陳昌喆 宋晨曦 李彬 張冬 張睿 竇克非

(1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院，北京 100029；2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 國家心血管病中心 阜外醫(yī)院；3壽光市人民醫(yī)院)

細(xì)胞在生物氧化代謝過程中會產(chǎn)生活性氧(ROS)，并可被體內(nèi)的抗氧化劑如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等清除。但在病理狀態(tài)下，累積的ROS會損傷細(xì)胞內(nèi)的DNA、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)等，從而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)并改變細(xì)胞功能。過氧化氫(H2O2)是ROS之一，為最常見的用來誘導(dǎo)細(xì)胞早期衰老的化合物，這與其能夠誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)有很大的關(guān)系〔1,2〕。白黎蘆醇(RSV)是一種具有強(qiáng)生物活性的天然多酚類物質(zhì)，主要來源于葡萄(紅葡萄酒)等植物〔3〕。研究表明，RSV具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤〔4,5〕及心血管保護(hù)等多種生物學(xué)作用。目前有研究發(fā)現(xiàn)，RSV不僅可以抑制血小板聚集或黏附，降低血小板的氧化應(yīng)激，還可以防止低密度脂蛋白氧化，抑制血管平滑肌細(xì)胞(SMC)增殖或肥大〔6,7〕。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，RSV可通過抑制SMC線粒體中ROS的產(chǎn)生而發(fā)揮其抗衰老及血管保護(hù)作用〔8,9〕。而在動物模型中，RSV可加快受損動脈的再內(nèi)皮化速率、減少新生內(nèi)膜過度增生〔10〕。在多種心血管疾病中，內(nèi)皮細(xì)胞均可處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，進(jìn)而使細(xì)胞功能受損，而RSV是否能改善氧化應(yīng)激環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞的功能尚無定論。本實(shí)驗(yàn)擬通過研究RSV對H2O2干預(yù)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)衰老、增殖，凋亡等相關(guān)生物學(xué)功能的影響，探討RSV對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 HUVECs細(xì)胞購自國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所)。胎牛血清、胰酶購自Gibco公司。RSV、H2O2及二甲基亞砜(DMSO)均購自Sigma公司。通用型組織/細(xì)胞β-半乳糖苷酶原位染色試劑盒(GMS10010.4)購自上海市杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。細(xì)胞周期檢測相關(guān)試劑：碘化丙啶/核糖核酸酶(PI/RNase)染色溶液(550825)購自美國BD公司。Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(AD10)購自上海東仁化學(xué)科技有限公司。P53小鼠抗人單克隆抗體(sc-126)購自美國 Santa Cruz Biotechnology公司。P21小鼠抗人單克隆抗體(#2946)、p-Rb(Ser780)兔抗人單克隆抗體(#9307)、p-AKT兔抗人單克隆抗體(#4060)、AKT(pan)兔抗人單克隆抗體(#4691)、p-Erk1/2兔抗人單克隆抗體(#4370)、Erk1/2兔抗人單克隆抗體(#4695)、Survivin兔抗人單克隆抗體(#2808)均購自美國CST公司。P16兔抗人單克隆抗體(ab108349)購自英國Abcam公司。GAPDH小鼠抗人單克隆抗體(60004-1-Ig)購自美國Proteintech Group公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 于37℃、5%CO2條件下，應(yīng)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞株，根據(jù)生長狀況每2～3 d換液一次，當(dāng)細(xì)胞長至70%～80%時可傳代，取處于對數(shù)生長期狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)并分組：①對照組；②H2O2組(100 μmol/L H2O2預(yù)處理2 h)；③H2O2+RSV組(100 μmol/L H2O2預(yù)處理2 h后加用50 μmol/L RSV共同孵育48 h)。

1.3 β-半乳糖苷酶染色 配置Genmed染色工作液：GENMED染色原液(-20℃保存)于冰上融化，在15 ml離心管中加入3.8 ml Genmed稀釋液及200 μl Genmed染色液?；靹蚝笾糜?7℃水浴預(yù)熱并標(biāo)記為Genmed工作液。將各組待測細(xì)胞均勻鋪在24孔板中，待細(xì)胞貼壁后吸棄各孔培養(yǎng)基，并在每孔中加入500 μl Genmed清理液，清洗細(xì)胞表面后吸棄清理液。然后每孔加入500 μl Genmed固定液覆蓋細(xì)胞表面，室溫孵育5 min后棄固定液。每孔加入500 μl Genmed酸性液清洗后吸棄。每孔加入500 μl預(yù)先配制的Genmed染色工作液，覆蓋培養(yǎng)皿中細(xì)胞表面，將培養(yǎng)皿置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育16 h，待細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色后取出，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、顏色并計數(shù)，其中呈現(xiàn)藍(lán)色即表達(dá)β-半乳糖苷酶的細(xì)胞為衰老細(xì)胞。統(tǒng)計并分析各組細(xì)胞，每組6個隨機(jī)視野，每個視野細(xì)胞總數(shù)100個以上，計算呈現(xiàn)藍(lán)色的衰老細(xì)胞比率。

1.4 長時程動態(tài)活細(xì)胞成像及分析系統(tǒng)檢測細(xì)胞增殖能力 胰酶消化培養(yǎng)皿中處于對數(shù)期生長的各組細(xì)胞，吸取細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為104個/ml。96孔板每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，每組設(shè)置6個平行孔，待細(xì)胞貼壁后將96孔板放置于IncuCyte Zoom培養(yǎng)箱中，設(shè)置增殖檢測程序，每6 h對培養(yǎng)過程中的細(xì)胞進(jìn)行拍照并記錄。待細(xì)胞融合度達(dá)到90%時，按照比例傳代，繼續(xù)使用增殖檢測程序?qū)Σ糠謧鞔蟮募?xì)胞進(jìn)行拍照并記錄，進(jìn)入下一周期動態(tài)檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對選定區(qū)域的照片進(jìn)行整理分析，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.5 細(xì)胞周期檢測 胰酶消化處于對數(shù)期生長的各組細(xì)胞，以制備單細(xì)胞懸浮液；取1×106個細(xì)胞置于15 ml離心管中，1 500 r/min離心5 min后棄掉上清。將細(xì)胞重懸于500 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)中，加入預(yù)冷的無水乙醇，邊加邊震蕩，加至2 ml即為固定細(xì)胞的乙醇終濃度(75%)，4℃保存過夜。第2天將固定的細(xì)胞1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入1 ml PBS懸浮細(xì)胞后再次離心并棄上清。加入PI/RNase染色液300 μl，混勻后避光室溫染色15 min。過濾后流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，Modifit軟件模擬檢測各組細(xì)胞周期情況。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測 胰酶消化處于對數(shù)期生長的各組細(xì)胞，棄上清后加入5 ml 1×PBS，將細(xì)胞移至15 ml管中，1 500 r/min 離心5 min，棄上清。加入2 ml 1倍上樣緩沖液重懸細(xì)胞，在FITC單染管中，各實(shí)驗(yàn)組分別加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻后于4℃避光條件下孵育15 min。在PI單染管中，各實(shí)驗(yàn)組分別加入10 μl PI，輕輕混勻后于4℃避光條件下孵育5 min，過濾后流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測并分析各組細(xì)胞凋亡情況。

1.7 Western印跡檢測與衰老、增殖及凋亡等相關(guān)蛋白的表達(dá) 取經(jīng)過處理的細(xì)胞，應(yīng)用RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，加入蛋白酶抑制劑置于冰上進(jìn)行裂解。用BCA法測定蛋白濃度，然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉1 h，滴加一抗4℃ 孵育過夜。電化學(xué)發(fā)光法發(fā)光、顯影、定影、拍照。Western印跡檢測細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白(p53,p21,p16和p-Rb)、與細(xì)胞增殖相關(guān)的p-AKT和p-ERK蛋白及凋亡抑制蛋白Survivin的表達(dá)情況。

1.8 統(tǒng)計分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 RSV對H2O2預(yù)處理后的HUVECs衰老的影響 和對照組〔(25.17±2.76)%〕相比，加入100 μmol/L的H2O2后，H2O2組中衰老細(xì)胞所占的比例明顯增多〔(75.02±4.23)%〕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)用50 μmol/L RSV處理細(xì)胞后，H2O2+RSV組中衰老細(xì)胞所占比例明顯減少〔(36.25±3.18)%〕，見圖1，提示RSV能夠逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老。

圖1 RSV對H2O2預(yù)處理HUVECs衰老的影響(β-半乳糖苷酶染色)

2.2 RSV對H2O2預(yù)處理后的HUVECs增殖及細(xì)胞周期的影響 和對照組相比，加入100 μmol/L的H2O2后，HUVECs細(xì)胞增殖明顯被抑制。當(dāng)加入50 μmol/L RSV后，H2O2+RSV組細(xì)胞增殖趨于正常狀態(tài)，相比于H2O2組，加入RSV后36 h后HUVECs細(xì)胞增殖能力明顯增高(P<0.05)，提示RSV能夠逆轉(zhuǎn)H2O2對 HUVECs細(xì)胞增殖的抑制作用。對細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，H2O2組G1期細(xì)胞所占比例明顯增多，而S期及G2/M期細(xì)胞所占比例相對減少，說明H2O2通過將細(xì)胞阻滯在G1而延緩細(xì)胞周期的進(jìn)展，當(dāng)HUVECs用RSV和 H2O2同時處理時，G1期細(xì)胞所占比例又恢復(fù)到對照組水平，說明RSV能夠逆轉(zhuǎn)H2O2對細(xì)胞周期的阻滯作用，見表1。

表1 RSV對H2O2預(yù)處理的HUVECs凋亡及細(xì)胞周期的影響

與H2O2組比較：1)P<0.05

2.3 RSV對H2O2預(yù)處理后的HUVECs凋亡的影響 流式細(xì)胞技術(shù)檢測，結(jié)果顯示，H2O2組能夠促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，而H2O2+RSV組中細(xì)胞凋亡程度降低，說明RSV能夠逆轉(zhuǎn)H2O2對細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，進(jìn)而抑制細(xì)胞的凋亡(見表1)。

2.4 RSV對H2O2預(yù)處理后的HUVECs相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 H2O2能夠上調(diào)HUVECs細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白(p53,p21,p16和p-Rb)的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的衰老。同時H2O2能夠抑制HUVECs細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白(p-AKT和pERK)及凋亡抑制蛋白Survivin的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖水平，并間接促進(jìn)細(xì)胞的凋亡水平(見圖2，3)。而加入RSV后可以逆轉(zhuǎn)上述H2O2的這些作用，與H2O2組相比，H2O2+RSV組各衰老相關(guān)蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白及凋亡抑制蛋白表達(dá)升高。

1～3：對照組、H2O2組、RSV+H2O2組圖2 各組蛋白Western印跡檢測

1～9：p53,p21,p16,p-Rb,p-Akt,p-ERK,ERK,Survivin圖3 H2O2及RSV對HUVECs細(xì)胞衰老、增殖及凋亡相關(guān)蛋白的影響

3 討 論

ROS是常規(guī)有氧代謝的副產(chǎn)物。生理?xiàng)l件下ROS的生成與清除處于動態(tài)平衡，多個信號級聯(lián)反應(yīng)參與了這一平衡調(diào)節(jié)〔11〕。當(dāng)失去上述平衡時，ROS水平急劇增加，并且建立氧化應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部成分和結(jié)構(gòu)受損并引起細(xì)胞功能變化〔12〕。此外，作為重要的信息分子，ROS通過對蛋白質(zhì)的氧化修飾對細(xì)胞生長、凋亡和衰老等細(xì)胞功能進(jìn)行調(diào)節(jié)〔13〕。 因此，ROS在細(xì)胞功能的激活過程中扮演著重要角色，在生理和病理生理過程中均起著關(guān)鍵作用〔14〕。

細(xì)胞生長是細(xì)胞尺寸或體積變大的過程，在增殖的細(xì)胞中，生長可以被細(xì)胞分裂所平衡。當(dāng)細(xì)胞周期被阻斷后，細(xì)胞生長不能被細(xì)胞分裂所補(bǔ)償，結(jié)果是細(xì)胞體積不再變大，細(xì)胞從生長的過程轉(zhuǎn)變成衰老狀態(tài)。細(xì)胞衰老與細(xì)胞的靜止?fàn)顟B(tài)不同，細(xì)胞衰老是一種復(fù)制性的細(xì)胞死亡，是一種不可逆的增殖狀態(tài)的停滯〔15〕，而細(xì)胞靜止是一種跟生長因素有關(guān)的細(xì)胞周期的靜止，理論上認(rèn)為有絲分裂的刺激能加強(qiáng)細(xì)胞衰老的過程〔16〕。

研究證實(shí)，細(xì)胞衰老與多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。其中，p53/p21及p16(INK4a)/pRb調(diào)控的信號通路起到了關(guān)鍵作用。細(xì)胞周期是一個復(fù)雜的過程，周期素通過活化周期素依賴性激酶(CDK)來調(diào)控細(xì)胞周期的蛋白家族，二者在細(xì)胞周期的調(diào)控中起到了核心作用。其中，G1/S期過渡受周期素D/CDK4/6的調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2可使細(xì)胞內(nèi)源性β-半乳糖苷酶積聚，表明H2O2可誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞衰老。同時，H2O2還可使HUVECs中衰老相關(guān)蛋白p53、p21、p16、pRb的表達(dá)增多。其機(jī)制與H2O2所致的氧化應(yīng)激環(huán)境中，細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷有關(guān)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)DNA損傷時會使p53活化，p53通過刺激p21、p16轉(zhuǎn)錄而使p21及 p16蛋白表達(dá)增多。p21為CDK抑制劑，可阻斷cyclinE-CDK2和細(xì)胞周期蛋白CDK4/6復(fù)合物的活性，阻止細(xì)胞周期的G1期進(jìn)展至S期。而p16為細(xì)胞周期的基本基因，為CDK抑制因子(CKI)INK4家族成員之一，直接參與細(xì)胞周期的調(diào)控。p16蛋白可通過抑制細(xì)胞周期依賴性激酶 CDK4/6 與細(xì)胞周期蛋白 D的結(jié)合，從而抑制pRb 蛋白的磷酸化，致使細(xì)胞周期阻滯在G1期，最終導(dǎo)致生長阻滯〔17,18〕。因此，H2O2的促衰老作用與p53/p21及p16(INK4a)/pRb信號通路激活有關(guān)。而RSV可抑制p53、p21、p16、pRb蛋白的表達(dá)，提示，RSV可通過抑制p53/p21及p16(INK4a)/pRb信號通路拮抗H2O2所致細(xì)胞衰老，對氧化應(yīng)激環(huán)境中的HUVECs細(xì)胞具有保護(hù)作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，H2O2能夠抑制HUVECs的增殖，而RSV可以拮抗H2O2對HUVECs細(xì)胞增殖的抑制作用，此過程可能與細(xì)胞增殖相關(guān)的p-AKT和p-ERK兩種蛋白的激活有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，H2O2可誘導(dǎo)HUVECs凋亡，其機(jī)制與抑制抗凋亡蛋白Survivin的表達(dá)有關(guān)，而RSV對H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有抑制作用。