王小賢，田甜，蘇香萍*，鄒坤，李建橋，胡建忠

1. 三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（宜昌 443002）；2. 水利部水土保持植物開發(fā)管理中心（北京 100038）

小花清風(fēng)藤（Sabia parviflora Wall. Ex Roxb）為常綠木質(zhì)攀援藤本，長2～4 m。芽鱗卵形，先端長尖，背面有中肋，有緣毛。單葉互生，葉柄長0.5～2 cm，葉片紙質(zhì)或近薄革質(zhì)，卵狀披針形、狹長圓形或長圓狀橢圓形，長5～12 cm，寬1～3 cm，先端漸尖，基部圓形或?qū)捫ㄐ?，?cè)脈每邊5～8條。小花清風(fēng)藤根、莖、枝、葉均可入藥，有祛風(fēng)除濕，消炎止痛的作用[1]。

綠茶主要化學(xué)成分為多酚類物質(zhì)[2]、氨基酸類物質(zhì)、碳水化合物、維生素、色素、揮發(fā)性化合物、礦物質(zhì)和微量元素等[3]。一直以來，綠茶被用作保健飲料，具有多種藥理作用，如抗癌活性[4]、抗糖尿病活性、控制體重、抗氧化活性和抗高血壓和心血管[5]等作用。

目前，對于小花清風(fēng)藤制備成產(chǎn)品的研究還相對較少，主要集中在制備成具有養(yǎng)肝護(hù)肝作用的產(chǎn)品，如將小花清風(fēng)藤與大棗等原料配制后，將其制備成護(hù)肝解毒功能飲料等[6]，仍鮮見將小花清風(fēng)藤為原料用于制備綠茶的技術(shù)文獻(xiàn)報(bào)道。鑒于此，研究將以小花清風(fēng)藤為原料，優(yōu)化其綠茶加工工藝條件，包括攤青時間、殺青方式和干燥方式，使得制備的小花清風(fēng)藤綠茶湯色、氣味和各項(xiàng)功能指標(biāo)符合要求，為小花清風(fēng)藤綠茶產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小花清風(fēng)藤鮮葉，于2017年9月12日采自貴州省黔西南布依族苗族自治州興義市安龍縣茶園。1, 1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、愈創(chuàng)木酚、茶多酚、甘氨酸、茚三酮、VC、蘆丁、鄰苯二酚、不溶性聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、二水氯化亞錫、過氧化氫、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、NaNO2、Al(NO3)3、硫酸亞鐵，酒石酸鉀鈉、過氧化氫、尿素、硫酸銨、檸檬酸，均為分析純。

數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州智博瑞儀器制造有限公司；SP-754型紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；TGL-16 G高速臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；KQ 5200 E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小花清風(fēng)藤綠茶制備方法

攤青：采用室內(nèi)自然攤放方式，將鮮葉均勻攤放，置于通風(fēng)陰涼室內(nèi)，攤放厚度為1.0～1.5 cm，室內(nèi)溫度在20～25 ℃范圍，在自然環(huán)境條件下鮮葉中含水量為70%左右[7]。

殺青：采取微波殺青的方式[8]。每次投葉量為10 g，厚度為0.5～1.0 cm，殺青時間選取30，60，90，120和300 s 5個時間點(diǎn)進(jìn)行處理，微波殺青功率選取70，210，350，560和700 W進(jìn)行處理。殺青后及時取樣，采用1.2.2、1.2.3和1.2.4小節(jié)中的方法分別測定殺青葉的失水率和PPO、POD活性，以確定最佳的殺青條件。

揉捻：殺青葉冷卻后，按照“輕重輕”原則沿同一方向揉捻，一邊揉捻一邊抖動，揉捻成形度達(dá)85%～95%即可。

做形：掌握“輕重輕”的原則。將葉置于手心，一手靜止，一手前后平行往同一方向揉搓，每次輕搓時間不超過6 s。當(dāng)搓揉到葉變硬有刺手感時，停止做形。

干燥：烘箱干燥采用電熱鼓風(fēng)干燥箱進(jìn)行，將殺青的茶葉放入瓷盤中，厚度約為1.0～1.5 cm，烘箱溫度為60 ℃，烘至含水率6%以下的安全范圍。

1.2.2 鮮葉失水率的測定[9]

每次投葉殺青前準(zhǔn)備稱量10 g鮮葉（M，g），殺青后靜置5 min，稱量（m，g），則：

1.2.3 多酚氧化酶（PPO）活性[10]

稱取洗凈鮮葉5 g于研缽中，加入2 g PVPP和100 mL 0.1 mol/L pH 6.5磷酸緩沖液，磨成勻漿，用幾層紗布過濾，濾液加入30%飽和度硫酸銨，離心除沉淀，上清液再加硫酸銨使達(dá)60%飽和度，離心收集沉淀。將所得沉淀溶于3 mL pH 6.5磷酸緩沖液中，即為粗制酶液。

取酶液1 mL于離心管中，加入3 mL反應(yīng)混合液（0.1 mol/L pH 6.5磷酸緩沖液與1%鄰苯二酚體積比10:3），在37 ℃恒溫水浴中保溫10 min，立即加入6 mol/L尿素溶液3 mL。以4 000 r/min離心10 min，取上清液，用10 mm比色皿，在460 nm波長處，1～2 min內(nèi)測定吸光度（A）?？瞻讓φ沼镁彌_液代替反應(yīng)液中的鄰苯二酚，其他條件相同。結(jié)果計(jì)算：以每克樣品每分鐘內(nèi)A460增加0.1為1個酶活力單位。

式中：A460為反應(yīng)終止時以空白為對照在460 nm處的吸光度；m為樣品干重；t為反應(yīng)時間（min）。

1.2.4 過氧化物酶（POD）活性[11]

稱取鮮葉0.1 g，加20 mmol/L KH2PO45 mL，于研缽中研磨成勻漿，以10 000 r/min離心10 min，收集上清液保存在冷處，所得殘?jiān)儆?0 mmol/L KH2PO45 mL提取1次，合并2次上清液。

取比色皿2只，于一只中加入反應(yīng)混合液3 mL，KH2PO41 mL，作為校零對照，另一只中加入反應(yīng)混合液3 mL，上述酶液1 mL，立即開啟秒表，于分光光度計(jì)470 nm波長下測量OD值，每隔30 s讀數(shù)1次。以每分鐘內(nèi)A470變化0.01為一個酶活性單位。

式中：V1為酶液總體積，mL；V2為測定用酶液體積，mL；M為樣品鮮質(zhì)量，g；t為反應(yīng)時間，min。

1.2.5 茶多酚含量測定[12]

茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：稱取茶多酚純品0.250 0 g，加水溶解定容至250 mL，混勻，即為1 mg/mL茶多酚的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別稱取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0，1.0，2.0，3.0和4.0 mL于一組50 mL比色管中，各加水至10 mL，再加酒石酸鐵溶液10 mL，用pH 7.5的緩沖液定容至刻度，于540 nm處測定吸光度，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.163 3x-0.000 7，r2=0.999 7。

樣品測定：稱取磨碎茶葉試樣0.1 g（準(zhǔn)確至0.000 1 g），加水30 mL煮沸，冷卻，加壓過濾，注入100 mL容量瓶中，定容、搖勻、過濾，棄去初濾液約20 mL，剩余的濾液為試液。取試液2 mL于50 mL比色管中，加酒石酸鐵10 mL搖勻，用pH 7.5的磷酸鹽緩沖液定容，于540 nm處測定吸光度。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品中茶多酚的含量。

1.2.6 總氨基酸含量測定[13]

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取甘氨酸100 mg溶于100 mL水中，然后用水稀釋至如下質(zhì)量濃度：40，80，160，240和320 μg/mL。分別移取以上各濃度溶液1.0 mL置于25 mL容量瓶中，加0.5 mL緩沖液，再加茚三酮顯色劑0.5 mL，在沸水浴中加熱15 min，冷卻后加水定容至25 mL。放置10 min，于570 nm處，以空白試劑做參比溶液，測吸光度。以氨基酸濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.004 3x-0.143 4，r2=0.987 7。

1.2.7 總黃酮含量的測定[14]

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，各加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL搖勻，放置6 min；加入硝酸鋁溶液0.3 mL搖勻，放置6 min；加入4% NaOH溶液4.0 mL后加95%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，放置15 min，在510 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=8.591 8x+0.003 4，r2=0.988 5。

1.2.8 綠茶清除DPPH能力[15]

參照文獻(xiàn)[16-17]，分別取不同濃度（0.05，0.10，0.15，0.20，0.25和0.30 mg/mL）綠茶提取液2 mL于試管中，加入2 mL 2×10-4mol/L DPPH溶液（無水乙醇配制），混合均勻，室溫下暗處靜置 30 min后，以2 mL水與2 mL無水乙醇的混合液調(diào)零點(diǎn)在波長518 nm處測定其吸光度A1，以2 mL水代替提取液與2 mL DPPH溶液混合反應(yīng)后測定其吸光度A0。以2 mL提取液與2 mL無水乙醇混合液測定其吸光度A2，以消除提取液本身的影響。以維生素C作為清除DPPH·的陽性對照品。按以公式（4）計(jì)算不同濃度綠茶提取液對 DPPH·清除率：

求出綠茶濃度與DPPH·清除率的線性回歸方程，然后計(jì)算得到綠茶清除DPPH的IC50。

1.2.9 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，各單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Origin 9.0軟件繪圖，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，每個處理進(jìn)行3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同攤放時間葉含水量的變化和攤放葉品質(zhì)的影響

采用室內(nèi)自然攤放方式，將鮮葉均勻攤放，置于通風(fēng)陰涼室內(nèi)，攤放厚度為1.0～1.5 cm，室內(nèi)溫度在20～25 ℃范圍，設(shè)置不同的攤放時間（分別為4，6，8，10 和12 h，中途輕翻1～2次），考察不同攤放時間下鮮葉的失水率，以確定達(dá)到攤放適度所需的時間。

從表1可以看出，采用自然攤放方式，8 h可以達(dá)到最佳攤放效果。在此條件下，攤放葉達(dá)到適中的失水率30.9%，且葉色淺暗綠，葉形略皺縮、柔軟，有輕微清香。

2.2 微波殺青時間對綠茶失水率和PPO、POD酶活的影響

殺青時高溫能鈍化酶的活性，同時會對茶的內(nèi)含成分造成影響。從圖1可以看出，在微波350 W下殺青，鮮葉的失水率隨著殺青時間的增加而增加。鮮葉的PPO酶活隨著殺青時間的延長而降低，其中60 s下降最明顯，從19.86 U降低到4.98 U，然后隨著殺青時間的延長酶活下降不明顯，在120 s時降低到最小值2.71 U。同時鮮葉的POD酶活也隨著殺青時間的延長而降低，但POD酶活下降的速度趨于平穩(wěn)。綜合考慮在微波殺青功率350 W下微波殺青時間對3個指標(biāo)（失水率、和PPO、POD活性）的影響，其最佳的殺青時間為90 s。

表1 不同攤放時間對在制葉含水量及品質(zhì)的影響

圖1 殺青時間對酶活和失水率影響

2.3 微波殺青功率對綠茶失水率和PPO、POD酶活的影響

從圖2可以看出，在殺青時間90 s下，鮮葉的失水率隨著殺青功率的增加而增加，在350 W時失水率增加明顯達(dá)到40.40%，然后隨著功率的增加失水率趨于平穩(wěn)。鮮葉的PPO酶活隨著殺青功率的增加而降低，其中350 W下降最明顯，從29.58 U降低到2.96 U，然后隨著殺青功率的增加酶活下降不明顯。同時鮮葉的POD酶活也隨著殺青功率的增加而降低，但POD酶活下降的速度趨于平穩(wěn)。綜合考慮在殺青時間90 s下微波殺青功率對其3個指標(biāo)失水率、和PPO、POD活性的影響，其最佳的殺青功率為350 W。

2.4 微波殺青、蒸青和炒青三種殺青方式對綠茶品質(zhì)的影響

微波殺青：將鮮葉經(jīng)撿剔后均勻攤放8 h，350 W微波殺青90 s，然后60 ℃烘箱干燥20 min。炒青工藝：將鮮葉經(jīng)撿剔后均勻攤放8 h，120 W（60 ℃）電磁爐炒青3 min，60 ℃烘箱干燥20 min。蒸青工藝：在已經(jīng)產(chǎn)生蒸汽的蒸屜上攤放10 g萎凋葉，平攤厚度1 cm左右，殺青時間5 min，取出后立即攤涼。

由表2可知，微波殺青、蒸青和炒青三種殺青方式制備的綠茶中的以微波殺青綠茶茶多酚含量最高為115.43 mg/g，其次為蒸青95.02 mg/g，最低為炒青47.05 mg/g。三種殺青方式制備的綠茶中以蒸青綠茶總氨基酸含量最高為10.53 mg/g，其次為微波殺青10.18 mg/g，最低為炒青9.60 mg/g。三種殺青方式制備的綠茶中以微波殺青綠茶總黃酮含量最高為71.15 mg/g，其次為蒸青57.03 mg/g，最低為炒青42.69 mg/g。

圖2 殺青功率的酶活和失水率的影響

由圖3可知，不同殺青方式制備的綠茶樣品對DPPH自由基的清除率總體趨勢是隨濃度的增加而提高，但當(dāng)質(zhì)量濃度增加到0.2 mg/mL后，DPPH·清除率隨濃度的增大不再明顯提高。相同濃度的微波殺青、蒸青和炒青綠茶樣品在質(zhì)量濃度低于0.15 mg/mL時，微波殺青綠茶對DPPH·清除率效果明顯高于蒸青和炒青；當(dāng)質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL時，微波殺青綠茶對DPPH·清除率效果與蒸青幾乎相同為45%，高于炒青綠茶的清除率37.8%；當(dāng)質(zhì)量濃度高于0.15 mg/mL時，微波殺青綠茶對DPPH·清除率效果高于蒸青和炒青，蒸青和炒青清除率相差不大。

圖3 殺青方式對DPPH·清除率影響

由表3可知，三種殺青方式制備的綠茶對DPPH·清除活性IC50值順序?yàn)檎羟啵境辞啵疚⒉⑶?，IC50的值越小說明對DPPH·的清除效果越好。說明微波殺青制備綠茶的DPPH·清除活性最強(qiáng)，其IC50值為0.141 mg/mL，但較VC 0.012 mg/mL弱；次之為炒青綠茶的DPPH·清除活性，其IC50值為0.198 mg/mL，其與蒸青綠茶的IC50值為0.196 mg/mL相當(dāng)。綜合考察微波殺青、蒸青和炒青三種殺青方式制備的綠茶的茶多酚、總氨基酸、總黃酮和對DPPH·清除率效果，微波殺青方式制備的綠茶品質(zhì)較好。

表3 殺青方式綠茶對DPPH·清除率活性的IC50值mg/mL

2.5 不同干燥方式對茶品質(zhì)的影響

三種干燥方式如下：60 ℃、120 W手工炒制20 min；60 ℃烘箱干燥20 min；先60 ℃、120 W手工炒制10 min，后60 ℃烘箱干燥10 min。

由表4可知，手工炒制、烘箱干燥和手工+烘箱干燥三種干燥方式制備的綠茶中以手工+烘箱綠茶茶多酚含量最高為124.62 mg/g，其次為烘箱干燥115.43 mg/g，最低為手工炒制104.20 mg/g。三種干燥方式制備的綠茶中以手工+烘箱綠茶總氨基酸含量最高為12.11 mg/g，其次為手工炒制11.34 mg/g，最低為烘箱干燥10.18。三種殺青方式制備的綠茶中以烘箱干燥綠茶總黃酮含量最高為71.15 mg/g，其次為手工+烘箱58.89 mg/g，與手工炒制58.87 mg/g相當(dāng)。

表4 干燥方式對綠茶各成分含量的影響 mg/g

由圖4可知，不同干燥方式制備的綠茶樣品對DPPH自由基的清除率總體趨勢是隨濃度的增加而提高，其中烘箱干燥綠茶樣品質(zhì)量濃度增加到0.25 mg/mL時，其對DPPH·清除率為69.44%，然后隨濃度的增大不再明顯提高，且均高于相同濃度的手工炒制和手工+烘箱綠茶樣品的清除率，其中手工+烘箱綠茶樣品的清除率相對較低。

由表5可知，三種干燥方式制備的綠茶對DPPH·清除活性IC50值順序?yàn)椋汉嫦涓稍铮臼止こ粗疲臼止?烘箱。說明烘箱干燥制備綠茶的DPPH·清除活性最強(qiáng)，其IC50值為0.140 5 mg/mL，但較VC 0.012 03 mg/mL弱；次之為手工炒制綠茶的DPPH·清除活性，其IC50值為0.215 6 mg/mL，其與手工+烘箱綠茶的IC50值為0.226 2 mg/mL相當(dāng)。綜合考察手工炒制、烘箱干燥和手工+烘箱干燥三種干燥方式制備的綠茶的茶多酚、總氨基酸、總黃酮和對DPPH·清除率效果，烘箱干燥方式制備的綠茶品質(zhì)較好。

圖4 不同干燥方式DPPH·清除率

表5 干燥方式綠茶對DPPH·清除率活性的IC50值

3 結(jié)論與討論

參考綠茶加工工藝制作小花清風(fēng)藤綠茶，對各工序關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行對比試驗(yàn)，獲得最佳小花清風(fēng)藤綠茶備工藝為：采取室內(nèi)自然攤青方式攤放8 h，此時葉形略皺縮、柔軟，有輕微清香；采用微波殺青方式，其最佳功率為350 W，最佳殺青時間為90 s；采用烘箱干燥方式，其最佳干燥方式為60 ℃干燥20 min。此工藝條件下制備的綠茶茶多酚含量為115.43 mg/g、總氨基酸含量為10.18 mg/g、總黃酮含量為71.15 mg/g，此總黃酮含量遠(yuǎn)高于原江峰等[18]制備連翹葉綠茶的26.48 mg/g。當(dāng)質(zhì)量濃度在0.35 mg/mL時，對DPPH自由基有較高的清除率，為74.11%，其IC50值為0.140 5 mg/mL。說明小花清風(fēng)藤綠茶有一定的清除自由基的作用，因此充分利用這一綠色資源開發(fā)各種保健品、食品添加劑、食品具有較好的市場。