朱佩茹 楊喆 楊麗云 李海燕 李小紅 李榮麗

(河南省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450003)

宮頸癌是女性最高發(fā)的惡性腫瘤之一〔1，2〕。根治性手術(shù)及放療可顯著延長(zhǎng)患者生存期〔3〕，但其病因不清楚，新的治療靶點(diǎn)仍有待研究。CARMA3是新型接頭蛋白，在G蛋白耦聯(lián)受體(GPCR)激活核因子(NF)-κB通路過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔4〕。然而CARMA3在宮頸癌中的表達(dá)及臨床意義尚不清楚。本研究擬分析CARMA3在宮頸癌組織中的表達(dá)及其與宮頸癌患者臨床病理特征及生存的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象 收集2009年1月至2012年12月于河南省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科接受宮頸癌根治術(shù)且術(shù)后病理顯示為宮頸癌患者的腫瘤組織及癌旁組織標(biāo)本45例，≤40歲28例，>40歲17例；腫瘤直徑>4 cm 25例，≤4 cm 20例；分化程度：低分化18例，中/高分化27例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例；國(guó)際婦產(chǎn)科協(xié)會(huì)(FIGO)分級(jí)：Ⅰ～Ⅱ級(jí)21例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)24例。組織標(biāo)本收取后蠟塊包埋儲(chǔ)存于病理科。入組患者在術(shù)后3個(gè)月后開(kāi)始隨訪記錄，術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療。本研究經(jīng)河南省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，入組患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 材料 反轉(zhuǎn)錄、RNA提取試劑盒、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(QPCR)試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司。液氮灌、細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Thermo公司，PCR儀購(gòu)于美國(guó)ABI公司，高速離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 生物信息學(xué)分析 利用GEPIA網(wǎng)站(http：//gepia.cancer-pku.cn/) 分析醫(yī)學(xué)癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)(TCGA)中宮頸鱗狀細(xì)胞癌及癌旁組織中CARMA3〔即含有半胱天冬酶募集域的蛋白(CARD)10〕的表達(dá)，并分析CARMA3的表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1.4 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 石蠟組織RNA提取方法按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，石蠟切片加入1 ml裂解液裂解呈透明狀，12 000 r/min,4℃離心5 min，上清轉(zhuǎn)至一新離心管中，加入裂解液1/5體積的氯仿，用力振蕩至充分乳化，12 000 r/min,4℃離心15 min，吸取上清液至一新的離心管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒15次，靜置10 min，12 000 r/min,4℃離心15 min，棄去上清，加入75%的乙醇 1 ml，12 000 r/min,4℃離心5 min。所得沉淀加入20 μl去離子水，即為所需RNA。反轉(zhuǎn)錄采用10 μl體系，RNA定量后，取1 μl RNA，加入5倍PrimeScript RT master 2 μl，7 μl去離子水。輕柔混勻后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃。

1.5 QPCR 采用天根試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，配置PCR反應(yīng)液，PCR反應(yīng)采用25 μl體系，組分如下：SYBR premix Ex TaqⅡ 12.5 μl，CARMA3或β-actin正義鏈引物1 μl，CARMA3或β-actin反義鏈引物1 μl，實(shí)時(shí)定量產(chǎn)物2 μl，去離子水8.5 μl。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性 95℃ 30 s；擴(kuò)增95℃ 15 s，60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后樣品4℃保存。CARMA3引物正義序列：5′-TCTTCCACCGTTGCCAATCT-3′；反義序列：5′-TTCGCCTGCCAGGAACATC-3′。β-actin引物正義序列：5′-CGTCTTCCCCTCCATCGT-3′；反義序列為：5′-GAAGGTGTGGTGCCAGATTT-3′。 CARMA3相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt表示，ΔΔCT=(CT CARMA3-CT β-actin) 待測(cè)樣本-(CT CARMA3-CT β-actin) 校準(zhǔn)樣本。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0進(jìn)行t檢驗(yàn)、Spearman秩相關(guān)分析及Kaplan-Meier(K-M)生存曲線分析。

2 結(jié) 果

2.1 TCGA中CARMA3在宮頸癌組織中的表達(dá) CARMA3在306例宮頸癌組織中的表達(dá)水平為3.277±2.713，13例正常宮頸組織中的表達(dá)水平為2.745±0.471，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.510 9，P=0.105)。CARMA3高表達(dá)的宮頸癌患者(146例)生存周期低于低表達(dá)者(146例)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.68，HR=0.91)，見(jiàn)圖1。

2.2 宮頸癌及癌旁組織中CARMA3 mRNA的表達(dá) 宮頸癌組織中CARMA3 mRNA表達(dá)水平為6.367±3.384，癌旁組織為1.617±0.689，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.311，P=0.017)。

2.3 CARMA3的表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)CARMA3在宮頸癌中的相對(duì)表達(dá)水平，利用X-tile軟件確定最佳分界點(diǎn)為5.143，將宮頸癌患者分為CARMA3高表達(dá)組(n=27)及低表達(dá)組(n=18)，Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，CARMA3的表達(dá)水平與宮頸癌患者FIGO分級(jí)(Ⅰ～Ⅱ級(jí)高表達(dá)7例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)20例；r=0.814，P=0.013)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(有轉(zhuǎn)移高表達(dá)19例，r=0.768，P=0.019，表1)呈正相關(guān)，而與年齡(≤40歲高表達(dá)16例，>40歲11例)、腫瘤直徑(>4 cm高表達(dá)14例，≤4 cm 13例)、分化程度(低分化高表達(dá)12例，中/高分化15例)無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。

2.4 CARMA3的表達(dá)與宮頸癌患者術(shù)后5年總體生存率的關(guān)系 CARMA3高表達(dá)組術(shù)后5年總體生存率顯著低于低表達(dá)組(χ2=4.306，P=0.038，圖2)。

圖1 TCGA中CARMA3在宮頸癌中的表達(dá)

3 討 論

生物信息學(xué)是生命科學(xué)研究的重要工具〔5〕。由于TCGA數(shù)據(jù)來(lái)源于各文章中所提供的測(cè)序數(shù)據(jù)，因此樣本間差異較大，很難在統(tǒng)計(jì)學(xué)上獲得較為理想的結(jié)果。此外，因TCGA的數(shù)據(jù)多來(lái)源于歐美，研究對(duì)象病理特征與我國(guó)宮頸癌患者存在較大差異。

CARMA3作為細(xì)胞支架蛋白，可在表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和GPCR的誘導(dǎo)下，與下游信號(hào)分子B細(xì)胞淋巴瘤因子(Bcl)10和黏膜相關(guān)淋巴組織因子(MALT)1組成復(fù)合體，并進(jìn)一步活化I-κB激酶(IKK)〔6〕。而在IKK的誘導(dǎo)下，I-κB降解，從而活化NF-κB〔4，7〕。既往研究顯示，宮頸癌進(jìn)展過(guò)程中NF-κB信號(hào)通路持續(xù)性活化〔8〕。而NF-κB的表達(dá)水平與宮頸癌的分級(jí)亦呈正相關(guān)〔9〕，提示NF-κB在宮頸癌進(jìn)展過(guò)程中扮演癌基因的角色。Nair等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸組織從正常到癌前病變?cè)俚桨┙M織的過(guò)程中，NF-κB在細(xì)胞核中的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。研究顯示，NF-κB與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3、Sma和Mad相關(guān)蛋白(SMAD)3等轉(zhuǎn)錄因子之間存在復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制〔11〕。NF-κB與STAT協(xié)同作用而調(diào)控大量的抗凋亡基因、細(xì)胞周期調(diào)控基因、編碼細(xì)胞因子及趨化因子基因〔12〕。此外，NF-κB通過(guò)活化環(huán)氧化酶(COX)-2而促進(jìn)宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及放療抵抗〔13〕。因此推測(cè)CARMA3可能通過(guò)NF-κB，并激活NF-κB下游信號(hào)通路，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及進(jìn)展。

綜上，CARMA3在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)，并與宮頸癌FIGO分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)，是宮頸癌潛在的分子治療靶點(diǎn)。