趙 旭， 李 鑫， 張 菁， 郭蓓寧

喹諾酮類抗菌藥物具抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、不良反應(yīng)少、組織滲透性強(qiáng)等特征，為治療呼吸道感染、尿路感染等感染性疾病的常用抗菌藥物，有環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星等[1]。近年來(lái)開(kāi)發(fā)了不含氟的新型喹諾酮類抗菌藥物，且仍具有強(qiáng)大的抗菌活性，奈諾沙星是其中的代表[2]。它具有廣譜抗菌活性，對(duì)各種革蘭陽(yáng)性菌和陰性菌、厭氧菌及非典型病原體均有良好抗菌作用[3]。目前該藥已經(jīng)上市。

近年來(lái)對(duì)抗菌藥物的研究顯示，抗菌藥物一方面可以直接對(duì)病原菌起到殺菌或抑菌作用，另一方面也可通過(guò)調(diào)節(jié)宿主免疫功能清除病原菌，保護(hù)宿主的重要臟器功能[4]。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，氟喹諾酮類抗菌藥物對(duì)宿主的非特異性和特異性免疫均有調(diào)控作用。如加替沙星能顯著增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬作用并提高細(xì)胞內(nèi)殺菌能力[5]。在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥小鼠模型中，環(huán)丙沙星可以抑制宿主產(chǎn)生的腫瘤壞死因子（TNF）-α、白介素（IL）-6等炎癥前細(xì)胞因子，從而抑制LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)[6-7]。然而，本研究以奈諾沙星為研究對(duì)象，采用體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)研究奈諾沙星對(duì)LPS誘導(dǎo)炎性反應(yīng)的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 RAW264.7細(xì)胞是小鼠單核巨噬細(xì)胞系，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.1.2 試劑 奈諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品由浙江醫(yī)藥提供；DMEM培養(yǎng)液（高糖）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；青霉素、鏈霉素雙抗、LPS 、二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；類胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；96孔酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/C小鼠50只，鼠齡8～10周，體質(zhì)量20～25 g，雄性，合格證號(hào)為SCXK（滬）：2017-0002，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。小鼠飼養(yǎng)溫度18～25℃，相對(duì)濕度50%～70%。

1.2 方法

1.2.1 體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)方法 自-80℃冰箱中取出RAW264.7細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基（含青霉素、鏈霉素雙抗），在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培育至生長(zhǎng)約80%傳代，取4～5 代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，以5×105/mL的密度接種于12孔板中培育至約80%進(jìn)行LPS誘導(dǎo)炎性反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天吸去細(xì)胞培養(yǎng)基隨即加入新鮮的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基后孵育2 h，然后按不同組別加入奈諾沙星、LPS進(jìn)行孵育。實(shí)驗(yàn)分為4組，組1：奈諾沙星+LPS組，先將400 μg/mL奈諾沙星溶液20 μL加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)基（奈諾沙星終濃度為4 μg/ mL），2 h后再加入1 μg/mL LPS 20 μL（LPS終濃度為10 ng/mL）繼續(xù)培養(yǎng)；組2：LPS組，僅加入1 μg /mL LPS 20 μL；組3：奈諾沙星組，僅加入400 μg/mL奈諾沙星20 μL；組4：空白對(duì)照組，不加奈諾沙星和LPS。在加入LPS后3 h、6 h、12 h、24 h分別收集4組的細(xì)胞培養(yǎng)上清液置-80℃保 存。

1.2.2 低劑量LPS誘導(dǎo)小鼠內(nèi)毒素血癥模型及奈諾沙星干預(yù) 將30只小鼠隨機(jī)分為6組，每組5只。組 1：奈諾沙星10 mg/kg+LPS組，在實(shí)驗(yàn)當(dāng)日小鼠腹腔注射奈諾沙星10 mg/kg，2 h后腹腔注射LPS 5 mg/kg；組2：奈諾沙星40 mg/kg+LPS組，小鼠腹腔注射奈諾沙星40 mg/kg，2 h后腹腔注射LPS 5 mg/ kg；組3：奈諾沙星10 mg/kg組，只注射奈諾沙星10 mg/kg，不注射LPS；組4：奈諾沙星40 mg/ kg組，只注射奈諾沙星40 mg/kg，不注射LPS；組5：LPS組，只注射LPS，不注射奈諾沙星；組6：空白對(duì)照組，不注射LPS和奈諾沙星。在注射LPS后1 h、3 h、6 h、12 h及24 h每組小鼠均眼眶取血，并立即離心取血清，置于-20℃保存。

1.2.3 細(xì)胞因子檢測(cè) 采用ELISA 方法測(cè)定上述細(xì)胞培養(yǎng)上清液和小鼠血清中IL-6、IL-10以及TNF-α含量，按照ELISA試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行檢 測(cè)。

1.2.4 奈諾沙星對(duì)高劑量LPS致小鼠死亡的保護(hù)作用 20只小鼠隨機(jī)分為4組，每組5只。組 1：LPS 12.5 mg/kg組，每只小鼠腹腔注射LPS 12.5 mg/ kg，2 h后注射0.9% NaCl溶液，1次/12 h作為對(duì)照；組2：奈諾沙星+LPS 12.5 mg/kg組，每只小鼠腹腔注射LPS 12.5 mg/kg，2 h后腹腔注射奈諾沙星40 mg/kg，1 次 /12 h，用藥和觀察兩組小鼠的死亡至72 h；組3：LPS 25 mg/kg組，每只小鼠腹腔注射LPS劑量改為25 mg/kg，余操作同組1；組4：奈諾沙星+LPS 25 mg/kg組，每只小鼠腹腔注射LPS劑量改為25 mg/ kg，余操作同組 2。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPadPrism 5.0 進(jìn)行死亡率作圖和分析。數(shù)據(jù)整理后，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組之間計(jì)量數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)，兩組之間死亡率采用Fisher精確檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果

2.1 體外奈諾沙星對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子的干預(yù)

檢測(cè)顯示，LPS組和奈諾沙星+LPS組IL-6水平均隨時(shí)間延長(zhǎng)明顯升高，其中12 h達(dá)最高峰。奈諾沙星+LPS組在3 h、6 h、12 h的 IL-6水平比LPS組低，其中3 h和6 h點(diǎn)兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 6和P=0.003 5）（圖1A）。對(duì)TNF-α檢測(cè)，奈諾沙星+LPS組在3 h TNF-α水平比LPS組明顯降低，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.007 9），但在6 h和12 h奈諾沙星+LPS組與LPS組基本相仿（圖1B）。與IL-6和TNF-α等促炎細(xì)胞因子不同，IL-10系抑炎細(xì)胞因子，IL-10表達(dá)量越高對(duì)炎癥的抑制作用越強(qiáng)。奈諾沙星+LPS組和LPS組的IL-10水平也隨著時(shí)間延長(zhǎng)而明顯升高，在3 h時(shí)兩組基本相似，但在6 h和12 h奈諾沙星+LPS組較LPS組IL-10水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.005和0.034）（圖1C）。無(wú)論哪一種細(xì)胞因子，奈諾沙星組和空白對(duì)照組的細(xì)胞因子水平基本均為0，提示無(wú)LPS存在時(shí)，奈諾沙星本身對(duì)巨噬細(xì)胞無(wú)刺激或抑制作用。

圖1 ELISA 方法測(cè)定4組巨噬細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子含量Figure 1 Cytokine levels in macrophage supernatant determined by ELISA after different treatments

2.2 奈諾沙星對(duì)低劑量LPS誘導(dǎo)的小鼠內(nèi)毒素血癥的影響

在低劑量LPS（5 mg/kg）誘導(dǎo)小鼠內(nèi)毒素血癥模型中，無(wú)論LPS組、奈諾沙星10 mg/kg+LPS組或奈諾沙星40 mg/kg+LPS組，IL-6、TNF-α及IL-10水平均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。對(duì)于IL-6，LPS組與兩組奈諾沙星+LPS組的水平均在1～3 h呈上升趨勢(shì)，至3 h達(dá)最高峰，之后迅速下降，至12 h基本為0；在1 h和3 h，兩組奈諾沙星+LPS組與LPS組基本相仿，但在6 h奈諾沙星10 mg/kg+LPS組及奈諾沙星40 mg/kg+LPS組IL-6水平較LPS組明顯降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.005和0.006）（圖2A）。TNF-α水平峰值出現(xiàn)更早，在1 h即出現(xiàn)最高峰，之后迅速下降，至6 h基本為0；但在1 h和3 h，奈諾沙星10 mg/kg+LPS組及奈諾沙星40 mg/kg+LPS組較LPS組TNF-α水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1 h時(shí)P值分別為0.047和0.037，3 h時(shí)P值分別為0.022和0.021）（圖2B）。三組IL-10水平均在1 h出現(xiàn)峰值，之后不斷下降，至12 h基本為0；在1 h奈諾沙星10 mg/kg+LPS組及奈諾沙星40 mg/ kg+LPS組IL-10水平均較LPS組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.005和0.002）；其中在1 h時(shí)奈諾沙星40 mg/kg+LPS組IL-10水平較奈諾沙星10 mg/ kg+LPS組更高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.073）（圖2C）；奈諾沙星40 mg/ kg+LPS組與10 mg/kg+LPS組在其余各時(shí)間點(diǎn)各種細(xì)胞因子水平基本相仿。與體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，兩組奈諾沙星組與空白對(duì)照組檢測(cè)到的細(xì)胞因子水平基本均為0，提示無(wú)LPS存在時(shí)，奈諾沙星本身對(duì)小鼠血清細(xì)胞因子水平無(wú)調(diào)控作用。

2.3 奈諾沙星對(duì)高劑量LPS致小鼠死亡的保護(hù)作 用

奈諾沙星+LPS 25 mg/kg組和LPS 25 mg/ kg組的小

鼠死亡率均為100%。奈諾沙星+LPS 12.5 mg/ kg組小鼠無(wú)死亡；LPS 12.5 mg/kg組在36 h有1只小鼠死亡，在60 h有2只小鼠死亡，總死亡率3/5，提示奈諾沙星對(duì)LPS引起的內(nèi)毒素血癥致小鼠死亡有保護(hù)作用。兩組死亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.080）。奈諾沙星+LPS 12.5 mg/kg組和LPS 12.5 mg/kg組兩組生存曲線比較，見(jiàn)圖 3。

圖2 ELISA 方法測(cè)定6組小鼠血清中細(xì)胞因子含量Figure 2 Serum level of cytokines determined by ELISA in mice after different treatments

圖3 注射高劑量LPS（12.5 mg/kg）后兩組小鼠的生存率Figure 3 The survival rate of mice after treatment with LPS（12.5 mg/kg）alone and LPS+nemonoxacin

3 討論

作為一種不含氟的新型喹諾酮類抗菌藥物，奈諾沙星對(duì)于臨床上治療較為困難的耐藥菌如甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA）、青霉素耐藥肺炎鏈球菌（PRSP）、糞腸球菌等的抗菌作用優(yōu)于其他喹諾酮類。既往對(duì)該藥的研究主要集中在作用機(jī)制、抗菌活性、藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)等方面[8-11]，未涉及對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)控作用。

本實(shí)驗(yàn)采用體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究奈諾沙星對(duì)LPS誘導(dǎo)炎性反應(yīng)的調(diào)控作用。體外實(shí)驗(yàn)選擇巨噬細(xì)胞作為L(zhǎng)PS誘導(dǎo)炎性反應(yīng)的作用細(xì)胞，這是鑒于巨噬細(xì)胞構(gòu)成機(jī)體防御病原微生物感染的第一道防線，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。而且巨噬細(xì)胞通過(guò)識(shí)別、吞噬及抗原遞呈清除抗原性異物，同時(shí)通過(guò)分泌TNF-α、IL-6 等炎性因子及IL-8 等趨化因子，促進(jìn)急性期免疫反應(yīng)，加速對(duì)病原體的清除[12]。對(duì)喹諾酮類體外免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究中多有采用LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞這一感染模型[13-14]。而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究喹諾酮類對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)控作用，也常采用腹腔注射LPS誘導(dǎo)小鼠引起內(nèi)毒素血癥這一模型[15]。因?yàn)長(zhǎng)PS無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而引起的機(jī)體炎性反應(yīng)強(qiáng)烈，抗菌藥物對(duì)其沒(méi)有作用，故而此模型非常適合應(yīng)用于研究抗菌藥物的免疫調(diào)控作用機(jī)制。

奈諾沙星的臨床藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示，健康志愿者單次服用500 mg奈諾沙星后，血藥峰濃度（Cmax）為5.91 μg/mL[16]，據(jù)此本研究選擇細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)沃Z沙星的濃度為4 μg/mL，與單劑口服奈諾沙星的Cmax基本相似。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在無(wú)LPS誘導(dǎo)的情況下，奈諾沙星對(duì)巨噬細(xì)胞無(wú)作用。但是當(dāng)LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7產(chǎn)生炎性反應(yīng)，IL-6、TNF-α等前炎性因子明顯升高時(shí)，奈諾沙星對(duì)這兩種促炎因子均顯示為抑制作用，而對(duì)IL-10抑炎因子則顯示為促進(jìn)作用。對(duì)氟喹諾酮類的其他品種也有許多體外實(shí)驗(yàn)的相關(guān)研究，但各種不同品種氟喹諾酮類對(duì)LPS刺激單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的調(diào)控作用不完全相同。如5～20 μg/ mL的莫西沙星對(duì)LPS刺激THP-1 細(xì)胞產(chǎn)生的IL-8抑制作用達(dá)26%～40%，對(duì)TNF-α抑制作用達(dá)14%～51%，對(duì)IL-1β的抑制作用達(dá)50%～83%[17]。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示奈諾沙星對(duì)促炎因子有抑制作用，對(duì)抑炎因子有促進(jìn)作用。這一作用在抗感染治療中可能具有積極意義。這是因?yàn)門NF-α等雖然能刺激單核巨噬細(xì)胞及其他細(xì)胞分泌趨化細(xì)胞因子，引起白細(xì)胞在炎癥部位的聚集，從而吞噬或殺滅病原微生物。但過(guò)量的細(xì)胞因子常可導(dǎo)致過(guò)度免疫反應(yīng)，如過(guò)量TNF-α分泌入血可引起多臟器和免疫系統(tǒng)的損害，而過(guò)量IL-6常作為內(nèi)源性致熱源引起宿主發(fā)熱[18-19]。因此，奈諾沙星等喹諾酮類抗菌藥物對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生強(qiáng)烈炎性反應(yīng)時(shí)能抑制IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，可以在一定程度上抑制機(jī)體過(guò)度的免疫反應(yīng)，保護(hù)宿主重要臟器功能。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，且在動(dòng)物水平驗(yàn)證了奈諾沙星可以抑制LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，對(duì)機(jī)體有保護(hù)作用，同時(shí)能降低LPS引起的內(nèi)毒素血癥的死亡率。而奈諾沙星+LPS 25 mg/ kg組和LPS 25 mg/kg組，兩組小鼠全部死亡，這可能由于LPS劑量過(guò)大，內(nèi)毒素血癥過(guò)于嚴(yán)重，奈諾沙星免疫介導(dǎo)作用不足以挽救小鼠生命。在奈諾沙星+LPS 12.5 mg/kg組，小鼠無(wú)死亡，而LPS 12.5 mg/kg組總體死亡3/5，由于本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)樣本量較小，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.08），但結(jié)果仍可提示奈諾沙星能降低因LPS引起嚴(yán)重內(nèi)毒素血癥小鼠的死亡。其他氟喹諾酮類抗菌藥物也有類似的免疫保護(hù)作用。如小鼠腹腔注射4.5 mg或6 mg環(huán)丙沙星，再注射1 mg LPS，小鼠無(wú)死亡 ，而LPS組小鼠死亡率為100%[7]。本研究低劑量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在無(wú)LPS誘導(dǎo)的情況下，奈諾沙星對(duì)宿主免疫系統(tǒng)無(wú)作用，但是當(dāng)腹腔注射LPS無(wú)論奈諾沙星10 mg/kg+LPS或奈諾沙星40 mg/kg+LPS組小鼠血清中的IL-6（6 h）、TNF-α（1 h和3 h）水平均明顯低于LPS組小鼠；而抑炎因子IL-10（1 h）則升高，高于LPS組。提示LPS致小鼠膿毒血癥實(shí)驗(yàn)中，奈諾沙星對(duì)IL-6、TNF-α均顯示為抑制作用，而對(duì)IL-10則顯示促進(jìn)作用。

以上研究結(jié)果顯示，奈諾沙星作為一種新型不含氟的喹諾酮類抗菌藥物，與許多氟喹諾酮類藥物相似，除了抗菌作用外，對(duì)宿主感染具有免疫調(diào)節(jié)作用，而且此免疫調(diào)節(jié)作用是正向的、積極的，可以抑制宿主產(chǎn)生的過(guò)度免疫反應(yīng)，這將有助于改善重癥感染性疾病免疫功能，并可能提高疾病治療的有效性。