王芳 潘茂興，2 蔡三金 梅志剛 馮知濤，2

1三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理科研三級(jí)實(shí)驗(yàn)室（湖北宜昌443002）；2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院（廣州510632）

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類單鏈非編碼小分子RNA，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與特定靶基因的信使RNA（message RNA，mRNA）的3′-UTR區(qū)結(jié)合，起到抑制mRNA 翻譯或直接降解其特定mRNA 的作用［1］。miRNA 在細(xì)胞生長發(fā)育、分化、凋亡等方面扮演重要角色［2］，超過50%的miRNA 位于與癌癥相關(guān)脆弱區(qū)和DNA 斷裂點(diǎn)上［3］，且miRNA 的表達(dá)失調(diào)可參與控制脊索瘤［4］、乳腺癌［5］、結(jié)腸癌［6］等多種疾病的進(jìn)程。目前許多miRNA 的靶基因尚未明確，探索其具體作用機(jī)制仍較困難，因此利用生物信息學(xué)準(zhǔn)確預(yù)測miRNA 的靶基因，結(jié)合雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)行靶基因鑒定對(duì)研究miRNA的后續(xù)作用機(jī)制顯得尤為重要。

miR-16 在研究慢性淋巴細(xì)胞白血病時(shí)被發(fā)現(xiàn)［7］，可以通過靶向調(diào)控細(xì)胞周期素D1等基因誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯從而參與細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控［8］。miR-16 被證實(shí)為腫瘤抑制因子，它的下行調(diào)節(jié)可以影響腫瘤細(xì)胞的凋亡［9］，且與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［10］。研究［11］表明，miR-16 參與重度抑郁癥的形成，提示miR-16 可能是調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的一個(gè)重要miRNA。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）可能是miR-16 的下游靶基因之一［12］，但對(duì)其確切性及具體機(jī)制的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)通過miRNA 靶基因數(shù)據(jù)庫預(yù)測rno-miR-16-5p 的靶基因，利用基因本體論（gene ontolog，GO）注釋對(duì)靶基因進(jìn)行分子功能和生物學(xué)分類，京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）軟件對(duì)靶基因富集的信號(hào)通路進(jìn)行富集性分析，并構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)載體，對(duì)預(yù)測出的靶基因進(jìn)行鑒定，為挖掘rno-miR-16-5p 的功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料蛋白胨、酵母提取物購自O(shè)XOID（英）公司；限制性內(nèi)切酶（XhoI、NotI）、Phusion DNA 聚合酶、連接反應(yīng)液、普通DNA 聚合酶購自Thermo 公司；DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、Universal DNA Purification Kit DNA 純化回收及TIANprep Mini Plasmid Kit 質(zhì)粒小提試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖購自BioWest（西班牙）公司；氨芐青霉素購自sigma 公司；Dual-Glo?Luciferase Assay System 購于Promega（美國）公司；LipofectamineTM2000 購于Invitrogen（美國）公司；DEME 培養(yǎng)基與胰酶購于GIBCO（美國）公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 rno-miR-16-5p 靶基因預(yù)測利用miRanda（http：//www.microrna.org）、miRDB（http：//www.mirdb.org）、TargetScan（http：//www.targetscan.org）3 個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測rno-miR-16-5p 的靶基因，取三者結(jié)果的交集以減少假陽性。

1.2.2 GO 分析與KEGG 通路分析將預(yù)測到的靶基因集合集進(jìn)行GO 和KEGG 分析。GO 分為生物過程（biological process，BP），分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞組件（cellular component，CC）3 個(gè)層面，并利用超幾何分析檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P ＜0.01 為顯著性閾值分別得到GO 注釋顯著性分析。KEGG 通路分析利用Fisher Exact Test 計(jì)算P 值，以P ＜0.05 得到差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的疾病通路及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

1.2.3 雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建通過美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NICB）基因庫查找大鼠BDNF 基因3′-UTR序列（NM_012513），應(yīng)用軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，引物序列為：r-BDNF_3′-UTR_F：GGCGGCTCGAGTGTTGCCGTTGCCAAGAAT；r-BDNF_3′-UTR_R：AATGCGGCCGCCCTGACCCATGCCAGAAGA。下劃線為XhoI、NotI 的酶切位點(diǎn)序列，預(yù)計(jì)引物擴(kuò)增長度為573 bp。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。以C6 基因組DNA 為模板，采用30 μL 反應(yīng)體系進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖電泳分析，限制性內(nèi)切酶XhoI、NotI 雙酶切上述純化產(chǎn)物和pmiR-RBREPORTTM 載體，酶切后回收產(chǎn)物進(jìn)行純化、連接、轉(zhuǎn)化，挑取轉(zhuǎn)化后的5 個(gè)菌落進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，條帶理論大小為850 bp。

1.2.4 細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染取對(duì)數(shù)生長期的293T 細(xì)胞接種于96 孔板中（每孔1.5 × 104細(xì)胞，總體積100 μL），37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取10 μL OPTIMEM 培養(yǎng)基稀釋miRNA mimic（miRNA 模擬物，試驗(yàn)組）或Non-target Control（NC，陰性對(duì)照組），15 μL OPTI-MEM 培養(yǎng)基稀釋BDNF 基因3′-UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體，25 μL OPTI-MEM 培養(yǎng)基稀釋0.25 μL LipofectamineTM2000 試劑，混勻后靜置20 min。96 孔板中每孔吸走50 μL 培養(yǎng)基后加入上述50 μL 混合液，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。6 h 后再加100 μL 新鮮培養(yǎng)基。

1.2.5 rno-miR-16-5p 靶基因的驗(yàn)證細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，加入1 ×PBS 與luciferase 底物（35 μL 每孔），震蕩10 min 后測定螢火蟲熒光值；再加入Stop reagent（30 μL），震蕩10 min 后測定海腎熒光值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t 檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較，P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 靶基因的預(yù)測結(jié)果采用TargetScan、miRDB、miRanda 數(shù)據(jù)庫預(yù)測出的靶基因分別有1 633、737、640 個(gè)，為減少假陽性，取三者交集得到的靶基因有48 個(gè)（圖1）。

2.2 靶基因GO 分析結(jié)果對(duì)以上48 個(gè)預(yù)測靶基因進(jìn)行GO 分析，在BP 層面，靶基因主要富集于細(xì)胞生長發(fā)育、促進(jìn)突觸合成及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等與神經(jīng)細(xì)胞有關(guān)的GO 條目中（P ＜0.01）。在CC 層面，靶基因主要富集于血小板α 顆粒、力蛋白復(fù)合體等GO 條目中（P ＜0.01）。在MF 層面，靶基因主要富集于粘多糖聚集GO 條目中（P ＜0.01）。其中在符合條件的GO 條目中幾乎所有BP 層面的基因功能注釋均有BDNF 出現(xiàn)（圖2）。

圖1 TargetScan、miRDB、miRanda 對(duì)rno-miR-16-5p 靶基因的預(yù)測結(jié)果Fig.1 The prediction results of rno-miR-16-5p target genes of TargetScan，miRDB and miRanda

2.3 靶基因集KEGG 通路分析結(jié)果在GO 注釋分類的基礎(chǔ)上，通過對(duì)靶基因集合的KEGG 分析發(fā)現(xiàn)靶基因主要富集于4個(gè)生物學(xué)通路中（P ＜0.05），分別為唾液分泌通路（Salivary secretion）、mTOR信號(hào)通路（mTOR Signaling pathway）、cAMP 信號(hào)通路（cAMP Signaling pathway）與胰腺分泌通路（Pancreatic secretion），其中BDNF 參與cAMP 信號(hào)通路（圖3）。

2.4 BDNF 基因3′-UTR 區(qū)雙熒光素酶基因報(bào)告載體的構(gòu)建通過PCR 擴(kuò)增BDNF 基因3′-UTR 片段，得到長度為573 bp 的片段，與預(yù)期相符（圖4）。隨后經(jīng)雙酶切試驗(yàn)，選取5 個(gè)菌落進(jìn)行菌落PCR 鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，挑取的5 個(gè)單克隆有4 個(gè)長度為850 bp 為陽性克隆，與預(yù)期一致（圖5）。表明雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)載體構(gòu)建成功。

圖2 rno-miR-16-5p 預(yù)測靶基因集GO 分類圖Fig.2 GO terms of predicted target genes of rno-miR-16-5p

圖3 rno-miR-16-5p 預(yù)測靶基因KEGG 分類圖Fig.3 KEGG terms of predicted target genes of rno-miR-16-5p

圖4 BDNF 基因3′-UTR 序列PCR 電泳結(jié)果Fig.4 PCR amplification product of BDNF gene 3′-UTR

圖5 轉(zhuǎn)化菌落PCR 電泳分析結(jié)果Fig.5 PCR amplification product of transformed colony

2.5 rno-miR-16-5p 的靶基因鑒定為了檢測rnomiR-16-5p 對(duì)BDNF 基因3′-UTR 區(qū)的調(diào)控作用，對(duì)熒光素酶的活性進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，rno-miR-16-5p mimic 對(duì)BDNF 野生型的報(bào)告熒光有顯著的下調(diào)作用（t = 48.99，P = 0.000），提示BDNF 是rnomiR-16-5p 的靶基因（圖6）。

圖6 雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果Fig.6 The results of dual luciferase reporter gene assays

3 討論

miR-16 在腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等疾病中發(fā)揮重要作用。miR-16 的下調(diào)可通過孕激素介導(dǎo)的致癌基因信號(hào)促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展［13］；miR-16 通過靶向肝癌衍生生長因子從而抑制非小細(xì)胞肺癌中腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲［14］。研究［11］發(fā)現(xiàn)，miR-16對(duì)人類和嚙齒動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)功能相關(guān)的基因表達(dá)進(jìn)行多效調(diào)節(jié)，導(dǎo)致“抗應(yīng)激”的行為表現(xiàn)；miR-16的表達(dá)水平與膠質(zhì)母細(xì)胞干細(xì)胞的分化呈正相關(guān)，但對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性有負(fù)面影響［15］，并且miR-16 可作為抑郁癥等疾病的早期診斷指標(biāo)［16］，但是miR-16 在神經(jīng)功能調(diào)節(jié)中的具體機(jī)制鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用TargetScan、miRDB、miRanda 數(shù)據(jù)庫預(yù)測rno-miR-16-5p 的靶基因分別有1 633、737、640 個(gè)，取三者的交集靶基因共48 個(gè)，包括BDNF、VEGFA 等，具有高特異性及低假陽性率，其中miR-16 可通過抑制多發(fā)性骨髓瘤中VEGFA 的表達(dá)來調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫［17］，而有關(guān)rno-miR-16-5p 靶基因之一BDNF 的文獻(xiàn)資料較少，因此對(duì)靶基因BDNF 的生物信息學(xué)分析及鑒定具有一定的意義。

為了進(jìn)一步揭示rno-miR-16-5p 的生物學(xué)功能，本實(shí)驗(yàn)對(duì)預(yù)測的靶基因集進(jìn)行了GO 與KEGG分析，結(jié)果顯示，rno-miR-16-5p 靶基因功能富集于細(xì)胞生長發(fā)育、促進(jìn)突觸合成及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等生物學(xué)過程；血小板α顆粒、力蛋白復(fù)合體等細(xì)胞組件；粘多糖聚集等分子功能。rno-miR-16-5p 靶基因集通路富集于唾液分泌通路、mTOR 信號(hào)通路、cAMP 信號(hào)通路與胰腺分泌通路。其中BDNF參與了上述幾乎所有的生物學(xué)過程和cAMP 信號(hào)通路，提示BDNF 可能通過cAMP 信號(hào)通路調(diào)控多個(gè)生物學(xué)過程。cAMP 信號(hào)通路又稱為蛋白激酶A 系統(tǒng)（protein kinase A system，PKA），是環(huán)核苷酸系統(tǒng)的一種，可通過活化cAMP 依賴的PKA 使下游靶蛋白磷酸化，從而影響細(xì)胞代謝和細(xì)胞行為［18］。研究［19］表明，PKA 磷酸化的α-氨基羥甲基惡唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isox-azolepropionate，AMPA）受體亞基對(duì)突觸可塑性有重要作用，而AMPA 受體可介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性突觸傳遞，且PKA 可促進(jìn)短期記憶轉(zhuǎn)化為長期記憶來儲(chǔ)存［20］，提示cAMP 信號(hào)通路可能是一條重要的與神經(jīng)系統(tǒng)功能相關(guān)的通路。

BDNF 是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的神經(jīng)營養(yǎng)因子，對(duì)神經(jīng)元的存活、分化、生長發(fā)育起重要作用［21］。研究［22］發(fā)現(xiàn)BDNF 水平下降與癲癇患者認(rèn)知障礙有關(guān)，且是抗抑郁藥效的基本決定因素［23］。為了驗(yàn)證BDNF 是否為rno-miR-16-5p的靶基因之一，本研究成功構(gòu)建了野生型雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)載體，并檢測熒光素酶的活性來觀察rno-miR-16-5p 對(duì)BDNF 基因3′-UTR 區(qū)的調(diào)控作用，結(jié)果顯示，rno-miR-16-5p mimic 組報(bào)告熒光顯著減少，表明BDNF 是rno-miR-16-5p 的靶基因。本研究存在不足之處，在后續(xù)研究工作中會(huì)進(jìn)一步完善關(guān)于突變型BDNF 基因3′-UTR 區(qū)雙熒光素酶基因報(bào)告，進(jìn)一步證實(shí)rno-miR-16-5p 與靶基因BDNF 的調(diào)控關(guān)系。

綜上所述，BDNF 是rno-miR-16-5p 的靶基因之一，結(jié)合GO 與KEGG 分析結(jié)果，提示rno-miR-16-5p 可能靶向作用于BDNF，再可能通過參與cAMP信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞生長發(fā)育、監(jiān)管軸突生成、促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等生物學(xué)過程，但其具體的分子機(jī)制尚未明確，需進(jìn)一步探討。