袁樂永 柯尊瓊

1湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室（湖北十堰442000）；2十堰市人民醫(yī)院藥學(xué)部（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院藥學(xué)部）（湖北十堰442000）；3十堰市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院（湖北十堰442000）

據(jù)WHO 報(bào)道［1］，2017年我國結(jié)核病年發(fā)病人數(shù)約為160 萬，位居全球第二位，其中死亡病例近5 萬。大多數(shù)結(jié)核分枝桿菌感染呈現(xiàn)潛伏結(jié)核感染狀態(tài)，僅約10%患者會發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病，以上提示機(jī)體遺傳因素與結(jié)核病易感性相關(guān)［2］。目前有大量研究［3-8］報(bào)道，天然抗性相關(guān)巨噬蛋白1（NRAMP1），維生素D 受體，細(xì)胞因子，TOLL 樣受體（TLR），P2X7 受體，非整合素分子（DC-SIGN）等基因多態(tài)性與結(jié)核病易感性有關(guān)。上述基因大多數(shù)參與了人體對結(jié)核感染的免疫相關(guān)作用。

高遷移率族蛋白1（high mobility group protein，HMGB1）作為一種高度保守的核蛋白，它參與了機(jī)體多種病理生理過程。比如，HMGB1 可通過活化巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子從而引起機(jī)體炎癥反應(yīng)，也與機(jī)體免疫相關(guān)等［9-10］。目前國內(nèi)外報(bào)道［11-13］了關(guān)于HMGB1 基因多態(tài)性與多種疾病的關(guān)聯(lián)性研究，比如肺癌、高血壓、代謝綜合征等。但目前關(guān)于HMGB1 基因多態(tài)性與肺結(jié)核的關(guān)系尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究擬采用病例對照關(guān)聯(lián)研究，通過一代測序方法檢測肺結(jié)核患者外周血HMGB1 基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs），以探討HMGB1 基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感性的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 對象按照國家統(tǒng)一診斷標(biāo)準(zhǔn)［14］選取2018年1月至2019年1月就診于十堰市疾病預(yù)防控制中心278 例新發(fā)結(jié)核患者為研究對象，其中男188 例，女90 例，平均年齡（47.2 ± 21.8）歲，排除標(biāo)準(zhǔn)：肺炎、肺癌或其他非結(jié)核性肺部疾患等類似病癥患者，乙型肝炎、免疫缺陷病或者采用免疫抑制劑治療的患者等免疫力低下患者；對照組選自且同一地域門診健康體檢人員225 例，其中男150 例，女75 例，平均年齡（46.3 ± 20.5）歲，排除結(jié)核病史、結(jié)核病接觸史以及BCG 接種史，胸片有異常，PPD 試驗(yàn)陽性等人群。所有受試者均無血緣關(guān)系，本研究征得所有受試者同意并簽署了書面知情同意書。兩組研究對象的性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.2 外周血DNA 提取抽血前患者及家屬簽署知情同意書，填寫一般資料調(diào)查表，采集所有受試者EDTA 抗凝外周靜脈血2 mL，采用DNA 提取試劑盒提取樣本基因組DNA 并檢測樣品濃度及純度，-80 ℃保存?zhèn)溆?。DNA 提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.3 HMGB1 基因SNPs 挑取通過生物信息數(shù)據(jù)庫以及以往報(bào)道的文獻(xiàn)等資料，本實(shí)驗(yàn)最終挑取了HMGB1 基因3 個(gè)SNPs（rs1045411、rs2249825 和rs1412125）進(jìn)行進(jìn)一步探討。

1.4 HMGB1 基因多態(tài)性檢測

1.4.1 HMGB1 基因參考序列根據(jù)Genebank 中獲得的HMGB1 基因序列設(shè)計(jì)PCR 擴(kuò)增引物，引物序列見表1，引物采用Oligo 7.0 軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 HMGB1 基因多態(tài)性位點(diǎn)與引物設(shè)計(jì)Tab.1 Polymorphisms of HMGB1 gene and primer design

1.4.2 DNA 擴(kuò)增反應(yīng)條件以上述提取的DNA為模板，采用PrimeSTAR Max DNA Polymerase 試劑盒進(jìn)行核酸擴(kuò)增，該實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增反應(yīng)總體積為40 μL，其中Premix 20 μL、模板10 μL、上/下游引物1 μL，余下用滅菌水補(bǔ)足，均勻混勻，置于PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。本實(shí)設(shè)定的反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃變性10 s，63 ℃退火5 s，72 ℃延伸10 s，總共40 個(gè)循環(huán)。DNA 擴(kuò)增試劑盒購自日本TAKARA 公司。

1.4.3 測序配制2%瓊脂糖凝膠，將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物加入凝膠進(jìn)行電泳，溴乙錠染色，紫外線分析凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳結(jié)果并拍照。將目標(biāo)條帶切下，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化并采用ABI 3500DX 測序儀進(jìn)行測序。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)及基因型、等位基因和單體型分布頻率采用χ2檢驗(yàn)并計(jì)算比值比（odds ratio，OR）和95%置信區(qū)間（confidence intervals，CI），P＞0.05 表示采樣符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡。各SNPs 標(biāo)記之間采用D'和R（相關(guān)系數(shù)）進(jìn)行連鎖不平衡分析，D'若R2＞1/3，D'＞0.75 表示顯著相關(guān)（緊密連鎖）。和R（相關(guān)系數(shù)）表示每對SNPs 之間的連鎖不平衡程度。（即單體型頻率實(shí)際觀察值和預(yù)測值之間的差異，連鎖不平衡的相對大小，值從-1到1）不同等位重組載體的構(gòu)建各緊密連鎖的SNPs 組成的單體型。以上數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 及SHEsis 在線統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，P ＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMGB1 基因測序結(jié)果PCR 產(chǎn)物電泳后經(jīng)純化后進(jìn)行測序分析。本研究檢測到HMGB1 基因3 個(gè)SNPs 所有基因型，見圖1。

2.2 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)本研究共納入研究對象503 例，Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示rs1045411、rs2249825 和rs1412125 位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡（P ＞0.05），說明納入的研究具有群體代表性。見表2。

2.3 HMGB1 基因等位基因、基因型與結(jié)核病的關(guān)系HMGB1 基因rs1045411 等位基因G 和A 在對照組分布頻率分別為80.44%和19.56%、在結(jié)核組分別為79.32%和20.68%；GG、GA、AA 基因型在對照組分布頻率分別為67.11%、26.67%、6.22%，在結(jié)核組分別為62.23%、34.17、3.60%，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)結(jié)核組HMGB1 基因rs2249825 與rs1412125 位點(diǎn)的等位基因和各基因型分布頻率與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見表3。

圖1 HMGB1 基因3 個(gè)SNPs 位點(diǎn)的測序圖Fig.1 Gene sequencing analysis of three SNPs

表2 HMGB1 基因Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)Tab.2 Hardy-Weinberg genetic balance test for HMGB1 gene 例

2.4 HMGB1基因各遺傳模型與結(jié)核病的關(guān)系研究結(jié)果表明，在各遺傳模型下，結(jié)核組rs1045411位點(diǎn)各基因型分布頻率與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝3.286、1.292、1.886，均P＞0.05）；rs2249825和rs1412125位點(diǎn)各基因型分布在結(jié)核組與對照組之間差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

2.5 SNPs 位點(diǎn)連鎖不平衡分析采用連鎖不平衡檢驗(yàn)方法分析HMGB1 基因各多態(tài)性位點(diǎn)的連鎖情況。Haploview 4.0 軟件分析3 個(gè)位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性，rs1045411/rs2249825，rs1045411/rs1412125 和rs2249825/rs1412125 的D′值分別為0.87、1.00 和0.85，r2值分別為0.50、0.70 和0.34，見圖2。通過D′與r2值發(fā)現(xiàn)3 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)緊密連鎖。

2.6 單體型與結(jié)核病的關(guān)聯(lián)分析由于分析單體型與疾病之間的關(guān)系比單個(gè)SNP 位點(diǎn)分析更有意義，因此通過網(wǎng)址分析了4 個(gè)不同的單體型與結(jié)核病的關(guān)系（見表5）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ACC 單體型與結(jié)核病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加存在強(qiáng)關(guān)聯(lián)（P ＜0.01）；而其他單體型與結(jié)核病無明顯關(guān)聯(lián)性（P ＞0.05）。

3 討論

據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道［1］，全球約1/3 的人口感染過結(jié)核分枝桿菌，但僅1/10 的感染者會進(jìn)一步發(fā)展為結(jié)核病，以上提示個(gè)體差異可能與結(jié)核病易感性有關(guān)。近年來國內(nèi)外也報(bào)道［3-8］了一些基因多態(tài)性與結(jié)核病易感性有關(guān)，比如NRAMP1、維生素D 受體、白介素和Toll 樣受體等基因。HMGB1作為一種晚期炎癥介質(zhì)之一，它通過活化機(jī)體巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞而發(fā)揮促炎作用［9］。同時(shí)，HMGB1 可上調(diào)IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子α 等促炎因子的表達(dá)。人體感染結(jié)核桿菌后，結(jié)核桿菌可激活機(jī)體免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等發(fā)揮免疫應(yīng)答功能。機(jī)體對結(jié)核桿菌菌體成分及代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生免疫損傷反應(yīng)，這些免疫細(xì)胞發(fā)生損傷或壞死，進(jìn)而產(chǎn)生大量的HMGB1［15］，HMGB1 可進(jìn)一步加重機(jī)體炎癥反應(yīng)，從而引起機(jī)體損傷。HMGB1 基因多態(tài)性可能會影響其表達(dá)，進(jìn)而加重或減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)，但結(jié)核病易感性與HMGB1 基因多態(tài)性關(guān)系尚未見報(bào)道。

表3 HMGB1 基因rs1045411、rs2249825 和rs1412125 位點(diǎn)多態(tài)性分析Tab.3 Polymorphisms analysis of rs1049269，rs1245560，rs1245561 and rs1245562 for HMGB1 gene 例

表4 不同遺傳模型下SNP 位點(diǎn)分析Tab.4 Analysis of SNP loci under different genetic models 例

本研究探討了HMGB1 基因rs1045411、rs2249825 和rs1412125 三個(gè)位點(diǎn)與肺結(jié)核易感性的關(guān)系。研究結(jié)果顯示，HMGB1 基因rs1045411、rs2249825 和rs1412125 SNPs 位點(diǎn)的等位基因和各基因型分布頻率與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），而結(jié)核組rs1045411、rs2249825 和rs1412125 組成的單體型ACC 的分布頻率與對照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），且可能與結(jié)核病易感性有關(guān)（P ＜0.01）。以上結(jié)果提示單體型ACC 可能會增加HMGB1 蛋白表達(dá)水平，HMGB1 水平增加會誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞釋放大量炎癥因子，從而促進(jìn)結(jié)核病的進(jìn)展。

表5 HMGB1 基因單體型分析Tab.5 Haplotype analysis for HMGB1 gene

圖2 IRGM SNPs 位點(diǎn)間的連鎖不平衡分析圖（D′和r2值）Fig.2 Analysis diagram of linkage disequilibrium between IRGM SNPs sites（D′and r2 values）

綜上所述，檢測HMGB1 基因SNPs 位點(diǎn)對于篩選結(jié)核病易感人群有一定臨床價(jià)值，對于攜帶上述結(jié)核易感基因的結(jié)核患者進(jìn)行早期預(yù)防以及早期診斷和治療具有重要的意義。本次實(shí)驗(yàn)雖然在湖北人群中揭示了HMGB1 基因多態(tài)性與結(jié)核病易感性關(guān)系，但該基因的多態(tài)性可能與結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間存在遺傳異質(zhì)性，不同的國家、不同的種族、同一國家不同地區(qū)、甚至同一地區(qū)不同環(huán)境HMGB1 基因多態(tài)性分布類型可能不同，因此本地區(qū)HMGB1 基因的多態(tài)性與結(jié)核的易感性相關(guān)尚不能斷定該基因是結(jié)核的易感基因。有待于進(jìn)一步研究和探索。