胡 燁 范宇平 黃文強(qiáng) 王 羽 潘家坪 楊 昊 滕曉明

同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院生殖醫(yī)學(xué)中心（上海 200040）

精子DNA碎片指數(shù) （DNA fragmentation index,DFI）近年在全國(guó)范圍已逐漸成為常規(guī)項(xiàng)目，多數(shù)研究和文獻(xiàn)提示DFI對(duì)男性生殖，包括輔助生殖技術(shù)存在影響，即使是特發(fā)性的男性生育力低下[1-2]。然而也有爭(zhēng)議，至少目前尚未形成DFI具體影響輔助生殖過程機(jī)制的定論。精子冷凍的過程對(duì)精子本身的染色質(zhì)和頂體完整性存在影響[3]，但是在輔助生殖技術(shù)當(dāng)中，精子冷凍保存至今仍是不可缺少的重要內(nèi)容之一。本研究擬探索精子冷凍前精子DFI水平是否對(duì)精子冷凍復(fù)蘇存在影響。

材料與方法

一、一般資料

2017年在上海市第一婦嬰保健院生殖中心行體外受精-胚胎移植（IVF-ET）的所有患者在術(shù)前行自精精子冷凍保存的共55例，排除因嚴(yán)重少弱精子癥和隱匿精子癥凍精的患者，實(shí)際入組患者36例，按DFI≥27%和DFI＜27%分為兩組。

二、精液標(biāo)本的采集和處理

所有研究對(duì)象在留取精液前均禁欲2～7d，于本院取精室按標(biāo)準(zhǔn)步驟留取精液標(biāo)本。受檢者取精流程如下：排尿；用肥皂清洗雙手和陰莖，減少來自皮膚共棲微生物所致的標(biāo)本污染的風(fēng)險(xiǎn)；沖洗掉肥皂沫；使用一次性新的毛巾擦干手和陰莖；精液射入無菌容器。精液標(biāo)本取出后立即放置于37℃溫箱內(nèi)，待精液充分液化后進(jìn)行鏡下分析。

三、精子DFI檢測(cè)

精子DNA完整性檢測(cè)采用浙江星博生物科技有限公司精子核完整性染色試劑盒（浙江星博生物科技有限公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)：YZB/浙（甬）0159-2-12）。 嚴(yán)格按照說明書的步驟進(jìn)行標(biāo)本制備操作。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣本，檢測(cè)時(shí)需在平衡樣品線后，將已染好色的樣本加入樣品室，立即啟動(dòng)樣品流，檢測(cè)精子的流動(dòng)速度（流動(dòng)速度應(yīng)在100～300個(gè)/s，若速度過大，應(yīng)重新稀釋樣本）；2 min后開始收集數(shù)據(jù)，至少有5 000個(gè)細(xì)胞的測(cè)定值加以記錄和統(tǒng)計(jì)，每個(gè)樣本至少連續(xù)檢測(cè)2次。精子核經(jīng)酸處理液處理后，經(jīng)吖啶橙染色，異常精子核染色質(zhì)成單鏈與染料吖啶橙結(jié)合發(fā)橙黃色或紅色熒光；正常精子核染色質(zhì)為雙鏈，與吖啶橙結(jié)合發(fā)綠色熒光，若紅光比值增高，說明精子核完整性程度降低。

四、精子冷凍

精液取出后，37℃溫箱內(nèi)液化。將冷凍保護(hù)劑取出，平衡至室溫。精液液化后進(jìn)行常規(guī)檢查，包括精液量、顏色、氣味、pH、液化情況、精子濃度、活力及細(xì)胞等情況。準(zhǔn)備精液冷凍管，將患者姓名、病歷號(hào)和冷凍日期等做好記錄。根據(jù)精液的量，按照1：1的比例緩慢加入冷凍保護(hù)劑，邊加入邊搖晃混勻。充分混勻精液與冷凍保護(hù)劑，室溫放置15min。將精液冷凍保存管固定在鋁架上，懸于液氮平面上方15cm處，進(jìn)行熏蒸，液氮盒加蓋放置15min后，將冷凍管投入液氮，保存在液氮罐相應(yīng)位置。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

檢測(cè)結(jié)果用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。計(jì)量資料采用兩均數(shù)t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，組間比較P＜0.05提示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

入組精子冷凍患者共36例，年齡 39.50±7.29（28～59）歲，不育年限 2.92±1.30（1～8）年。 分為 DFI≥27%組11例，DFI＜27%組25例。比較兩組患者年齡、不育年限及術(shù)前精子正常形態(tài)率，結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.29，P=0.77，P=0.28），見表 1。

表1 基本情況比較（±s）

表1 基本情況比較（±s）

年齡（歲） 不育年限（年） 精子正常形態(tài)率（%）DFI＜27%組 38.48±6.19 2.96±1.49 2.76±1.59 DFI≥27%組 41.82±9.26 2.88±0.75 2.27±1.01 P 0.29 0.77 0.28

DFI≥27%和DFI＜27%的精子冷凍前后的濃度變化、活力變化及前向運(yùn)動(dòng)（PR）精子總數(shù)變化的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.07；P=0.76；P=0.58），見表 2。

以冷凍復(fù)蘇率60%為分組標(biāo)準(zhǔn)，DFI≥27%組冷凍復(fù)蘇率≥60%的患者4例；DFI＜27%組冷凍復(fù)蘇率≥60%的患者12例，比較兩組冷凍復(fù)蘇率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.52），見表 3。

表2 兩組冷凍前后濃度、活力和PR精子總數(shù)比較

表3 不同DFI水平精子冷凍后復(fù)蘇率分析n（%）

討 論

精子DNA完整性的檢測(cè)早在1993年就已被提出，由于費(fèi)用、檢測(cè)方法的可行性和標(biāo)準(zhǔn)不一致等問題，直到近年，DFI才作為男性精子功能的重要參數(shù)在臨床廣泛開展[4]。但是DFI的檢測(cè)手段、治療方法以及臨床指導(dǎo)意義都存在不少爭(zhēng)議。

DFI的參考值根據(jù)檢測(cè)方法的不同而各有不同，本研究中DFI的檢測(cè)均通過流式細(xì)胞術(shù)精子染色質(zhì)檢測(cè)（sperm chromatin structure assay，SCSA），按臨床報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)：DFI≤15%表示DNA完整性好；DF I15%～30%表示DNA完整性一般；DFI≥30%表示DNA完整性差。本研究以27%作為分組標(biāo)準(zhǔn)主要是參考了DFI檢測(cè)方法相同的近期文獻(xiàn)[3]。然而DFI結(jié)果是27%還是30%并不是直接表示剩余的精子是正常的，有文獻(xiàn)指出剩余部分的精子已可能存在染色質(zhì)完整性異常，只是檢測(cè)方法未能發(fā)現(xiàn)[5]。基于精子細(xì)胞的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，要研究其DNA損傷的機(jī)制比體細(xì)胞DNA損傷復(fù)雜，精子DNA在精子發(fā)生的生理過程中經(jīng)歷多次變化。而DFI的檢測(cè)目前能提供的是一些DNA損傷在生殖過程中產(chǎn)生影響的前因后果的重要信息[6]，故DFI參考值的界定在不同中心可能會(huì)有所不同，需要結(jié)合臨床信息作判斷。

在細(xì)胞冷凍過程中，冷凍損傷的發(fā)生是不可避免的，引起細(xì)胞冷凍損傷的主要因素為細(xì)胞滲透壓改變以及溫差驟變導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)冰晶形成，從而造成細(xì)胞和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷，而在復(fù)蘇過程中，復(fù)溫速率也可能對(duì)細(xì)胞存活率形成影響[7]。既往認(rèn)為DNA損傷的精子對(duì)低溫的耐受能力下降，可能的機(jī)制是：精子DNA損傷嚴(yán)重的精液中活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）水平也增高，從而降低了精子對(duì)冷凍過程的耐受能力[8]，另外DNA損傷可能隨精子凋亡過程出現(xiàn)，精子DFI高相對(duì)精子凋亡率也增加[9]，而凋亡精子可能對(duì)低溫的耐受性差。

本研究結(jié)果顯示DFI≥27%和DFI＜27%的精子冷凍前后的濃度變化、活力變化及前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)變化的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.07；P=0.76；P=0.58），比較兩組冷凍復(fù)蘇率也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P=0.52）。該結(jié)果提示，精子冷凍前DFI水平對(duì)于精子冷凍過程沒有明確影響；或者說，精子DFI水平高于正常并不是冷凍保存精子的禁忌證，并不是建議不處理DFI高的患者。DFI的影響較少在受精和受精卵過程表現(xiàn)出來，通常更多在胚胎3～5d或移植窗口期之后表現(xiàn)[10-12]。DFI對(duì)精子冷凍前后精液常規(guī)參數(shù)及冷凍復(fù)蘇率不存在影響也與這一結(jié)論相符。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)精子冷凍前DFI水平對(duì)于精子冷凍后參數(shù)變化和復(fù)蘇率沒有影響，也明確高DFI并不能作為精子冷凍的禁忌證。當(dāng)然結(jié)合ROS等氧化應(yīng)激指標(biāo)、采用不同的DNA完整性檢測(cè)方式以及多中心、更大樣本的臨床數(shù)據(jù)分析可能是進(jìn)一步研究的方向。