification of overexpression vector

2.2 雷斯青霉過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌

將過(guò)表達(dá)載體pPZP-L-HYG-p800-PRH-TT-R 和pPZP-L-HYG-TrpC-PRH-TT-R 電轉(zhuǎn)至已經(jīng)制備好的根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)中.因?yàn)檩d體在根癌農(nóng)桿菌AGL-1 中的拷貝數(shù)較低，因此無(wú)法通過(guò)質(zhì)粒提取的方法驗(yàn)證載體是否成功轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌，需通過(guò)菌落PCR 的方法驗(yàn)證載體是否成功轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌AGL-1.PCR 結(jié)果如圖3 所示，菌落PCR 得到約2.1 kbp 的條帶，與HYG 基因設(shè)計(jì)引物PCR 預(yù)測(cè)結(jié)果大小一致，證實(shí)過(guò)表達(dá)載體pPZP-L-HYG-p800-PRH-TT-R 和pPZP-L-HYG-TrpC-PRH-TT-R 已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌AGL-1 中.

2.3 雷斯青霉重組菌株的鑒定

利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)雷斯青霉ATCC10490 轉(zhuǎn)化，將15α-羥化酶基因PRH 表達(dá)盒轉(zhuǎn)入雷斯青霉中，通過(guò)同源重組定點(diǎn)整合的方式增加雷斯青霉PRH 基因的拷貝數(shù).同源重組的原理及基因重組菌株驗(yàn)證策略見(jiàn)圖4.將過(guò)表達(dá)重組菌株的基因組作為模板，以L-F、HYG-R 為引物進(jìn)行PCR 驗(yàn)證.擴(kuò)增結(jié)果如圖5 所示，PCR 產(chǎn)物大小約為1.2 kbp 條帶，與理論結(jié)果大小一致，表明成功得到了過(guò)表達(dá)PRH 基因重組菌株.

圖3 根癌農(nóng)桿菌AGL-1 pPZP-L-HYG-p800-PRH-TTR 和pPZP-L-HYG-TrpC-PRH-TT-R 轉(zhuǎn)化子菌落PCR驗(yàn)證Fig.3 PCR verification of the A.tumefaciens AGL-1 transformants of pPZP-L-HYG-p800-PRH-TT-R and pPZP-L-HYG-TrpC-PRH-TT-R

圖4 PRH-P800和PRH-TrpC基因表達(dá)盒定點(diǎn)整合Fig.4 Targeted integration of PRH-P800 and PRH-TrpC expression cassette

2.4 PRH 過(guò)表達(dá)重組菌株拷貝數(shù)的確定

利用實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)野生型菌株、誘導(dǎo)型菌株P(guān)RH-P800 和組成型菌株P(guān)RH-TrpC 的PRH 基因拷貝數(shù).基因組DNA 定量PCR 擴(kuò)增結(jié)果(圖6)顯示：如果將野生型菌株P(guān)RH 基因的相對(duì)拷貝數(shù)定量為1.001 5，則菌株P(guān)RH-P800 的PRH 基因相對(duì)拷貝數(shù)為 2.043 3，菌株 PRH-TrpC 的相對(duì)拷貝數(shù)為1.846 2.這說(shuō)明重組菌的PRH 基因相對(duì)拷貝數(shù)是野生菌的2 倍，達(dá)到預(yù)期結(jié)果.

圖5 重組菌PCR驗(yàn)證Fig.5 PCR validation of recombined strains

圖6 雷斯青霉重組菌株P(guān)RH 基因拷貝數(shù)的定量PCR測(cè)定Fig.6 Determination of PRH copy number in P.raistrickii recombined strains with qPCR

2.5 增加甾體羥化酶基因一個(gè)拷貝對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

為了考察雷斯青霉重組菌株的左旋乙基甾烯雙酮15α-羥基化活性，比較了野生型菌株、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子重組菌株P(guān)RH-P800 和組成型啟動(dòng)子重組菌株P(guān)RH-TrpC 在底物投樣量為2 g/L 時(shí)左旋乙基甾烯雙酮轉(zhuǎn)化情況.15α-羥化酶的特異性強(qiáng)，在轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中幾乎沒(méi)有副產(chǎn)物產(chǎn)生，但是在工業(yè)上轉(zhuǎn)化效率偏低，增加甾體羥化酶基因一個(gè)拷貝后，與野生型菌株相比較，過(guò)表達(dá)PRH 基因重組菌株對(duì)左旋乙基甾烯雙酮的轉(zhuǎn)化效率明顯提高.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7 所示，重組菌PRH-TrpC 在48 h 左右摩爾轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到90%，重組菌PRH-P800在48 h 左右摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到85%，而野生型菌株在60 h 左右才達(dá)到75%.以上結(jié)果表明PRH 基因重組菌株P(guān)RH-P800 同出發(fā)菌株相比摩爾轉(zhuǎn)化率高出13%，PRH-TrpC 同出發(fā)菌株相比摩爾轉(zhuǎn)化率高出20%，而且轉(zhuǎn)化時(shí)間均縮短了12 h.

圖7 不同雷斯青霉過(guò)表達(dá)PRH 基因重組菌株的GD轉(zhuǎn)化曲線Fig.7 Transformation curves of GD by PRH-overexpressing recombined P.raistrickii strains

3 結(jié) 語(yǔ)

本文考察了增加雷斯青霉ATCC10490 C15α-羥化基因PRH 的拷貝數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)化左旋乙基甾烯雙酮效率的影響.分別構(gòu)建了PRH 基因的誘導(dǎo)型和組成型過(guò)表達(dá)載體pPZP-P800-PRH 和pPZP-TrpC-PRH，并通過(guò)同源重組的方法定點(diǎn)整合到雷斯青霉基因組.轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)表明，在出發(fā)菌株中增加一個(gè)PRH 基因拷貝顯著提高了甾體左旋乙基甾烯雙酮轉(zhuǎn)化效率，重組菌PRH-P800 和PRH-TrpC 的摩爾轉(zhuǎn)化率分別提高了13%和20%，同時(shí)轉(zhuǎn)化時(shí)間均縮短了12 h.