美合日古麗·薩塔爾 張盼盼 王天宇 艾孜孜·熱合曼蔣丹丹 斯依提·阿木提 阿地力江·伊明*

新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室（烏魯木齊 830011）

由于環(huán)境因素、工作壓力、行為模式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，人類的生殖健康面臨著巨大的威脅。有文獻(xiàn)報(bào)道[1,2]，近50年來(lái)人類精子質(zhì)量不斷下降，成年男性精液量及精子數(shù)量下降了近50%，且呈繼續(xù)下降趨勢(shì)。因此，少精子癥的研究亦越來(lái)越受到諸多學(xué)者的廣泛關(guān)注[3,4]。環(huán)境雌激素（environmental estrogens，EEs）及冷刺激可直接或間接影響動(dòng)物生殖系統(tǒng)，但具體不詳，有關(guān)模型更是鮮有報(bào)道。故本研究以3種雌激素樣飼料分別聯(lián)合冷刺激復(fù)合干預(yù)的方法，就誘導(dǎo)慢性少精子癥大鼠模型進(jìn)行了研究，并從精子濃度、精子活率改變，睪丸及附睪形態(tài)學(xué)變化，以及Johnson評(píng)分，對(duì)少精子癥模型進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)，初步確定了最佳建模方法，并圍繞其性腺軸內(nèi)分泌激素的改變進(jìn)行了初步的機(jī)制探討，為基于該模型基礎(chǔ)上的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

性成熟雄性SD大鼠84只，平均質(zhì)量（220±10）g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

二、主要儀器與試劑

冷凝機(jī)、DRS-09A型超聲波加濕器（杭州多樂(lè)信電器有限公司）、BS-1150型電子天平（北京賽多科斯天平有限公司）、Carl Zeiss多功能掃描電子顯微鏡 （德國(guó)蔡司公司）。M199細(xì)胞培養(yǎng)液（HyClone公司，批號(hào)：No.SH30253.01）、水合氯醛 (索來(lái)寶公司，批號(hào)：No.327D021）。

飼料配制：特殊飼料A為70%常規(guī)大鼠飼料與15%菠菜實(shí)、15%芫荽實(shí)，飼料B為70%常規(guī)大鼠飼料與30%的芫荽實(shí)，飼料C為70%常規(guī)大鼠飼料與30%菠菜實(shí)。

三、實(shí)驗(yàn)方法

（一）實(shí)驗(yàn)分組與動(dòng)物模型的建立

隨機(jī)取12只正常雄性大鼠為正常對(duì)照組（N組），余72只為造模組A、B、C組。A飼料+冷刺激組（簡(jiǎn)稱A組），B飼料+冷刺激組 （簡(jiǎn)稱B組），C飼料+冷刺激組（簡(jiǎn)稱C組），每組24只。N組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，溫度為（25±2）℃，濕度為（55±5）%，造模組大鼠置于氣候箱[溫度 （10±2）℃、 濕度 （75±5）%] 的環(huán)境中飼養(yǎng)，9：00～19：00放入。干預(yù)24周后，檢測(cè)各組大鼠精子濃度，分別篩選出精子濃度低于N組50%的少精子癥大鼠模型，分別設(shè)為 A2、B2、C2組，未成模者設(shè)為 A1、B1、C1組。

（二）取材

建模24周后，7%水合氯醛(5 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血，離心取上清。取雙側(cè)睪丸、附睪分別稱量，一側(cè)睪丸與附睪常規(guī)光、電鏡標(biāo)本固定。取另一側(cè)附睪尾，在M199培養(yǎng)液中 （含有2%BSA）剪碎，37℃孵育15min，參照《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第5版)[5]進(jìn)行精子計(jì)數(shù)并計(jì)算精子濃度。然后按照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行睪丸Johnson評(píng)分。

（三）血清激素水平檢測(cè)

按照放免試劑盒說(shuō)明書對(duì)大鼠睪酮 （T）、雌二醇（E2）、黃體生成素（LH）、促卵泡激素（FSH）和催乳素（PRL）進(jìn)行檢測(cè)。

四、統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素ANOVA分析，兩兩比較采用LSD法進(jìn)行檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分比(%)表示，組間率的比較采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組精子濃度、活率、運(yùn)動(dòng)能力變化及成模率結(jié)果

結(jié)果顯示，A、B、C 3組大鼠精子濃度與活率較N組均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），提示，A、B、C 3 種均可導(dǎo)致大鼠精子濃度與活率顯著降低（表1）。經(jīng)按照低于N組50%作為標(biāo)準(zhǔn)篩選少精子癥模型后，A、B、C 3組成模率分別為 28.6%、38.1%、28.6%。 A2、B2、C2組大鼠精子濃度、活率及運(yùn)動(dòng)能力均顯著低于N組(P＜0.01)，提示，在形成少精子癥同時(shí)，出現(xiàn)了精子運(yùn)動(dòng)力減弱，同時(shí)，B2組精子濃度顯著低于 A2、C2組(P＜0.05，表 2，圖 1）。

表1 各組大鼠精子濃度、精子活率變化(±s)

表1 各組大鼠精子濃度、精子活率變化(±s)

注：與 N 組比較 *P＜0.05，**P＜0.01；與 B 組比較 △P＜0.05，△△P＜0.01

N組 A組 B組 C組精子濃度（×106/mL） 17.06±5.03 11.94±4.88* 11.70±7.68* 11.92±7.84*精子活率（%） 52.52±14.72 21.96±3.83** 12.12±3.76** 19.61±5.07**

表2 各組大鼠精子濃度、運(yùn)動(dòng)能力及活率變化(±s)

表2 各組大鼠精子濃度、運(yùn)動(dòng)能力及活率變化(±s)

注：與 N 組比較 *P＜0.05，**P＜0.01；與 B2組比較 △P＜0.05，△△P＜0.01

A組 B組 C組A1組 A2組 B1組 B2組 C1組 C2組精子濃度（×106/mL） 17.06±5.03 14.81±4.77 8.09±1.41**△ 19.50±5.80 4.39±2.96** 17.52±7.14 8.32±1.89**△精子活率（%） 52.41±14.72 39.10±15.89 34.83±10.78** 39.71±16.08 27.06±17.56** 38.44±16.13 32.09±8.62**精子運(yùn)動(dòng)能力（%） 28.86±10.35 17.42±19.43 13.15±7.19** 18.36±14.15 12.45±9.96** 11.65±10.04* 10.65±7.79**N組

圖1 各組大鼠精子伊紅-苯胺黑染色圖

二、睪丸、附睪質(zhì)量結(jié)果

睪丸質(zhì)量A2、B2、C2組顯著低于N組差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05)，B2組顯著低于 A2、C2組(P＜0.01)。 附睪重量 A2、B2、C2組顯著低于 N 組 (P＜0.015，表 3，圖 2、3)。

表3 N及模型組大鼠睪丸和附睪質(zhì)量變化(±s)

表3 N及模型組大鼠睪丸和附睪質(zhì)量變化(±s)

注：與 N 組比較 *P＜0.05，**P＜0.01；與 B2組比較 △P＜0.05，△△P＜0.01

N組 A2組 B2組 C2組睪丸（g） 1.75±0.19 1.34±0.46*△△ 0.80±0.33** 1.39±0.40*△△附睪（g） 0.82±0.07 0.61±0.08** 0.55±0.07** 0.63±0.17**

圖2 N組及模型組大鼠睪丸大小

圖3 N組及模型組大鼠附睪大小

三、睪丸、附睪光鏡觀察結(jié)果

N組睪丸、附睪光鏡下組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。A2、B2、C2組睪丸各級(jí)生精細(xì)胞排列紊亂，生精細(xì)胞、精子及間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量均減少，其中B2組生精細(xì)胞與精子數(shù)量減少最為明顯。A2、B2、C2組附睪管腔內(nèi)精子數(shù)量減少，其中B2組附睪管壁明顯增厚，管腔內(nèi)精子數(shù)量也明顯減少（圖4、5)。

圖4 N組及模型組大鼠睪丸H-E染色結(jié)果

圖5 N組及模型組大鼠附睪H-E染色結(jié)果

四、大鼠睪丸、附睪電鏡觀察結(jié)果

N組睪丸、附睪組織形態(tài)結(jié)構(gòu)均正常。A2、C2組睪丸生精小管內(nèi)見少量精母細(xì)胞和精子細(xì)胞及少量精子，少量生精細(xì)胞核消失，異染色質(zhì)增多，支持細(xì)胞數(shù)量減少。少量線粒體出現(xiàn)空泡樣變。B2組睪丸生精小管內(nèi)可見精原細(xì)胞、精母細(xì)胞核固縮，支持細(xì)胞核溶解并數(shù)量減少。A2、C2組附睪靜纖毛排列較整齊，細(xì)胞間隙增大，管腔內(nèi)精子數(shù)量減少；B2組附睪靜纖毛排列紊亂，細(xì)胞間隙明顯增大，且管腔內(nèi)精子數(shù)量極少（圖 6）。

圖6 N組及模型組大鼠睪丸、附睪電鏡結(jié)果（×2500）

五、大鼠睪丸Johnson評(píng)分結(jié)果

A2、B2、C23組睪丸 Johnson評(píng)分結(jié)果顯著低于 N組，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；同時(shí)，B2組亦顯著低于 A2和 C2組，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，表 4）。

表4 N及成模組大鼠睪丸Jonhsen評(píng)分結(jié)果(±s)

表4 N及成模組大鼠睪丸Jonhsen評(píng)分結(jié)果(±s)

注：與 N組比較 *P＜0.05，**P＜0.01；與 B2組比較△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 Jonhsen評(píng)分N 組（n=15） 9.10±0.78 A2 組（n=15） 5.30±1.05**△△B2 組（n=15） 3.10±0.99**C2 組（n=15） 5.70±0.94**△△

六、血清激素水平檢測(cè)結(jié)果

B2組T水平較N組T水平顯著降低，E2水平顯著升高差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。FSH、PRL水平B2亦較N組亦顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。LH水平B2組較N組升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表5）。

表 5 血清 T、E2、LH、FSH、PRL 水平變化(±s)

表 5 血清 T、E2、LH、FSH、PRL 水平變化(±s)

注：與 N 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

N組 B2組T（ng/dL） 1.36±0.66 0.24±0.13**E2（uIU/mL） 38.27±6.75 77.90±8.54**LH（mIU/mL） 4.48±1.70 5.66±1.07 FSH（mIU/mL） 5.20±2.54 10.53±4.09*PRL（pg/mL） 80.94±37.42 148.35±39.14**

討 論

不孕不育癥的發(fā)生約為育齡夫婦的10%～15%，其中男性因素占40%～60%[7,8]。文獻(xiàn)研究表明[9]精液異常導(dǎo)致的男性不孕不育約占70%～80%，其中少精子癥、弱精子癥和少弱精子癥分別占男性不孕不育的10%、30%和40%～50%[10-12]。在眾多因素當(dāng)中由于環(huán)境因素的影響，男性無(wú)精子癥、少精子癥、少弱精癥等疾病的發(fā)生率逐年增加[13]。因此，開展該領(lǐng)域的研究具有重要意義。同時(shí)，因倫理因素，很多研究需要借助動(dòng)物模型來(lái)開展，故建立與臨床吻合度較高，且具有良好的科學(xué)性、穩(wěn)定性的動(dòng)物模型成為必須。

常見的環(huán)境因素包括電離輻射、重金屬污染、環(huán)境激素污染與氣溫因素等等[14]。這其中EEs是一類對(duì)男性生殖系統(tǒng)影響最大的外源性內(nèi)分泌干擾物之一，包括合成性EEs、植物性EEs及真菌性EEs等[15]。而作為環(huán)境因素中的氣溫因素，即冷、熱刺激對(duì)人類的健康亦有著不同的影響，尤其長(zhǎng)期的寒冷環(huán)境，可對(duì)生殖健康帶來(lái)不同程度的損傷，秋冬季節(jié)更是心、腦血管等疾病的高發(fā)季節(jié)[16,17]?？紤]到以上因素，本研究分別選用富含異黃酮、雌二醇、雌三醇等植物雌激素的芫荽和菠菜等植物[18,19]，制作3種雌激素樣飼料，模擬了食源性植物雌激素污染，并聯(lián)合冷刺激復(fù)合干預(yù)的方式，研究了3種條件下建立復(fù)合型少精子癥模型的可行性和科學(xué)性，并在此基礎(chǔ)上探討了其可能的機(jī)制。

結(jié)果顯示，A、B、C 3種條件下均會(huì)導(dǎo)致精子濃度顯著降低，干預(yù)24周后A、B、C 3組大鼠精子濃度較N組均顯著降低（P＜0.05），并形成少精子癥。關(guān)于少精子癥模型的建立，目前采用腺嘌呤、環(huán)磷酰胺、棉酚、熱應(yīng)激等化學(xué)與物理方法較多[20]，上述模型在一定程度上較好的解決了少精子癥科學(xué)研究模型需求，同時(shí)也還存在與產(chǎn)生少精子癥的實(shí)際環(huán)境條件的吻合度上尚有一定差距。而在少精子癥的評(píng)價(jià)方面，學(xué)者們采取的標(biāo)準(zhǔn)也不盡一致，有學(xué)者以模型和正常對(duì)照組之間精子濃度具有顯著性差異作為標(biāo)準(zhǔn)[21-23]，也另有學(xué)者將精子濃度低于正常對(duì)照組的30%、20%設(shè)為少精子癥模型標(biāo)準(zhǔn)[24,25]。而本研究，則在此基礎(chǔ)上，結(jié)合WHO（第5版）對(duì)人類少精子癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)，參考學(xué)者張才田、Kesari等標(biāo)準(zhǔn)[26,27]，以降低50%作為少精癥模型的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了篩選。結(jié)果顯示，A、B、C 3組成模率分別為 28.6%、38.1%和28.6%，B2組明顯高于其他兩組，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，無(wú)顯著性差異（P=0.744），這可能與樣本量有關(guān)，尚需進(jìn)一步研究來(lái)明確。精子濃度比較后可見，B2組大鼠精子濃度顯著低于A2、C2組（P＜0.05）。對(duì)男性生殖腺睪丸和精子的成熟器官附睪的研究結(jié)果顯示，A2、B2、C23組睪丸和附睪的質(zhì)量均顯著降低 （P＜0.05，P＜0.01），與 A2、C2以 B2組最為顯著（P＜0.01）。 光、電鏡下A2、B2、C23組睪丸和附睪均發(fā)生不同程度的病理性改變，且以B2組最為明顯，表現(xiàn)為睪丸內(nèi)生精小管內(nèi)精子數(shù)量明顯減少或無(wú)精子，見精原細(xì)胞、精母細(xì)胞核固縮，支持細(xì)胞核溶解并數(shù)量減少，大量線粒體出現(xiàn)空泡樣變；附睪管內(nèi)見極少量的精子，且靜纖毛排列紊亂等改變。而Johnson評(píng)分結(jié)果顯示，A2、B2、C23組均較N組顯著降低 (P＜0.01)， 同時(shí)，B2組顯著低于A2、C2組(P＜0.01)。對(duì)上述各項(xiàng)指標(biāo)綜合分析后，筆者認(rèn)為，上述3種不同雌激素樣飼料聯(lián)合冷刺激的方法均可建立少精子癥模型，但其中芫荽實(shí)聯(lián)合冷刺激的方法效果最佳，具有成模率高，精子數(shù)量減少顯著，病理變化明顯等特點(diǎn)。

性腺軸激素檢測(cè)結(jié)果顯示，B2組T水平較N組顯著降低（P＜0.01），E2水平較 N 組顯著升高（P＜0.01），F(xiàn)SH、PRL 水平亦顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。 提示芫荽實(shí)聯(lián)合冷刺激致大鼠精子數(shù)量減少并最終發(fā)展為少精子癥，同時(shí)伴發(fā)弱精子癥的機(jī)制可能與T水平降低、E2水平升高，并引發(fā)性腺軸功能紊亂有關(guān)。具體機(jī)制而言，可能和EEs競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合在E2受體上，抑制負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)正反饋調(diào)節(jié)LH的分泌，進(jìn)而刺激E2的分泌有關(guān)[28]，同時(shí)睪丸細(xì)胞暴露在高雌激素環(huán)境時(shí)，類固醇合成酶的表達(dá)下降，亦可導(dǎo)致T水平進(jìn)一步降低[29]；另外也有可能與EEs促進(jìn)PRL、性激素結(jié)合蛋白的表達(dá)和分泌，使抑制素B及雄烯二酮水平降低，擾亂激素的平衡[30]，并因長(zhǎng)期冷刺激，引發(fā)慢性應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)一步導(dǎo)致性腺軸激素紊亂，并最終導(dǎo)致生殖功能損傷有關(guān)，但尚需進(jìn)一步研究予以論證。

綜上所述，上述3種不同雌激素樣飼料聯(lián)合冷刺激的方法均可建立少精子癥模型，但其中以芫荽實(shí)聯(lián)合冷刺激的方法效果最佳，其具體發(fā)生機(jī)制和性腺軸內(nèi)分泌功能改變有關(guān)。該模型且較好的模擬了少精子癥的慢性發(fā)病過(guò)程，為基于該模型的基礎(chǔ)上的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究奠定了良好的基礎(chǔ)，并為環(huán)境復(fù)合因素作用下少精子癥及少弱精子癥的發(fā)病機(jī)制研究開拓了新的思路。