吉金雨 郭哲 黃亞光 陶薇 梅志剛 馮知濤

三峽大學醫(yī)學院（湖北宜昌443002）

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的慢性自身免疫性疾病，整個發(fā)病過程包括慢性滑膜炎的產(chǎn)生、滑膜增生以及血管翳的形成和最終軟骨及骨的破壞［1］。破骨細胞（osteocalst，OC）是導致RA 骨破壞的主要原因，大量細胞因子參與其分化和成熟［2］。IL-1、IL-6、TNF-α、IL-17 等通過上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL）的表達來促進OC 分化，核轉(zhuǎn)錄因子κB 受體活化因子（receptor activator of nuclear factor kappa B，RANK）和RANKL 結(jié)合后，激活NF-κB 信號通路，直接或間接通過絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）、活化T 細胞核轉(zhuǎn)錄因子c1（nuclear factor of activated T cells，cytoplasmic 1，NFATc1）、janus 激酶/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子（Janus kinase/signel transducers and activators of transcription，JAK/STAT）、Ca2+等信號通路表達成熟OC 的特定基因［1］。抑制OC 分化和成熟，防止RA 骨破壞發(fā)生，是治療RA 的主要途徑之一。臨床常用藥物有IL-1 受體拮抗劑阿那白滯素（anakinra）、IL-6 受體拮抗劑托珠單抗（tocilizumab）、TNF 拮抗劑英夫利昔（infliximab）、IL-17 抑制劑蘇金單抗（secukinumab）、RANKL 抑制劑狄諾塞麥（denosumab）［3］等，雖然對RA 關(guān)節(jié)破壞有良好的療效，但因其價格昂貴和副作用較大而難以推廣運用。青藤堿（sinomenine，SIN）是在中國傳統(tǒng)中藥青風藤中提取的一種生物堿單體，是青風藤中的主要有效成分。自1921年，ISHIWARI 首次從日本清風藤提出SIN，至今已有近百年的研究歷史?，F(xiàn)代研究表明，SIN 有著良好的抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫抑制和較低的毒副作用，對于RA 的治療也有一定的療效［4-6］。然而，目前國內(nèi)外關(guān)于SIN 治療RA骨破壞的治療僅建立在SIN 與細胞因子或信號通路蛋白活性的基礎上，對SIN 通過抑制OC 分化從而達到RA 骨破壞的治療卻少有描述［7-9］。因此，本文主要從SIN 及其制劑抑制細胞因子及與OC 分化相關(guān)信號通路兩方面綜述SIN 抑制RA 骨破壞的作用機制，為SIN 臨床用藥或配伍用藥提供理論依據(jù)。

1 RA 骨破壞

骨破壞是RA 最典型的病理特征之一，在RA早期診斷時就已出現(xiàn)，超過10%的患者在疾病發(fā)作8 周后會出現(xiàn)，超過60%的患者在一年后出現(xiàn)［10］。骨破壞在時間上對關(guān)節(jié)的進行性破壞還會導致后期的功能障礙，影響著RA 患者的生存質(zhì)量［11］。正常骨處于一個動態(tài)平衡，由OC 對骨基質(zhì)的脫礦化和成骨細胞（osteoblast，OB）礦化骨基質(zhì)組成。破骨細胞前體（osteoclast precursor，OCP）會在RANK 和RANKL 結(jié)合后分化為成熟的OC，巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）可以促進OCP 的RANK 表達，RANKL 主要由OB 形成，骨保護素（osteoprotegerin，OPG）作為RANKL 誘餌受體抑制其與RANK 結(jié)合。成熟的OC 可以分泌降解骨基質(zhì)的酶：耐酒石酸性磷脂酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）、組織蛋白酶K（cathepsin K，CtsK）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）和降鈣素受體［3］。在RA 中，大量的OC 導致了骨破壞的產(chǎn)生［12］，見圖1。

圖1 OC 分化Fig.1 Osteoclast differentiation

2 SIN 抑制OC 分化相關(guān)細胞因子

細胞因子是OC 分化的重要影響因素之一，TNF-α、IL-1、IL-6、IL-17 等對OC 分化的影響主要表現(xiàn)在上調(diào)RANKL 的表達［13-16］。另有研究表明，TNF-α、IL-1 促進OC 分化還與增加RANKL/OPG 比率有關(guān)［17-18］。此外，TNF-α 和IL-17 還可上調(diào)OCP的RANK 水平［19］。IL-17 作為近幾年研究的熱點，在其促進RANK 表達的同時，還可協(xié)同增加TNFα、IL-1 和IL-6 的水平［2］。

SIN 其二價結(jié)構(gòu)修飾物SND-117 以及以SIN 為主要成分的中成藥正清風痛寧在臨床治療骨破壞都有較好的療效［20-21］。其對骨破壞的主要影響表現(xiàn)在降低對膠原誘導型關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠以及RA 患者血清中細胞因子TNF-α、IL-1、IL-6 和IL-17 的水平［20，22］。這提示，SIN 可降低TNF-α、IL-1、IL-6、IL-17 的水平從而抑制OC 分化從而防止RA 骨破壞。另有研究將100名患者分為兩組，對照組采用美洛昔康加甲氨蝶呤（methotrexate，MTX），觀察組在此基礎上加服SIN，結(jié)果顯示，觀察組IL-1、IL-6、TNF-α 的水平均低于對照組［23］。SUN 等［24］研究發(fā)現(xiàn)，SIN 和MTX的聯(lián)合用藥可以降低佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠體內(nèi)RANKL、IL-6、IL-17 和MMPs的表達，阻止OC 的形成和活化從而延緩骨質(zhì)破壞。此外，SIN 與針刺的聯(lián)合治療可降低TNF-α、IL-1、IL-6、MMP-9 的表達水平［25］。上述研究均提示，SIN 的聯(lián)合用藥可能通過降低TNF-α、IL-1、IL-6和IL-17 的水平從而抑制RA 骨破壞的產(chǎn)生。

3 SIN 抑制OC 相關(guān)信號通路

OC 分化不僅取決于細胞因子，而且受到其相關(guān)信號通路的影響。目前發(fā)現(xiàn)影響OC 分化的信號通路有RANK/RANKL/OPG、NFATc1、NF-κB、Ca2+、MAPK 和JAK/STAT 信號通路等，SIN 可通過抑制這些信號通路的活性從而降低RA 骨破壞的產(chǎn)生，見圖2。

3.1 RANK-RANKL-OPG 信號通路RANKL 正常情況下是以OB 表達為主，在RA 中主要是滑膜成纖維細胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）和免疫細胞表達。OPG 作為RANKL 的誘餌受體，主要由OB 表達［26］。既往研究表明，OCP 主要是在M-CSF 和RANKL 的共同刺激下，通過RANKRANKL-OPG 信號通路向OC 分化的［27］。正常情況下，RANK 和RANKL 結(jié)合會誘導OC 分化，多余的RANKL 與OPG 結(jié)合，RANKL/OPG 處在一個相對穩(wěn)定的水平；然而在TNF-α、IL-1、IL-6 的刺激下，RANKL/OPG 的比例上調(diào)，OC 分化的數(shù)量會增加［28-29］。研究結(jié)果表明，SIN 可上調(diào)RANKL/OPG比例抑制骨髓源性的間充質(zhì)干細胞向OC 分化從而降低骨破壞的產(chǎn)生［30］。

圖2 SIN 抑制OC 分化信號通路Fig.2 Sinomenine supresses osteoclast differentiation by inhibiting osteoclast-related pathways

3.2 NF-κB 信號通路RANK 和RANKL 結(jié)合后，導致RANK 和TRAF6 形成三聚體，通過分泌I-κB激酶（I-κB kinase，IKK）誘導κB 抑制蛋白（inhibitory κB proteins，I-κB）的磷酸化，從而導致NF-κB 入核［31-32］。研究表明，SIN 可抑制完全弗氏佐劑誘導的炎癥小鼠中NF-κB 的活性從而延緩炎癥的進展［33］。此外，WANG 等［34］研究發(fā)現(xiàn)，在CIA 大鼠模型中，SIN 可上調(diào)FLS 中I-κB 的表達，從而抑制NF-κB 的結(jié)合活性以及遷移從而達到治療的效果。上述結(jié)果提示，SIN 可通過降低NF-κB 信號通路的活性從而抑制RA 骨破壞。

3.3 NFATc1 信號通路NFATc1 是誘導OC 分化的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，其可誘導OC 特定基因如TRAP、降鈣素受體、CtsK 的形成［27］。最近的研究表明，NFATc1 的活化主要通過NF-κB 和Ca2+通路。RANKL 誘導NF-κB 激活后，激活轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-1（activator protein-1，AP-1）會與NFATc1 結(jié)合，繼而共同調(diào)控OC 相關(guān)基因。Ca2+通路是NFATc1 誘導OC 分化的另一條通路。鈣調(diào)磷酸酶（calcineurin，CaN）通過對NFATc1 氨基末端調(diào)控域的去磷酸化特異性激活NFATc1［35］。最近的研究表明，SIN 可抑制人外周血單核細胞向OC 分化時細胞NFATc1 mRNA 的表達和轉(zhuǎn)錄活性，同時抑制NF-κB 的活化和TRAP、MMP-9、CtsK 的表達，降低了細胞內(nèi)Ca2+水平［36］。此外，SIN 還可通過抑制RA 患者NFATc1 的蛋白活性從而達到降低RA 骨破壞的產(chǎn)生［37］。上述結(jié)果提示，SIN 可通過降低NFATc1 信號通路的活性從而抑制RA 骨破壞。

3.4 MAPK 信號通路MAPK 主要由細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、c-Jun 氨基末端激酶（jun N-terminal kinase，JNK）、p38 組成［38］，在OC 分化和存活中有重要意義。AP-1 是C-fos 和Jun 蛋白組成的一個復合體，TNF 和TNFR1 結(jié)合后，會激活MAPK 將信號傳遞給AP-1，繼而引起AP-1 與NFATc1 結(jié)合，最終導致OC 活化［39］。LI 等［40］研究發(fā)現(xiàn)，SIN 可降低MAPK中的p38 和JNK 的磷酸化，但對ERK1/2 的磷酸化并不明顯。

4 結(jié)語與展望

OC 作為唯一的骨吸收細胞，在RA 骨破壞中起著關(guān)鍵性作用。在RA 活動期的病理微環(huán)境中，TNF-α、IL-1、IL-6、IL-17 等細胞因子可上調(diào)OCP 的RANKL 表達，RANKL 和RANK 結(jié)合后，直接或間接通過NF-κB、NFATc1、Ca2+、MAPK、JAK/STAT 信號通路誘導OC 分化從而導致骨破壞。SIN 及制劑一方面可通過抑制TNF-α、IL-1、IL-6、IL-17 等細胞因子的表達以及RANKL 下游CtsK 和MMP-9 的表達；另一方面，其可增加RANKL/OPG 的比例，阻斷TRAF6 抑制NF-κB，降低JNK 和p38 的磷酸化和NFATc1 的表達，進而抑制OC 分化和成熟，抑制RA 骨破壞的進展。本文主要通過以上幾個方面綜述表明SIN 確實可作為RA 的指導臨床用藥，并有一定的療效；其次，闡明SIN 抑制RA 骨破壞的機制，為臨床指導用藥或配伍用藥提供理論依據(jù)。然而，關(guān)于SIN 及其制劑抑制RA 骨破壞的研究有以下幾點不足之處：（1）盡管研究報道SIN 及其制劑可以抑制TNF-α、IL-1、IL-6、IL-17 等細胞因子的水平，但是大多數(shù)研究設計不嚴謹，細胞因子水平降低與骨破壞之間缺乏直接證據(jù)；（2）SIN 及其制劑是否能降低磷酸化的STAT 表達從而抑制OC 分化尚未闡明；其是否能通過PLYγ 調(diào)節(jié)Ca2+的濃度從而抑制NFATc1 的活性，并且其在抑制NFATc1 活性的同時，和其他信號通路之間是否有直接或間接關(guān)系亦尚未明確；免疫受體酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）作為RANK 的協(xié)同信號對OC 分化亦起著至關(guān)重要的作用，SIN 及制劑是否能通過抑制DNAX 活化蛋白12（DNAX-activating protein 12，DAP12）和Fc 受體γ 亞基（Fc receptor common γ subunit，F(xiàn)cRγ）信號的表達從而降低RA 骨破壞亦尚未闡明。（3）臨床研究中，循證醫(yī)學證據(jù)顯示出SIN 及其制劑具有較好的治療RA 作用，但是關(guān)于RA 骨破壞方面缺乏影像學資料以及循證醫(yī)學依據(jù)?？偟膩碚f，RA 骨破壞的原因較為復雜，涉及到大量細胞因子和信號通路的相互交錯，有關(guān)SIN治療RA 骨破壞的有效靶點值得進一步深入探討。