扎西窮達(dá),劉吉愛(ài),曹葉偉,王軍
1(西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)研究院,西藏 拉薩,850000) 2(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京,100083)
酥油在藏族人民飲食結(jié)構(gòu)中扮演著重要的角色[1]。牦牛酥油是牦牛乳發(fā)酵后提煉得到的,具有獨(dú)特的風(fēng)味和豐富的營(yíng)養(yǎng),深受藏族同胞的喜愛(ài)[2-3]。在青藏高原地區(qū),每年7~9月盛產(chǎn)牦牛酥油,具有獨(dú)特的口感和香氣。牦牛酥油的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,又具有一定的特殊功能,越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。目前有關(guān)牦牛酥油中功能脂肪酸和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)研究很多[4]。其中,研究發(fā)現(xiàn)西藏牦牛酥油中的游離脂肪酸含量明顯高于其他奶類(lèi)脂肪,藏牦牛酥油中的亞麻酸比普通奶油高3倍[6],亞油酸是普通奶油的2倍多[7-8],二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA) 僅存于牦牛酥油中[5]。對(duì)牦牛酥油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究,主要集中在利用固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME)富集后利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行定性分析。薛璐等采用固相微萃取頂空氣相-質(zhì)譜法測(cè)定了內(nèi)蒙酥油中的風(fēng)味物質(zhì),在內(nèi)蒙古酥油中共檢出22種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[9]。HU等[10]和魯玉俠等[11]利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在牦牛酥油中鑒定出了28種不同的風(fēng)味物質(zhì)等。牦牛酥油風(fēng)味獨(dú)特,但仍然缺乏其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與普通奶油之間的差別分析,以及是否含有特征風(fēng)味成分的研究報(bào)道。牦牛酥油經(jīng)發(fā)酵而成,與其他奶油加工工藝不同[12],具有獨(dú)特風(fēng)味。但僅從外觀形狀和色澤無(wú)法將其與其他奶油類(lèi)樣品進(jìn)行區(qū)分,因此市場(chǎng)上存在著將其他奶油類(lèi)產(chǎn)品與牦牛酥油混淆的情況。因此,需要研究牦牛酥油與其他奶油產(chǎn)品間揮發(fā)性物質(zhì)的差異,尋找它們之間的關(guān)鍵的差別物質(zhì),為區(qū)分牦牛酥油與其他奶油制品提供依據(jù)。
同時(shí)蒸餾萃取法(simultaneous-distextraction, SDE)在食品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究具有較好重復(fù)性,操作簡(jiǎn)便、富集效果好、受基質(zhì)影響小[13-15]。本研究利用同時(shí)蒸餾萃取法對(duì)牦牛酥油中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行提取和富集,再利用氣相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行分析,對(duì)牦牛酥油和其他奶油類(lèi)樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析比較,尋找牦牛酥油中存在的特征揮發(fā)性物質(zhì),并對(duì)其進(jìn)行定量分析。
試驗(yàn)材料如表1所示。
7890B-597氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析色譜儀,美國(guó)安捷倫公司;同時(shí)蒸餾萃取裝置,安徽東冠設(shè)備有限公司;恒溫電熱套,力辰科技;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;萬(wàn)分之一天平(感量0.000 1g),英國(guó)Adam公司。
標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品:乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯,北京百靈威科技有限公司;戊酸乙酯、TCI,化成工業(yè)發(fā)展有限公司。
表1 樣品信息Table 1 Sample information
試劑:二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷(色譜純),北京百靈威科技有限公司;無(wú)水Na2SO4(分析純),北京康普匯維科技有限公司。
2.1.1 定性分析樣品制備
稱取20 g樣品于圓底燒瓶中,加蒸餾水50 mL,并加入少許沸石,在萃取瓶中加入50 mL萃取溶劑乙酸乙酯、正己烷和二氯甲烷),裝入同時(shí)蒸餾萃取裝置,設(shè)置恒溫電熱套溫度,使兩端萃取瓶溫度處于微沸狀態(tài),蒸餾萃取一定時(shí)間后冷卻,然后將萃取液用無(wú)水Na2SO4干燥去水,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1 mL左右,再用萃取溶劑定容至2.0 mL,用0.22 μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾后進(jìn)行GC-MS分析。
2.1.2 定量分析樣品制備
準(zhǔn)確稱取20 g樣品(精確到0.1 mg)于圓底燒瓶,加蒸餾水50 mL,并加入少許沸石,在萃取瓶中加入50 mL二氯甲烷,裝入同時(shí)蒸餾萃取裝置,設(shè)置恒溫電熱套溫度,兩端萃取瓶溫度處于微沸狀態(tài),蒸餾萃取4 h,冷卻后,然后將萃取液用無(wú)水Na2SO4干燥去水,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1 mL左右,加入20 μL 1 mg/mL戊酸乙酯(內(nèi)標(biāo)),用二氯甲烷定容到2.0 mL,用0.22 μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾后用GC-MS進(jìn)行定量分析。
2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品制備
標(biāo)準(zhǔn)工作液:準(zhǔn)確量取乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液,用二氯甲烷稀釋至刻度,制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液:準(zhǔn)確量取戊酸乙酯液,用二氯甲烷稀釋至刻度,制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。
2.1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)工作液,用二氯甲烷稀釋至1.0 mL,制成質(zhì)量濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0 μg/mL的標(biāo)液,加入的內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為10 μg/mL。
2.2.1 色譜條件
色譜柱:DB-wax柱(30 m×250 μm×0.25 μm);進(jìn)樣口溫度:250 ℃;流速:1.5 mL/min;柱溫:40 ℃保持4 min,5 ℃/min上升到100 ℃保持2 min,3 ℃/min上升到150 ℃,10 ℃/min上升到230 ℃保持8 min;進(jìn)樣量:1 μL;進(jìn)樣方式:分流模式(分流10∶1)。
2.2.2 質(zhì)譜條件
2.2.2.1 定性分析質(zhì)譜條件
接口溫度:240 ℃;離子源溫度:230 ℃;四極桿溫度:150 ℃;掃描模式:SCAN;電離方式:EI。
2.2.2.2 定量分析質(zhì)譜條件
接口溫度:240 ℃;離子源溫度:230 ℃;四極桿溫度:150 ℃;掃描模式:SIM;電離方式:EI;定量分析:SIM分析,條件見(jiàn)表2。
表2 SIM分析條件Table 2 The condition of SIM scan
2.3.1 揮發(fā)性物質(zhì)定性分析
通過(guò)氣相-質(zhì)譜儀分析出總離子流圖,通過(guò)保留時(shí)間和NIST譜庫(kù)檢索,選取匹配度均大于800的進(jìn)行化合物鑒定,該結(jié)果為定性結(jié)果。
2.3.2 乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯定量分析
樣品經(jīng)過(guò)同時(shí)蒸餾萃取后以戊酸乙酯為內(nèi)標(biāo),采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)這3種酯類(lèi)進(jìn)行定量分析。
3.1.1 萃取溶劑優(yōu)化
選取酥油1樣品以同時(shí)蒸餾萃取法(SDE)萃取揮發(fā)性物質(zhì),分別用乙酸乙酯、正己烷和二氯甲烷3種不同極性的溶劑[16-18]萃取,分析對(duì)比萃取液GC-MS總離子流圖,酥油1樣品不同萃取液的氣-質(zhì)聯(lián)用分析總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。
圖1 采用不同萃取溶劑的SDE方法萃取得到的揮發(fā)性物質(zhì)氣質(zhì)聯(lián)用總離子流色譜圖Fig.1 The total ion chromatogram of volatile compounds by SDE with different extracting solvents
由圖1分析比較得出,3種萃取溶劑中,二氯甲烷溶劑的極性適中,同時(shí)蒸餾萃取過(guò)程中萃取到的樣品所含的揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)最多,色譜峰面積較大,故本方法選用二氯甲烷作為同時(shí)蒸餾萃取溶劑,采用SDE法對(duì)各種牦牛酥油和其他類(lèi)奶油制品中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性分析。
3.1.2 牦牛酥油和其他類(lèi)奶油揮發(fā)性成分對(duì)比
6種牦牛酥油類(lèi)樣品和8種奶油類(lèi)樣品中揮發(fā)性物質(zhì)定性分析見(jiàn)表3。
表3 牦牛酥油和其他奶制品中揮發(fā)性物質(zhì)定性分析Table 3 The qualitative analysis of volatile compounds in yak butter and other similar dairy products
續(xù)表3
分類(lèi)化合物名稱牦牛酥油其他類(lèi)酥油1酥油2酥油3酥油4酥油5酥油6奶油黃油蛋糕奶油奶酪再制干酪稀奶油植物黃油加鹽黃油酯類(lèi)丁位十二內(nèi)酯++----++-+++++丁位十四內(nèi)酯+-----++--+-++丁位癸內(nèi)酯++++++++-+++++油酸甲酯--+-----------棕櫚酸甲酯-----------+--亞油酸乙酯--+-----------月桂酸乙酯----+---------酮類(lèi)2-戊酮++++-+-+------2-己酮--+-----------2-庚酮++++++++++++-+2-壬酮++++++-+++++-+8-壬烯-2-酮--+-----------2-十一酮++++++++++++++2-辛酮--+--+-----+--2-十三酮------+-+-----2-十五酮--------+-----2-十三烷酮++++++-+-+++++2-十五烷酮++++++++-+++++3-羥基-2-丁酮----++---++++-醇類(lèi)2-戊醇-++--+--------2-庚醇---+++--------正丁醇--------------苯甲醇--+-----------糠醇--+---+--+++--2-壬基醇-----+--------烷類(lèi)十二烷+---+++-------十四烷--+-+++-------十五烷+-+-+---------十七烷----+----+----十八烷----+--------+十九烷----+---------二十一烷----+---------二十四烷----+---------二十六烷----+---------二十七烷----+---------二十八烷----+------- --醛類(lèi)壬醛---------+-- --糠醛+--++---+-----苯甲醛--------+-----其他類(lèi)甲苯++++--++++----苯乙烯-+----+-------N,N-二甲基甲酰胺-+-+--+-+-++--N,N-二甲基乙酰胺-+-+---++-----1,3-二叔丁基苯-----+--------苯胺-----+------++合計(jì)343136283325141813141512912
注:“+”表示樣品中檢測(cè)到該化合物質(zhì),“-”表示樣品中未檢測(cè)到該化合物質(zhì)。
從表3分析看出,牦牛酥油中共鑒定出65種揮發(fā)性物質(zhì),其中酸類(lèi)19種,酯類(lèi)12種,烷類(lèi)11種,酮類(lèi)10種,醇類(lèi)5種,醛類(lèi)1種,其他類(lèi)6種;其他類(lèi)奶油樣品中共鑒定出41種揮發(fā)性物質(zhì),其中酸類(lèi)9種,酯類(lèi)8種,烷類(lèi)4種,酮類(lèi)10種,醇類(lèi)1種,醛類(lèi)3種,其他類(lèi)5種。鑒定化合物中酸類(lèi)和酯類(lèi)所占比例最高。不同牦牛酥油的制備方法略有不同,所以揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)并不完全相同,但大多數(shù)含乳酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯3種酯類(lèi),而這些特征性酯類(lèi)物質(zhì)在8種其他奶油類(lèi)樣品中都未檢測(cè)到。乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯可作為牦牛酥油特征性揮發(fā)性物質(zhì),這些物質(zhì)的產(chǎn)生與牦牛酥油制備時(shí)特殊的發(fā)酵工藝密切相關(guān)[19-23]??蛇M(jìn)一步通過(guò)內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立酥油中這些特征揮發(fā)性物質(zhì)的定量方法,為牦牛酥油的鑒別和品質(zhì)評(píng)價(jià)提供參考。
3.2.1 萃取時(shí)間對(duì)定量結(jié)果影響
為了探究二氯甲烷萃取溶液是否將牦牛酥油中的特征揮發(fā)性物提取完全,對(duì)不同蒸餾萃取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化研究,分別研究1、2、3、4、5、6 h的效果。乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯在不同萃取時(shí)間的提取效果見(jiàn)圖2。
從圖2可看出,在1~4 h內(nèi),乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯的質(zhì)量濃度逐漸上升,4~6 h,曲線趨于平穩(wěn),表明萃取4 h左右時(shí),可將牦牛酥油中的這3種特征揮發(fā)性物質(zhì)提取完全,故本方法采用4 h蒸餾萃取。
3.2.2 線性關(guān)系和檢出限
配制標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度1.0~50.0 μg/mL,加入內(nèi)標(biāo)溶液濃度10.0 μg/mL,采用內(nèi)標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取20.0 g左右樣品,經(jīng)同時(shí)蒸餾萃取后定容至2.0 mL,根據(jù)S/N=3分別計(jì)算出這3種酯類(lèi)的檢出限,乳酸乙酯0.13 μg/kg、辛酸乙酯0.18 μg/kg、癸酸乙酯0.17 μg/kg,詳見(jiàn)表4。
表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性與檢出限Table 4 The standard curve and limit of detection
本方法線性關(guān)系R2≥0.997,線性關(guān)系良好;檢出限值低,靈敏度高。
3.2.3 準(zhǔn)確性和精密度
向酥油1樣品中分別加入0.05、0.02、0.01 mL乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL),各做3份平行處理,實(shí)際加入量為高、中、低3個(gè)不同濃度:2.5、1.0、0.5 mg/kg,進(jìn)行回收率測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表5。
表5 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(n=3)Table 5 The recovery and relative standard deviation
從表4可以看出,乳酸乙酯回收率在86.7%~104.7%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.14%~1.37%;辛酸乙酯回收率在89.3%~105.7%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.66%~1.37%;癸酸乙酯回收率在83.3%~89.5%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.59%~1.77%。
酥油1號(hào)樣品,同時(shí)蒸餾萃取處理5份,分析乳酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯含量,進(jìn)一步得到本方法測(cè)定的樣品的精密度,結(jié)果見(jiàn)表6。
表6 樣品分析相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(n=5)Table 6 The relative standard deviation of sample analysis
由表6可以看出,方法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差乳酸乙酯為1.32%,辛酸乙酯為1.80%,癸酸乙酯為2.08%。本方法具有較好的線性關(guān)系,靈敏度高、準(zhǔn)確性好,適合牦牛酥油中乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等特征揮發(fā)性成分的定量分析。
3.2.4 牦牛酥油特征性揮發(fā)性物質(zhì)定量分析
用戊酸乙酯做內(nèi)標(biāo)物質(zhì),對(duì)酥油1、酥油2、酥油3、酥油4、酥油5和酥油6六種不同品質(zhì)的牦牛酥油樣品中的乳酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯進(jìn)行定量分析,為了更好的消除基質(zhì)干擾,準(zhǔn)確定量,根據(jù)這3種酯類(lèi)保留時(shí)間和質(zhì)荷比的差異,采用SIM模式,分3個(gè)時(shí)間段(6~12 min、12~16 min、16~24 min)掃描,分別對(duì)化合物選擇1個(gè)定量和定性離子進(jìn)行分析,圖3為標(biāo)準(zhǔn)品和牦牛酥油樣品中乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯在SIM模式下的總離子流色譜圖。
A-標(biāo)準(zhǔn)品;B-樣品;1-戊酸乙酯(內(nèi)標(biāo)); 2-乳酸乙酯;3-辛酸乙酯;4-癸酸乙酯圖3 標(biāo)準(zhǔn)品和牦牛酥油樣品SIM掃描離子流色譜圖Fig.3 The SIM chromatogram of standard and yak butter sample
用二氯甲烷同時(shí)蒸餾萃取處理牦牛酥油后,采用內(nèi)標(biāo)法定量分析,各樣品中乳酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯含量見(jiàn)表7。
表7 牦牛酥油特征揮發(fā)性物質(zhì)含量Table 7 The content of characteristic volatile compounds in yak butter
可以看出,牦牛酥油中乳酸乙酯含量范圍在0.54~5.14 mg/kg;辛酸乙酯含量范圍在0.28~2.20 mg/kg;癸酸乙酯含量范圍在0.34~3.84 mg/kg,這與牦牛乳發(fā)酵制作酥油的特殊工藝和發(fā)酵時(shí)間的控制相關(guān)。
利用同時(shí)蒸餾萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用分析對(duì)牦牛酥油進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)牦牛酥油中共鑒定出65種揮發(fā)性物質(zhì),其中酸類(lèi)19種,酯類(lèi)12種,烷類(lèi)11種,酮類(lèi)10種,醇類(lèi)5種,醛類(lèi)1種,其他類(lèi)6種;其他類(lèi)奶油樣品中共鑒定出41種揮發(fā)性物質(zhì),其中酸類(lèi)9種,酯類(lèi)8種,烷類(lèi)4種,酮類(lèi)10種,醇類(lèi)1種,醛類(lèi)3種,其他類(lèi)5種。牦牛酥油樣品揮發(fā)性物質(zhì)含量高于其他奶制品,且含有乳酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯這3種酯類(lèi),這些特征性酯類(lèi)物質(zhì)在其他8種外形相似的奶制品中都未檢測(cè)到。作為牦牛酥油中含量較為豐富的特征揮發(fā)性物質(zhì),乳酸乙酯味道濃厚,苦澀微甜;辛酸乙酯味甜,具有梨香、菠蘿的香味;而癸酸乙酯具有白蘭地醇香[24-31]。
對(duì)牦牛酥油復(fù)雜基質(zhì)中這3種特征酯類(lèi)物質(zhì),采用同時(shí)蒸餾萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用的方法進(jìn)行定量分析,建立了內(nèi)標(biāo)定量分析方法,線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.997,線性范圍1.0~50.0 μg/mL;乳酸乙酯檢出限0.13 μg/kg、回收率86.7 %~104.7%;辛酸乙酯檢出限0.18 μg/kg、回收率89.3 %~105.7%;癸酸乙酯檢出限0.17 μg/kg、回收率83.3%~89.5%;相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值<2.1%。方法具有較好的線性,靈敏度、準(zhǔn)確性較高,可應(yīng)用在牦牛酥油中乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯特征揮發(fā)性成分分析中。本檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)單、試劑耗用量少、去除復(fù)雜樣品基質(zhì)干擾效果明顯等優(yōu)點(diǎn)。測(cè)定6種牦牛酥油樣品,乳酸乙酯含量范圍在0.54~5.14 mg/kg,辛酸乙酯范圍在0.28~2.20 mg/kg,癸酸乙酯范圍在0.34~3.84 mg/kg。牦牛酥油與其他奶制品間揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)與含量存在較明顯的差異,該方法可為區(qū)分牦牛酥油與其他相似奶制品、以及評(píng)價(jià)不同酥油間的風(fēng)味品質(zhì)、改善加工工藝提供參考方法。