湯曉琳 楊丹 呂鑫 沈薇

(沈陽醫(yī)學院 1機能實驗中心，遼寧 沈陽 110034；2藥理教研室；3 2018屆臨床醫(yī)學專業(yè)；4病理生理教研室)

正常上皮細胞與細胞外基質(ECM)脫離黏附后，細胞與基質相互作用消失，發(fā)生失巢凋亡(anoikis)。腫瘤對失巢凋亡的抵抗能力在腫瘤轉移中發(fā)揮重要作用。胃癌是全球常見的惡性腫瘤，預后較差，其5年生存率僅為20%～30%〔1〕，胃癌轉移是導致死亡的最主要原因。研究表明，分泌型卷曲相關蛋白(SFRP)1在胃癌中呈低表達，且與淋巴結轉移及患者不良預后相關〔2〕。有報道SFRP1甲基化致基因沉默促進胃癌的形成和發(fā)展〔3〕，但關于SFRP1對細胞失巢凋亡的影響及其機制尚少報道。本課題組在前期研究中發(fā)現胃黏膜上皮細胞(GES)-1為失巢凋亡敏感細胞〔4〕，本研究應用RNA干擾沉默GES-1中SFRP1表達，觀察其對GES-1細胞失巢凋亡敏感性的影響，并探討其相關分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人GES-1(武漢普諾賽公司)。RPMI1640培養(yǎng)基(美國Corning公司)；胎牛血清(美國Gemini公司)；胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)(天津灝洋生物有限公司)；SFRP1基因siRNA(上海吉瑪基因公司)；脂質體Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)；RNA提取試劑盒(美國Axygen公司)；逆轉錄試劑盒、Q-PCR試劑盒(美國Promega公司)；多聚α-羥乙基甲基丙烯酸酯(Poly-HEMA，美國Sigma公司)；凋亡檢測試劑盒(日本同仁化學研究所)；CytoSelectTM24-Well Anoikis Assay(美國Cell Biolabs公司)。兔多克隆抗體SFRP1(美國Abcam公司)；鼠單克隆抗體β-catenin 抗體、β-actin抗體(美國Santa Cruz公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗鼠和山羊抗兔IgG，增強化學發(fā)光(ECL)試劑盒(美國Proteintech公司)；紅色熒光素(RRX)標記山羊抗兔IgG(中國康為世紀公司)；4′6-二脒基-乙-苯基吲哚(DAPI)染液、十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)配制試劑盒(上海碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉染 GES-1培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。針對SFRP1不同位點的三組siRNA基因序列及對照組Control siRNA序列如下：siRNA-612正義：5′-GCUCAACAAGAACUGCCACTT-3′，反義：GUGGCAGUUCUUGUUGAGCTT-3′；siRNA-891正義：5′-GAAAUCUGAGGCCAUCAUUTT-3′，反義：5′-AAUGAUGGCCUCAGAUUUCTT-3′；siRNA-740正義：5′-UCAUGCAGUUCUUCGGCUUTT-3′，反義：5′-AAGCCGAAGAACUGCAUGATT-3′)；Control siRNA正義：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。轉染前24 h，將(1.5～2.0)×105個/ml處于對數生長期的細胞鋪于6孔板內，每孔1 ml，培養(yǎng)過夜。第2天用脂質體包埋的siRNA與細胞結合進行瞬時轉染，操作嚴格按照說明書進行。48 h后使用胰酶消化收集各組細胞進行失巢培養(yǎng)。

1.2.2 失巢凋亡模型的建立 稱取1 g Poly-HEMA，加入10 ml無水乙醇，震蕩混勻，37℃水浴加熱至無顆粒狀態(tài)，濃度為10 mg/ml。取3 ml液體覆蓋于培養(yǎng)皿(60 mm)底部，在超凈臺內吹干，室溫下待乙醇揮發(fā)使其自然凝固，重復操作2次，使用前磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次。收集轉染48 h后的細胞接種于Poly-HEMA包被的培養(yǎng)皿中，細胞在培養(yǎng)皿中非黏附生長而呈懸浮狀態(tài)，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。

1.2.3 Realtime RT-PCR檢測 處理后細胞提取總RNA，以Oligo dT為引物逆轉錄合成第一條cDNA鏈，然后以第一條cDNA鏈為模板進行PCR擴增。引物序列：SFRP1正義：5′-GATGCTTAAGTGTGACAAGTTCCC-3′，反義：5′-TGGCCTCAGATTTCAAC TCGT-3′；GAPDH正義：5′-GCACCGTCAGGCTGAGAA-3′，反義：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGG-3′；Cyclin D1正義：5′-AACTACCTGGACCGCTTCCT-3′，反義：5′-CCACTTGAGCTTGTTCACCA-3′；c-Myc正義：5′-ACCAGATCCCGGAGTTGGAA-3′，反義：5′-CGTCGTTTCCGCAACAAGTC-3′。ABI 7500 Real-time PCR擴增儀進行操作，反應條件為95℃預變性10 min、95℃ 15 s、60℃ 1 min，共40個循環(huán)，添加溶解曲線，計算平均值，最后以2-ΔΔCt方法計算目的基因相對表達量，重復實驗3次。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞失巢凋亡率 收集各組懸浮培養(yǎng)24 h后的細胞，Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染及流式細胞術檢測失巢凋亡率。PBS洗滌并收集細胞，加入1倍Annexin V上樣緩沖液制成1×106個/ml的細胞懸液，取100 μl細胞懸液，加入5 μl Annexin V-FITC，5 μl碘化丙啶(PI)，室溫下避光孵育15 min，加入上樣緩沖液后上機檢測。重復實驗3次。

1.2.5 Calcein AM/EthD-1熒光雙染法檢測失巢凋亡 轉染后各組懸浮培養(yǎng)24 h的細胞，每孔分別加入1 μl Calcein AM(500×)和1 μl EthD-1(500×)，37℃孵育30～60 min，熒光倒置顯微鏡下觀察。Calcein AM呈綠色熒光，檢測活細胞的存在。EthD-1呈紅色熒光，檢測失巢凋亡細胞的存在。應用Image J軟件進行細胞熒光強度的測定及分析。

1.2.6 軟瓊脂集落培養(yǎng)實驗 軟瓊脂培養(yǎng)皿分為兩層，底層軟瓊脂濃度為0.5%，上層軟瓊脂濃度為0.3%。轉染48 h后收集細胞，制成密度為10×104個/ml的細胞懸液，取100 μl鋪于軟瓊脂覆蓋的培養(yǎng)皿中，在37℃、5% CO2條件下孵育14 d，倒置顯微鏡下觀察細胞集落的形態(tài)和數目，每組樣品隨機拍攝5個視野，統(tǒng)計集落數，重復實驗3次。

1.2.7 細胞免疫熒光檢測 失巢培養(yǎng)24 h后收集細胞懸液，稀釋濃度至15×104個/ml，取1 ml懸液鋪于共聚焦培養(yǎng)皿中，再加入1 ml培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。第二天棄掉培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定30 min，棄掉甲醛用PBS漂洗；0.2%Triton室溫30 min進行細胞透化；5%BSA封閉60 min后棄掉液體；一抗β-catenin(1∶200)孵育，4℃過夜。PBS漂洗3次，二抗紅色熒光RRX標記IgG(1∶50)室溫避光孵育45 min，洗去二抗，加入DAPI染核(200 μl/皿)，室溫10 min，PBS漂洗后置于倒置熒光顯微鏡下拍照。

1.2.8 Western印跡檢測 提取各組細胞總蛋白測量濃度并定量。一抗為SFRP1(1∶500)，β-catenin(1∶200)；β-actin (1∶1 000)。二抗為羊抗鼠IgG(1∶5 000)，羊抗兔IgG(1∶5 000)。10% SDS-PAGE電泳，電泳分離后將蛋白電濕轉至硝酸纖維素膜(PVDF)上，5% 過濾脫脂奶封閉1 h，4℃一抗孵育過夜，TBST洗3遍，每次10 min。加入HRP標記的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜30 min，ECL發(fā)光顯色。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS23.0軟件，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。

2 結 果

2.1 SFRP1 siRNA轉染對GES-1細胞SFRP1 mRNA和蛋白表達的影響 針對SFRP1不同位點的3組SFRP1 siRNA及對照組Control siRNA分別轉染GES-1細胞。與對照組設為1比較，siRNA-612組(0.47±0.09)及siRNA-891組SFRP1 mRNA表達(0.31±0.13)均明顯降低(P<0.01)。siRNA-740組sFRP1 mRNA相對表達量為0.89±0.09。Western印跡結果顯示，siRNA-891組SFRP1蛋白表達水平明顯降低(圖1)。提示SFRP1 siRNA-891成功轉染GES-1細胞，顯著下調SFRP1基因和蛋白表達。后續(xù)實驗選用siRNA-891進行。

2.2 降低SFRP1表達對GES-1細胞失巢凋亡的影響 流式細胞術結果顯示，siRNA-891組細胞失巢凋亡率〔(13.80±2.66)%〕較對照組〔(27.85±5.25)%〕明顯降低(P<0.05)。

Calcein AM/EthD-1熒光雙染法檢測發(fā)現，與對照組〔EthD-1:(21.98±9.18)%,Calcein AM:(11.63±0.68)%〕比較，siRNA-891組EthD-1紅色熒光染色的失巢凋亡細胞數目〔(6.64±1.42)%〕明顯減少，Calcein AM綠色熒光染色的存活細胞數目〔(32.10±7.88)%〕明顯增多(圖2)。Calcein AM和EthD-1熒光值分析顯示，siRNA-891組較對照組有顯著差異(P<0.05)。

圖1 SFRP1 siRNA轉染對GES-1細胞SFRP1蛋白表達的影響

圖2 Calcein AM/EthD-1熒光雙染法檢測GES-1細胞失巢凋亡的變化(×20)

2.3 降低SFRP1表達對細胞非錨定生長的影響 siRNA-891組與對照組相比，細胞集落明顯變大，細胞集落數量明顯增多〔對照組(13.3±4.04)個，siRNA-891組(25.67±2.08)個，P<0.05〕。見圖3。

圖3 SFRP1 siRNA轉染對GES-1細胞非錨定生長的影響(×20)

2.4 降低SFRP1表達對細胞內β-catenin蛋白定位及表達的影響 與對照組比較，siRNA-891組β-catenin在細胞核中表達明顯增強。Western印跡結果顯示，siRNA-891組β-catenin蛋白表達水平較對照組明顯增加。上述結果提示，降低SFRP1表達后Wnt通路激活，其通路中關鍵因子β-catenin表達增加(圖4)。

A:1,DAPI標記細胞核；2,β-catenin-RRX熒光標記；3,1和2的重疊影像;B:β-catenin蛋白表達結果圖4 SFRP1 siRNA轉染對GES-1細胞β-catenin蛋白表達及定位的影響(×20)

2.5 降低SFRP1表達對β-catenin靶基因c-Myc 和 CyclinD1表達的影響 與對照組(1.00±0.00)相比，siRNA-891組c-Myc mRNA(5.55±0.52)和CyclinD1 mRNA(2.48±0.22)表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

3 討 論

正常細胞依附ECM而存活稱為錨定依賴。當正常上皮細胞與ECM失去黏附后，細胞與基質相互作用消失，發(fā)生失巢凋亡。這種特殊的細胞死亡形式對于維持機體組織結構至關重要。腫瘤細胞可在錨著不依賴的條件下存活，獲得失巢凋亡抗性，進而發(fā)生遷移，侵入ECM，通過血液循環(huán)擴散到其他組織中增殖。因此，研究失巢凋亡的發(fā)生對揭示腫瘤轉移的機制有重要意義。失巢凋亡與胃癌的關系近年來受到關注。有報道，促進腫瘤侵襲轉移的基因DBC1，α-fetoprotein，Claudin-1可阻止胃癌細胞發(fā)生失巢凋亡〔5～7〕。但抑制腫瘤發(fā)展基因的表達與胃癌失巢凋亡的關系尚未見報道。

SFRPs 屬于分泌型糖蛋白家族，約有300個氨基酸，稱為分泌型卷曲相關蛋白。目前發(fā)現SFRP家族有7個成員，分別是SFRP1、SFRP2、SFRP3、SFRP4、SARP3、sizzled及crescent,其中SFRP1在多種惡性腫瘤組織中呈低表達或表達缺失。Zhang等〔2〕研究發(fā)現，SFRP1表達缺失存在于原發(fā)性胃癌，并且與SFRP1高甲基化密切相關。Cheng等〔3〕發(fā)現SFRP1的表達缺失促進胃癌發(fā)生淋巴轉移。有報道人乳腺上皮細胞中SFRP1表達抑制促進細胞發(fā)生上皮間質轉化，并獲得局部浸潤和遷移的特性〔8〕。肝癌細胞中過表達SFRP1可降低細胞的增殖力和遷移力〔9〕。但SFRP1表達沉默在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機制仍不十分清楚，SFRP1基因對胃上皮細胞或胃癌細胞失巢凋亡的影響尚未見報道。本課題組在前期研究中報道了GES-1為失巢凋亡敏感細胞〔4〕，本研究結果提示抑制SFRP1基因表達后，GES-1細胞失巢凋亡敏感性下降，進而易獲得失巢凋亡抵抗的能力。細胞的錨定不依賴性生長也可通過軟瓊脂集落實驗檢測。有報道軟瓊脂形成集落數目越多，細胞侵襲能力越強〔10〕。單個細胞集落形成狀況反映了細胞抵抗失巢凋亡能力的高低〔11〕。本研究發(fā)現轉染SFRP1siRNA抑制SFRP1表達后，GES-1細胞集落形成數目顯著增多。上述結果證實抑制SFRP1基因表達使正常胃黏膜上皮細胞失巢凋亡敏感性顯著下降，SFRP1的表達對于維持胃黏膜上皮細胞失巢凋亡特性具有重要作用，提示胃癌中SFRP1表達缺失可能參與介導細胞獲得失巢凋亡抗性。

Wnt信號通路在細胞增殖、分化和凋亡中起重要作用，蛋白通過自分泌或旁分泌作用與位于細胞膜上的Fz受體結合，通過其下游蛋白的磷酸化與去磷酸化過程來完成Wnt信號途徑的傳遞。Wnt通路的異?；罨c腫瘤形成密切相關，影響腫瘤的侵襲轉移〔12，13〕。有研究發(fā)現，胰腺癌細胞中Wnt2的異常表達抑制細胞的失巢凋亡，在體內促進腫瘤轉移的發(fā)生〔14〕。SFRP1基因結構與Fz受體相似度可達30%～50%，具有同源的配體抑制區(qū)，故SFRP1可競爭性抑制Fz受體，阻止Wnt與Fz結合或與Fz結合但形成無功能復合物，從而阻斷Wnt通路激活〔15，16〕。

Wnt通路激活時，胞質中的β-catenin不被降解并持續(xù)活化，在細胞核中積聚，在細胞失巢凋亡抵抗中發(fā)揮重要作用〔17〕。Cho等〔18〕研究發(fā)現，肺癌細胞中抑制SFRP1表達后，Wnt通路被激活，β-catenin表達增高。Gauger等〔8〕在乳腺上皮細胞中抑制SFRP1表達，發(fā)現β-catenin表達增高，從細胞質移位到細胞核并積聚。本研究得出相似的結果，發(fā)現失巢培養(yǎng)的GES-1中抑制SFRP1表達后，細胞核中β-catenin表達明顯增多，β-catenin蛋白表達升高；抑制SFRP1表達后，c-Myc和cyclin-D1基因表達顯著增高。Dai等〔19〕報道沉默c-Myc表達促進牙周韌帶細胞發(fā)生失巢凋亡。Jiang等〔9〕發(fā)現肝癌細胞中過表達SFRP1可降低CyclinD1表達，抑制細胞侵襲轉移。提示β-catenin的靶基因c-Myc和CyclinD1參與細胞失巢凋亡的調控，與本研究結果一致。

綜上所述，本研究首次發(fā)現抑制SFRP1基因表達可降低EGS-1對失巢凋亡的敏感性，激活Wnt通路，β-catenin及其靶基因表達增高可能是其作用機制。本研究為SFRP1在胃癌發(fā)展中的作用及機制研究提供了新的思路和理論依據，提示SFRP1表達沉默誘導正常細胞獲得失巢凋亡抵抗的能力。