燕 浩 肖冬冬 榮立奪 成 歡 王雅梅 提運(yùn)榮 張 明 隋曉鋒 盧慕峻*

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿外科（上海 200127）；2.東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院（上海 201620）

勃起功能障礙(erectile dysfunction,ED)是指陰莖持續(xù)不能達(dá)到或維持足夠的勃起，以完成滿意的性生活[1]。ED的病因錯(cuò)綜復(fù)雜，內(nèi)分泌、血管神經(jīng)和精神心理等因素均會(huì)影響該病的發(fā)生和發(fā)展[2]。糖尿病是造成ED的常見(jiàn)病因之一，糖尿病患者ED發(fā)生率達(dá)到35%～90%[3]。目前ED的治療手段，包括磷酸二酯酶抑制劑（PDE5I）、低能量沖擊波治療、經(jīng)尿道給藥和真空負(fù)壓吸引，皆對(duì)糖尿病ED患者療效不理想，而陰莖假體植入同樣存在費(fèi)用高昂、術(shù)后感染和機(jī)械故障等缺陷[4]。糖尿病ED復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制和較差的療效促使人們轉(zhuǎn)向其他的治療手段。

干細(xì)胞因具有自我更新能力和一定條件下的多向分化能力，其中脂肪來(lái)源干細(xì)胞（Adipose-derived stem cells,ASCs）是近年來(lái)從脂肪組織中分離得到的一種多能干細(xì)胞[5]，其取材方便、來(lái)源廣泛、對(duì)機(jī)體損傷小，并且擁有旁分泌和多向分化功能，被應(yīng)用于各個(gè)組織器官的功能修復(fù)。本研究擬采用脂肪來(lái)源干細(xì)胞治療糖尿病ED大鼠，評(píng)價(jià)其勃起功能及血管化程度，研究其改善勃起功能的機(jī)制。

材料與方法

一、材料

鏈脲佐菌素 （S0130，Sigma， 美國(guó)），檸檬酸鈉（1613859，Sigma， 美國(guó)）， 檸檬酸 （791725，Sigma，美國(guó)），胎牛血清（10437028，Gibco,美國(guó)）。低糖 DMEM培養(yǎng)基 （21885108，Gibco， 美國(guó)）， 抗菌 -抗真菌劑（15240062，Gibco，美國(guó)），胰蛋白酶（T2600000，Sigma，美國(guó)），膠原酶（NB4，SERVA，德國(guó)），肝素鈉注射液（國(guó)藥集團(tuán)容制藥有限公司），磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（上海賽戈生物有限公司），DAPI（上海翊圣生物科技有限公司），Masson試劑盒（Solarbio，美國(guó)），多聚甲醛（16005，Sigma，美國(guó)），雙蒸水（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院），生理鹽水（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院），乙醇（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院），兔抗大鼠CD31抗體（稀釋 1：100，Servicebio）；BL420S 多通道生理記錄儀（成都泰盟有限公司）

實(shí)驗(yàn)對(duì)象：4只2周齡和30只250g～300g經(jīng)交配試驗(yàn)證明勃起功能正常的SD清潔級(jí)雄性大鼠，由西普爾-必凱公司提供。

二、方法

（一）大鼠ASCs的分離和提取

按Wang等[6]的方法，取同種異體近交系2周齡SD雄性大鼠，無(wú)菌狀態(tài)下取大鼠腹股溝處的脂肪組織，放入PBS中洗凈血污，再用抗菌-抗真菌劑清洗一遍后，轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)皿中。將組織切剪成1mm×1mm的糜狀物，加入消化液（0.075%膠原酶NB4，其余為DMEM)，移液器充分打勻，直到組織可以通暢的出入吸嘴。加入含有血清的培養(yǎng)基，混勻并分裝入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。間隔48h換1次液。細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第三代后，吸去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞3次，加入0.25%的胰蛋白酶消化，顯微鏡下觀察ASCs聚集成群后終止消化，放入離心管離心，棄去上清液重懸后，取細(xì)胞懸液100μL顯微鏡下計(jì)數(shù)得出細(xì)胞密度，按1：1的體積與PBS混勻，終密度調(diào)整為106/mL。

（二）實(shí)驗(yàn)分組

選取12周齡性成熟的30只雄性SD大鼠，隨機(jī)分成3組（每組10只），A組為正常組（血糖正常的SD大鼠），B組為PBS組 （糖尿病ED大鼠單純注射PBS治療），C組為ASCs組 （糖尿病 ED大鼠海綿體注射ASCs治療）。所有大鼠采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由采食和飲水，適應(yīng)環(huán)境一周。

（三）糖尿病ED大鼠模型的構(gòu)建

禁食過(guò)夜后，正常組在腹腔注射生理鹽水，另外兩組注射生理鹽水溶解的鏈脲佐菌素（streptozotocin,STZ）60mg/kg，自由采食和飲水。分別在給藥后72h連續(xù)測(cè)3次隨機(jī)血糖，然后每周測(cè)一次血糖和身高體質(zhì)量直到12周實(shí)驗(yàn)結(jié)束。血糖連續(xù)＞16.7mmol/L可視為糖尿病[7]。

（四）陰莖海綿體內(nèi)注射

建立起糖尿病ED模型并提取ASCs后，進(jìn)行海綿體內(nèi)注射（intracavernous injection,ICI）手術(shù)干預(yù)，將大鼠稱量麻醉，暴露陰莖海綿體，ASCs組用微量注射器將200μL脂肪干細(xì)胞懸液從大鼠海綿體中部注射，留置5min確保細(xì)胞流入海綿體間隙。正常組和PBS組用微量注射器注射等量的生理鹽水，同樣留置5min確保流入海綿體間隙。注射完畢后放入籠中繼續(xù)喂養(yǎng)，待12周后進(jìn)行后續(xù)各項(xiàng)測(cè)試。

（五）海綿體內(nèi)壓（intracorporeal pressure，ICP）與平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure，MAP）比值測(cè)定陰莖勃起功能

各組大鼠在治療后飼養(yǎng)至12周進(jìn)行勃起功能檢測(cè)，將大鼠麻醉固定，腹部作一正中切口，暴露前列腺，在前列腺背側(cè)尋找盆神經(jīng)，然后通過(guò)神經(jīng)剝離器將盆神經(jīng)及陰莖海綿體神經(jīng)分離出來(lái)。切開(kāi)陰莖及其上方靠近腹部的皮膚，剪開(kāi)包皮并剝離至陰莖腳位置，充分暴露陰莖海綿體；于左側(cè)陰莖海綿體中部用25G規(guī)格的、充滿肝素溶液的靜脈輸液針進(jìn)行穿刺，進(jìn)針的角度約為10°到20°，防止角度過(guò)大刺入尿道，若輸液針的導(dǎo)管有回血，證明穿刺成功，穿刺完畢后固定輸液針，另一側(cè)通過(guò)壓力換能器連接B420S生物信號(hào)記錄儀輸入信號(hào)接口，準(zhǔn)備測(cè)量陰莖海綿體內(nèi)壓。隨后切開(kāi)頸部皮膚，暴露左頸動(dòng)脈，將左頸動(dòng)脈與周圍組織及神經(jīng)分離，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，動(dòng)脈夾夾閉近心端后，作一楔形切口，并將充滿肝素溶液的P50導(dǎo)管置于動(dòng)脈中，然后固定導(dǎo)管，另一側(cè)通過(guò)壓力換能器連接B420S生物信號(hào)記錄儀的輸入信號(hào)接口，以監(jiān)測(cè)全身的平均動(dòng)脈壓。準(zhǔn)備完畢后開(kāi)始進(jìn)行電刺激，將不銹鋼電極連接B420S生物信號(hào)記錄儀的輸出信號(hào)接口，將刺激參數(shù)設(shè)置為5V，20Hz，5ms脈沖寬度和50s持續(xù)時(shí)間，開(kāi)始刺激大鼠的陰莖海綿體神經(jīng)，同時(shí)記錄ICP和MAP，在每只大鼠中記錄最大ICP與MAP的比率（ICP/MAP）。

（六）Masson染色

取陰莖中段組織，用4%的多聚甲醛固定過(guò)夜，然后用乙醇梯度脫水，包埋在石蠟中，切成4μm厚的薄片，按Masson試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行染色。用image-J進(jìn)行分析，每個(gè)切片隨機(jī)選取6個(gè)區(qū)域。

（七）免疫熒光染色

選取陰莖中段海綿體2mm組織，用4%的多聚甲醛固定4℃過(guò)夜，之后轉(zhuǎn)移到30%蔗糖PBS溶液4℃過(guò)夜，儲(chǔ)存在-80℃，切成10μm冰凍切片，3%的牛血清白蛋白PBS溶液（BSA）室溫孵育20min，然后孵育抗CD31抗體抗體。用image-J進(jìn)行分析，每個(gè)切片隨機(jī)選取6個(gè)區(qū)域。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、大鼠的血糖及體質(zhì)量變化

正常大鼠血糖始終保持穩(wěn)定，而糖尿病組大鼠的血糖明顯升高，ASCs組則在升高后出現(xiàn)了一定程度的降低，其最終血糖顯著低于PBS組（P＜0.05）；PBS組最終體質(zhì)量相較于正常顯著降低，ASCs組體質(zhì)量也有一定程度的降低，但其最終體質(zhì)量與PBS組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表 1。

表1 3組大鼠體質(zhì)量血糖數(shù)據(jù)

二、大鼠陰莖海綿體組織Masson染色

PBS組的平滑肌/膠原比例顯著低于正常組（P＜0.001），ASCs組平滑肌/膠原纖維比例較PBS組增高（P＜0.001），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 3組大鼠的Masson染色結(jié)果

三、陰莖海綿體壓力測(cè)定（ICP/MAP）評(píng)價(jià)勃起功能恢復(fù)

ICP/MAP結(jié)果顯示，ASCs組ICP/MAP為（0.6896±0.0260），較 PBS 組（0.3724±0.0137）顯著升高(P＜0.001)，圖2。

四、免疫熒光

CD31熒光顯示PBS組血管數(shù)量（14.50±3.56/mm2）相對(duì)正常組（39.33±10.86/mm2）明顯降低（P＜0.001），而ASCs組血管數(shù)量 （34.00±1.19/mm2） 顯著高于PBS組（P＜0.001），圖 3。

圖2 3組大鼠海綿體內(nèi)壓和平均動(dòng)脈壓結(jié)果

圖3 大鼠陰莖CD31免疫熒光染色結(jié)果

討 論

糖尿病是ED常見(jiàn)的病因之一，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。有學(xué)者認(rèn)為糖尿病損害了陰莖的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)功能。而陰莖血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能和平滑肌細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定對(duì)于維持陰莖的勃起功能十分關(guān)鍵。陰莖勃起過(guò)程本質(zhì)上是一種神經(jīng)血管活動(dòng)，但其受各種心理和生理因素的影響。當(dāng)人受到一定的性刺激時(shí)，下丘腦或骶髓低級(jí)中樞會(huì)發(fā)出沖動(dòng)，神經(jīng)沖動(dòng)傳至陰莖海綿體，在副交感神經(jīng)神經(jīng)末梢釋放的神經(jīng)型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase,nNOS）和內(nèi)皮細(xì)胞釋放的內(nèi)皮型一氧化氮合酶 （endothelial nitric oxide synthase,eNOS）的催化下，一氧化氮（nitric oxide,NO）的合成釋放明顯增多，NO進(jìn)入平滑肌細(xì)胞內(nèi)，激活鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶（guanylyl cyclase,GC），使平滑肌細(xì)胞內(nèi)的環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷 （cyclic guanosine monophosphate,cGMP）增多，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低，平滑肌細(xì)胞舒張，動(dòng)脈血流量增加，陰莖海綿體膨大變硬從而產(chǎn)生勃起。由于PDE5I依賴上述過(guò)程的完整性，一旦內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞功能受損，PDE5I的作用將會(huì)受到限制，因此，學(xué)者嘗試采取各種手段對(duì)糖尿病引起的陰莖損傷進(jìn)行修復(fù)。

隨著干細(xì)胞在組織工程領(lǐng)域研究的深入，目前已有多種干細(xì)胞用于各類組織器官修復(fù)的研究報(bào)道，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)、脂肪源性干細(xì)胞(ASCs)和肌源性干細(xì)胞(MSCs)等[8]。ASCs主要通過(guò)旁分泌和多向分化兩種方式進(jìn)行組織再生修復(fù)，其多向分化潛能主要體現(xiàn)在其可以分化成脂肪細(xì)胞[9]、骨和軟骨細(xì)胞[10]、內(nèi)皮細(xì)胞[11]和上皮細(xì)胞[12]等多種細(xì)胞。而其旁分泌作用主要體現(xiàn)在其可以分泌多種細(xì)胞因子，在促進(jìn)血管化、趨化作用和調(diào)節(jié)免疫中發(fā)揮了重要作用。其分泌的促血管的細(xì)胞因子包括血管活性生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF），腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）， 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等[13,14]。由此可見(jiàn)ASCs在治療糖尿病ED方面有著巨大的潛能。

本研究成功建立糖尿病ED大鼠模型，并從大鼠腹股溝脂肪分離脂肪源性干細(xì)胞進(jìn)行陰莖海綿體注射治療。通過(guò)大鼠的海綿體測(cè)壓，以及對(duì)海綿體組織切片進(jìn)行Masson染色和CD31免疫熒光染色，我們發(fā)現(xiàn)ASCs具有促進(jìn)糖尿病ED大鼠勃起功能恢復(fù)的潛力。其中PBS組的ICP/MAP及血管數(shù)量較正常組顯著降低，而ASCs組的ICP/MAP顯著高于PBS組，證明糖尿病大鼠經(jīng)ASCs海綿體內(nèi)注射治療后，勃起功能得到一定程度的改善。而其海綿體組織的平滑肌數(shù)量和血管數(shù)量也得到了一定程度的提升，我們推想ASCs能夠促進(jìn)海綿體組織的血管化，提升糖尿病大鼠海綿體的血管密度，保護(hù)海綿體的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，從而改善勃起功能。根據(jù)我們的前期研究[15]，ASCs能通過(guò)旁分泌作用促進(jìn)SDF-1/CXCR4通路改善膀胱組織的血管化，因此，ASCs可能在海綿體組織局部旁分泌某些生長(zhǎng)因子，激活通路傳導(dǎo)、促進(jìn)血管化，延長(zhǎng)平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的存活時(shí)間，從而改善勃起功能。Maarten等的[16]研究也表明，干細(xì)胞治療ED的相關(guān)機(jī)制并不是直接分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞，而是通過(guò)旁分泌的方式，相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

本研究通過(guò)大鼠糖尿病ED動(dòng)物模型建立，以及海綿體注射ASCs治療糖尿病ED，初步發(fā)現(xiàn)ASCs能夠通過(guò)促進(jìn)陰莖海綿體血管及平滑肌再生，改善糖尿病大鼠的勃起功能，提示ASCs是潛在的糖尿病ED的治療手段。