羅怡爽 林韓特 代曼云 胡瀟威 劉愛明

寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)研究室 (浙江 寧波， 315211)

膽汁淤積是由于膽汁形成和分布障礙而在肝細(xì)胞、膽管中蓄積。臨床主要包括原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)、原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)以及各型病毒性肝炎所致的膽汁淤積；若得不到有效治療，各種膽汁淤積性肝病均有可能進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化、肝腫瘤[1]。目前，膽汁淤積性肝病尚無有效的治療藥物，即使是有30多年應(yīng)用歷史的熊去氧膽酸(UDCA)也有50%患者不產(chǎn)生藥效學(xué)反應(yīng)，且腹瀉、皮膚瘙癢等不良反應(yīng)也被報道[2]。而2016年通過FDA批準(zhǔn)的奧貝膽酸(OCA)目前仍處于Ⅳ期臨床試驗(yàn)階段，臨床效果還有待時間檢驗(yàn)，因此尋求有效治療PBC和PSC等膽汁淤積性肝病的新策略具有積極意義。在近期實(shí)驗(yàn)中我們明確了非諾貝特激活過氧化物酶體增殖物激活受體a (PPARa)，進(jìn)一步抑制JNK炎癥通路預(yù)防α-荼基異硫氰酸鹽(ANIT)誘導(dǎo)PBC[3]，但非諾貝特對PSC的治療作用尚不清楚。本研究通過3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氫-2,4,6-三甲基吡啶(DDC)誘導(dǎo)PSC小鼠模型，探討非諾貝特對小鼠PSC的治療作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 20只6～8周齡SPF級129/Sv雄性小鼠，體質(zhì)量(23.0±2.0)g，購自南京模式動物中心，飼養(yǎng)于寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物研究方案及操作流程由寧波大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器 試劑：非諾貝特(湖南千金湘江藥業(yè))；玉米油(上海阿拉丁)；DDC(Sigma公司)；Trizol(Ambion Invitrogen公司)，RT試劑和qPCR試劑(北京康為世紀(jì)生物科技公司)；定量PCR試劑(SYBR Green PCR Master Mix，Roche公司)；血清生物化學(xué)檢測試劑盒(寧波瑞源生物科技有限公司)。儀器：石蠟包埋機(jī)(BM-Ⅶ，湖北孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器)，切片機(jī)(HM-325，德國LEICA公司)，酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)，定量PCR儀(LightCycle 480，Roche公司)。

1.3 動物分組與給藥 將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為正常對照組(Nomal control組)、模型組(Model組)，治療組(Model+feno組)和非諾貝特組(Feno組)，每組5只。參考相關(guān)報道，除正常對照組和非諾貝特組外，其余各組動物均給予0.1% DDC飼料喂養(yǎng)[4,5]。根據(jù)我國與歐洲肝病學(xué)專家共識，血清酶學(xué)的升高作為對診斷PSC有重大意義[6]，通過監(jiān)測實(shí)驗(yàn)小鼠血清酶學(xué)變化，確定DDC干預(yù)5 d后成功誘導(dǎo)PSC模型。第6天起，給予治療組及非諾貝特組小鼠25 mg/kg非諾貝特(玉米油超聲溶解)灌胃，2次/d，持續(xù)8 d。

1.4 血樣采集及生化分析 在非諾貝特灌胃的第1、3、6、9天，尾靜脈采血檢測小鼠血清ALT、AST水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，通過眼球取血，4℃、3 600 r/min離心15 min分離血清，檢測ALP、TBA等生化指標(biāo)。

1.5 肝臟病理學(xué)檢測 小鼠肝臟放于10% 中性福爾馬林緩沖溶液固定24 h后，脫水，石蠟包埋。常規(guī)切片，HE染色，顯微鏡下觀察肝臟病理形態(tài)學(xué)變化。

1.6 肝臟膽汁酸排泄基因和炎癥基因mRNA表達(dá)檢測 qPCR實(shí)驗(yàn)方法及步驟參考本課題組已發(fā)表文章[3]。引物序列信息來自公共數(shù)據(jù)(http://mouseprimerdepot.nci.nih.gov/)，見表1。

表1 引物序列信息

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠血清膽汁淤積指標(biāo)檢測結(jié)果 見圖1。 在DDC誘導(dǎo)PSC模型后，給予非諾貝特治療8 d，與正常對照組相比，模型組小鼠血清ALP、TBA水平明顯升高(P<0.01)，膽囊系數(shù)增大(P<0.01)；與模型組相比，治療組小鼠血清ALP、TBA均明顯降低(P<0.01)，膽囊系數(shù)下降至正常(P<0.01)，肝系數(shù)有所上升(P<0.05)。

與正常對照組比較，** P< 0.01；與模型組比較，## P< 0.01

2.2 4組小鼠不同時段肝功能指標(biāo)檢測結(jié)果 見圖2。 給予非諾貝特治療3～6 d后小鼠ALT、AST水平開始呈下降趨勢(P<0.05或P<0.01)，在第6～9天治療組小鼠肝功能恢復(fù)接近正常對照組。見圖2。

與正常對照組比較，** P< 0.01；與模型組比較，## P< 0.01

2.3 4組小鼠肝組織病理情況 鏡下觀察，正常對照組小鼠肝臟外觀正常；肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、細(xì)胞核大而圓，核膜清晰，胞漿豐富、淡染。模型組小鼠肝臟外觀呈現(xiàn)暗紅色，膽囊腫大，膽汁呈深褐色；細(xì)胞著色有加深，提示有可能發(fā)生凋亡；肝小葉輪廓不清，炎細(xì)胞浸潤，組織輕度壞死，膽汁淤積嚴(yán)重，膽管增生。治療組小鼠肝組織上述病理變化均明顯減輕。非諾貝特組小鼠肝臟病理無明顯病理學(xué)改變。見插頁圖3。

2.4 4組小鼠肝臟膽汁酸代謝基因 見圖4。 與正常對照組相比，模型組小鼠肝臟膽汁酸合成酶Cyp8b1和Cyp7a1與攝取基因Oatp2和Oatp1表達(dá)分別下降86%、44%和52%、99%(P<0.05或P<0.01)，膽汁酸排泄基因Ostb和Mdr1a表達(dá)升高47倍和5倍(P<0.01)；與模型組相比，治療組小鼠Cyp8b1轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)504%(P<0.05)，并下調(diào)排泄基因Ostb和Mdr1a轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平82%和48%(P<0.01)。非諾貝特組小鼠上述基因轉(zhuǎn)錄水平與正常對照組相當(dāng)。

與正常對照組比較，* P< 0.05, ** P< 0.01；與模型組比較，# P< 0.05, ## P< 0.01

2.5 4組小鼠肝臟炎癥因子和基因檢測情況 與正常對照組相比，模型組小鼠炎癥基因Il1β、Il6、c-Jun和c-Fos表達(dá)升高4～8倍(P<0.05或P<0.01)；與模型組相比，治療組小鼠Il1β、Il6、c-Jun和c-Fos mRNAs分別下降42%、65%、66%和73%(P<0.05或P<0.01)，甚至逆轉(zhuǎn)至正常組水平。見圖5。

與正常對照組比較，* P< 0.05, ** P< 0.01；與模型組比較，# P< 0.05, ## P< 0.01

3 討論

膽汁淤積性肝病發(fā)病率高。PSC是膽汁淤積性肝病的主要病癥之一，表現(xiàn)為肝內(nèi)外膽管進(jìn)行性炎癥，病情進(jìn)行性發(fā)展，最終將進(jìn)展為肝硬化和肝衰竭，患者生存將依賴于肝臟移植[7]。DDC開發(fā)為PSC模型的工具藥，多項(xiàng)研究肯定DDC誘導(dǎo)PSC模型的可行性，以血清酶學(xué)指標(biāo)和組織病理學(xué)分析PSC模型的建立，這與本研究分析基本一致[8]。

多項(xiàng)研究證實(shí)PPARa是一個多功能的核受體，它可以直接或者間接介導(dǎo)破壞膽汁酸合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的平衡，如野生型和基因敲除小鼠食飼吉非羅齊飼料的不同表現(xiàn)，也可以正面維持體內(nèi)膽汁酸穩(wěn)態(tài)，如硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型的研究[9]；膽汁淤積性肝病中，PPARa可以介導(dǎo)致炎和抗炎，如全氟癸酸基于PPARa誘導(dǎo)了膽汁酸穩(wěn)態(tài)破壞激發(fā)炎癥，同時基于抗炎發(fā)揮了對抗作用[10]。

非諾貝特是核受體PPARα激動劑，在我們之前的研究中，非諾貝特可明顯預(yù)防PBC，本研究探討了相同的給藥方案治療DDC誘導(dǎo)PSC的作用與機(jī)制。給予非諾貝特治療后，DDC誘導(dǎo)的PSC小鼠膽汁酸合成酶Cyp8b1轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)接近正常，排泄基因Ostb和Mdr1a表達(dá)下調(diào)；并下調(diào)了炎癥基因Il-1β、Il-6、c-Fos和c-Jun的表達(dá)。這些結(jié)果說明藥物治療PSC與抑制炎癥有關(guān)，而膽汁酸代謝排泄的改變屬于代償性改變。

臨床實(shí)踐中，非諾貝特用于治療高脂血癥的劑量為150～300 mg/d，而貝特類藥物用于治療膽汁淤積性肝病的臨床研究多采用此劑量[11,12]。文獻(xiàn)報告在大鼠、小鼠等模型中研究非諾貝特防治膽汁淤積性肝病時，藥物劑量多為50～200 mg/kg[13,14]。在本研究中，我們采用的25 mg/kg、2次/d的給藥方案，結(jié)果表明該劑量仍然可以完全抑制DDC誘導(dǎo)的PSC，提示低劑量非諾貝特可能對各種膽汁淤積性肝病都具有良好的治療作用。

綜上所述，本研究通過DDC誘導(dǎo)的PSC小鼠模型評估了非諾貝特對PSC的治療作用，并從藥物干預(yù)下的膽汁酸代謝代償性改變和PPARa介導(dǎo)的抑制炎癥等方面進(jìn)行了分析，提示低劑量非諾貝特能有效治療膽汁淤積性肝病，值得進(jìn)一步研究。