陳園園，程慧，李寧娜，蘇珂，李佳雨，夏華龍，徐國強(qiáng)*,張梁*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫,214122)2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫,214122) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫,214122)

琥珀酸是一種二元羧酸，作為眾多化工產(chǎn)品的合成前體，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料、香料、油漆、食品、塑料等行業(yè)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，琥珀酸能夠促進(jìn)脂肪燃燒，這將為解決肥胖癥提供新的研究思路[2]。目前琥珀酸的工業(yè)化生產(chǎn)主要依賴于化學(xué)合成法[3-4]，而化學(xué)合成法生產(chǎn)的琥珀酸難以達(dá)到食用要求。為解決這一難題，越來越多的研究者致力于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸[5-8]。釀酒酵母因其安全、無毒素分泌已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵工業(yè)。同時釀酒酵母具備耐高滲[9]、耐低pH[10]的優(yōu)點(diǎn)，因此更多的研究者致力于通過代謝工程手段促進(jìn)釀酒酵母積累琥珀酸。但目前存在以下問題尚須解決[11]：(1)高效的琥珀酸合成途徑的構(gòu)建；(2)進(jìn)入三羧環(huán)循環(huán)(tricarboxylic acid, TCA)的碳流量的加強(qiáng)。

菌體內(nèi)的琥珀酸作為TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物,在琥珀酸脫氫酶作用下轉(zhuǎn)化為富馬酸，而琥珀酸脫氫酶由基因SDH1、SDH2、SDH3和SDH4編碼[12]。因此，弱化琥珀酸脫氫酶成為構(gòu)建琥珀酸積累途徑的首要條件。如OTERO等[13]敲除琥珀酸脫氫酶基因SDH3、3-磷酸甘油酸脫氫酶同工酶基因SER3和SER33,成功利用乙醛酸支路積累琥珀酸；RAAB等[14]則敲除基因SDH1、SDH2和異檸檬酸脫氫酶基因IDH1、IDP1,同時利用TCA還原途徑和乙醛酸支路實(shí)現(xiàn)琥珀酸積累。丙酮酸羧化酶(pyruvate acid，PC)作為菌體內(nèi)草酰乙酸回補(bǔ)途徑關(guān)鍵酶，成為增強(qiáng)TCA循環(huán)碳流量的關(guān)鍵。如YAN等[15]過量表達(dá)釀酒酵母本身的丙酮酸羧化酶基因PYC2，促進(jìn)了琥珀酸的積累。本課題組前期在探究代謝工程手段改造釀酒酵母積累富馬酸時發(fā)現(xiàn)，來源于米根霉的丙酮酸羧化酶基因(RoPYC)較釀酒酵母本身的PYC2更能促進(jìn)富馬酸的積累[16]。

本實(shí)驗以釀酒酵母為研究對象，敲除對琥珀酸脫氫酶酶活影響最大的基因SDH2,使琥珀酸通過TCA氧化途徑得到積累。在此基礎(chǔ)上考察了來源于米根霉的丙酮酸羧化酶基因RoPYC的表達(dá)對琥珀酸積累的影響,進(jìn)而考察了微量元素Ca2+和生物素對PC酶表達(dá)及琥珀酸積累的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒、及引物

S.cerevisiaeCEN.PK 2-1C，由本實(shí)驗室于-80 ℃保藏；敲除型質(zhì)粒pUG72和Cre蛋白分泌質(zhì)粒pSH63，由本實(shí)驗室保藏；基因敲除時所用引物，由金唯智生物技術(shù)有限公司合成(表1)。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.1.2 酶和試劑

質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶，均來自上海皓嘉生物技術(shù)有限公司；生物素，上海生物工程股份有限公司；琥珀酸脫氫酶酶活測定試劑盒、丙酮酸羧化酶酶活測定試劑盒，蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，NaCl 10，蛋白胨 10。YPD培養(yǎng)基(g/L)：Peptone 20，酵母浸膏10，葡萄糖20，固體培養(yǎng)基加瓊脂粉20。YPG培養(yǎng)基(g/L)：Peptone 20，酵母浸膏10，半乳糖20，固體培養(yǎng)基加瓊脂粉20。SD-Leu種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，YNB 1.7 g/L，(NH4)2SO45 g/L，10×AA 100 mL，100×His、100×Ura、100×Arg、100×Trp各10 mL。SD種子培養(yǎng)基：在SD-Leu培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加100×Leu 10 mL/L。SD-Leu發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 40，KH2PO43，K2SO46.6，MgSO4·7H2O 0.5，尿素 1，YNB 3.4，CaCO35， 10×AA 100 mL，100×Ura、 10×His、10×Arg、10×Trp各10 mL。SD發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：在SD-Leu培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加100×Leu 10 mL/L。

1.2 儀器與設(shè)備

凝膠成像儀、PCR儀，Bio-Rad公司；高效液相色譜，有機(jī)酸色譜柱，Waters公司。

1.3 方法

1.3.1SDH2基因敲除

參照徐國強(qiáng)[17]的方法利用篩選標(biāo)記,通過同源重組進(jìn)行目的基因的敲除。

1.3.2 丙酮酸羧化酶異源表達(dá)

將本實(shí)驗室保存的攜帶有米根霉丙酮酸羧化酶的質(zhì)粒pY15TEF1-RoPYC利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[18]轉(zhuǎn)化至釀酒酵母琥珀酸生產(chǎn)菌株2-1CΔSDH2中。

1.3.3 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：從平板上挑取單菌落接種至裝有4 mL SD或SD-Leu培養(yǎng)基的試管中，30 ℃、220 r/min過夜培養(yǎng)。

發(fā)酵培養(yǎng)：將過夜培養(yǎng)的種子液接入40 mL/250 mL錐形瓶SD或SD-Leu培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)。分別培養(yǎng)至12、24、36、48、60、72 h,取樣進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)物測定。

1.3.4 酶活測定

粗酶提取：菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)分別至24、36、48 h時取樣30 mL左右，在12 000 r/min條件下離心1 min，得到適量的菌體。向菌體中加入400 μL提取液，同時加入和菌體等體積的玻璃珠,在旋渦儀上進(jìn)行振蕩，每振蕩30 s，立刻置于冰上1 min，重復(fù)操作10次；12 000 r/min離心10 min，取上清即為待測蛋白液。

酶活反應(yīng)體系：50 μL樣本，50 μL試劑四，900 μL工作液，在340 nm的波長下測定吸光度A1和2 min后的吸光度A2，兩者差值即為ΔA。

琥珀酸脫氫酶酶活單位定義為：1 g組織1 min消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為1個酶活力單位。

琥珀酸脫氫酶酶活=

(1)

PC酶活=

(2)

1.3.5 發(fā)酵產(chǎn)物的分析方法

生物量測定：采用紫外可見分光光度計測定600 nm波長處的吸光值。

葡萄糖測定：采用生物傳感器SBA-40D測定葡萄糖濃度。

琥珀酸及丙酮酸測定：采用高效液相色譜，色譜柱型號：Waters Atlantis T3，4.6 mm×250 mm，5 μm；檢測條件：30 ℃柱溫；20 mmol/L NaH2PO4流動相；0.7 mL/min流速；紫外210 nm波長下檢測琥珀酸和丙酮酸產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDH2缺失株的構(gòu)建及SDH2基因缺失對琥珀酸積累的影響

釀酒酵母中琥珀酸進(jìn)一步代謝所需的琥珀酸脫氫酶復(fù)合體由4個亞基組成，分別由基因SDH1、SDH2、SDH3、SDH4編碼[19]，其中基因SDH2的缺失使琥珀酸脫氫酶酶活下降57.8%，SDH2基因成為琥珀酸脫氫酶酶活的關(guān)鍵編碼基因。為構(gòu)建琥珀酸合成途徑本研究敲除基因SDH2，分別以SDH2-A和SDH2-D引物進(jìn)行PCR驗證，獲得SDH2缺失株如圖1-a所示，若敲除成功，條帶大小應(yīng)為2 075 bp，否則為1 244 bp。對成功敲除菌株進(jìn)行保藏和后續(xù)研究。圖1-b為構(gòu)建成功的SDH2基因缺失株和野生型菌株2-1C琥珀酸脫氫酶酶活測定結(jié)果。由圖1-b可知，敲除SDH2基因后，琥珀酸脫氫酶的酶活在24、36、48 h較對照組分別下降30.32%、33.31%、57.13%，且48 h酶活最低。

圖2對SDH2缺失株和對照菌株進(jìn)行了發(fā)酵性能的對比。敲除SDH2基因后，菌株2-1CSDH2發(fā)酵至48 h生物量達(dá)到最大值，較對照菌株最大生物量下降8.4%。由此可知，敲除基因SDH2未造成菌株的停滯生長，故基因SDH2并非菌株生長的必需基因。而在敲除基因SDH2后，菌株2-1CSDH2較對照菌株實(shí)現(xiàn)了琥珀酸積累，由(0.011±0.002) g/L提高至(0.709±0.015)g/L。同時，敲除基因SDH2后，丙酮酸的產(chǎn)量有所提高，如圖2-c，且發(fā)酵至36 h達(dá)到最大值(0.939±0.01) g/L，相較于原始菌株提高了47.64%。同時，由圖2(b)可知，發(fā)酵至24 h后菌株2-1CΔSDH2及對照的葡萄糖剩余量均接近0。同時發(fā)酵84 h，菌株2-1CΔSDH2葡萄糖消耗能力較對照有所下降。說明敲除基因SDH2使菌株葡萄糖消耗能力減弱。

M-marker;1-空白對照；2～5-sdh2缺失菌株圖1 sdh2缺失株P(guān)CR驗證結(jié)果(a)和菌株2-1C、2-1CΔsdh2琥珀酸脫氫酶酶活測定結(jié)果(b)Fig.1 The PCR result of strain without gene sdh2(a) and the activity of succinate dehydrogenase in strain 2-1C and 2-1CΔsdh2(b)

a-生物量；b-葡萄糖；c-丙酮酸；d-琥珀酸圖2 2-1C和2-CΔSDH2發(fā)酵曲線Fig.2 Fermentation curve of 2-1C and 2-CΔSDH2

2.2 異源表達(dá)丙酮酸羧化酶對琥珀酸積累的影響

在敲除基因SDH2后，除琥珀酸得到積累外，丙酮酸含量也提高46.7%，而丙酮酸是連接糖酵解和三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵點(diǎn)[5,20-21]。因此將丙酮酸處積累的碳流量“引入”琥珀酸合成途徑成為急需解決的問題。而將丙酮酸轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸的關(guān)鍵酶是PC酶，KENEALY等研究發(fā)現(xiàn),在R.oryzae發(fā)酵生產(chǎn)延胡索酸的過程中，PC酶具有較高的活性[22]。為此本研究在釀酒酵母中異源表達(dá)了來自米根霉的PC酶基因。

圖3-a為異源表達(dá)丙酮酸羧化酶PYC基因獲得的轉(zhuǎn)化子菌落PCR產(chǎn)物圖，圖3-b比較了重組菌2-1CΔS-RoPYC和 2-1CΔSDH2丙酮酸羧化酶酶活，結(jié)果表明，發(fā)酵過程中丙酮酸羧化酶酶活呈現(xiàn)先增后減的趨勢，且發(fā)酵至24 h，菌株2-1CΔS-RoPYCPC酶活提高最為明顯,比菌株2-1CΔSDH2高22.5%。

在異源表達(dá)PC酶基因后，進(jìn)行發(fā)酵性能測定，探究其對琥珀酸積累的作用。如圖4所示，異源表達(dá)丙酮酸羧化酶發(fā)酵至36 h，菌株2-1CΔS-RoPYC丙酮酸含量較2-1CΔS下降44.3%，同時，菌株2-1C、2-1CΔSDH2、2-1CΔSDH2-RoPYC發(fā)酵24 h后葡萄糖消耗殆盡，且葡萄糖消耗能力依次減弱。發(fā)酵至72 h琥珀酸產(chǎn)量達(dá)到最大值(0.841±0.020) g/L,較菌株2-1CΔSDH2提高了28.6%。說明提高PC酶的酶活促進(jìn)了琥珀酸的積累。

M-marker;CK-空白對照；1～3-轉(zhuǎn)化成功的菌株圖3 異源表達(dá)RoPYC基因轉(zhuǎn)化子菌落PCR驗證凝膠電泳圖(a)和菌株2-1CΔS-RoPYC與2-1CΔS的丙酮酸羧化酶酶活(b)Fig.3 The PCR result of construct strain 2-1CΔS-RoPYC(a) and the activity of pyruvate carboxylase in strain 2-1CΔS-RoPYC and 2-1CΔSDH2(b)

a-生物量；b-葡萄糖；c-丙酮酸；d-琥珀酸圖4 菌株2-1C、2-1CΔSDH2、2-1CΔSDH2-RoPYC發(fā)酵曲線Fig.4 Fermentation curve of 2-1C，2-1CΔSDH2，2-1CΔSDH2-RoPYC

2.3 Ca2+及生物素對丙酮酸羧化酶的作用探究

在琥珀酸初步積累的基礎(chǔ)上通過輔因子水平探究來進(jìn)一步提高丙酮酸羧化酶酶活。Ca2+作為乙酰CoA羧化酶的激活劑[23],在Ca2+存在時其酶活提高1倍。本實(shí)驗室前期研究發(fā)現(xiàn)在過量表達(dá)PC酶的釀酒酵母發(fā)酵中,單獨(dú)添加適量的Ca2+可以提高富馬酸的含量，因此本實(shí)驗首先考察了Ca2+的添加對PC酶活性及琥珀酸積累的作用。

在發(fā)酵36 h選擇外源添加濃度為0、25、50、75、100、125 mmol/L CaCl2溶液，探究其對丙酮酸羧化酶的影響。從實(shí)驗結(jié)果(圖5、圖6)可知，不同濃度的CaCl2溶液對PC酶的酶活作用不同。添加50 mmol/L CaCl2溶液和未添加CaCl2溶液PC酶活一致，而添加25、75、100、125 mmol/L CaCl2溶液后,PC酶活分別下降7%、30%、39%、13%。之后選擇添加0、25、125 mmol/L CaCl2溶液探究其對琥珀酸積累的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),加入25、125 mmol/L的CaCl2溶液后，菌體濃度上升，相較于對照增加了29.7%和107.6%，但琥珀酸產(chǎn)量隨Ca2+濃度增加逐漸下降，說明加入較多的Ca2+有利于菌體的生長，但卻不利于丙酮酸和琥珀酸生產(chǎn)。圖6(b)為添加不同濃度Ca2+后菌株2-1CΔSDH2-RoPYC葡萄糖消耗曲線。由圖可知，添加不同濃度Ca2+后菌株2-1CΔSDH2-RoPYC葡萄糖剩余量無明顯變化。說明Ca2+外源添加對菌株2-1CΔSDH2-RoPYC葡萄糖消耗能力無明顯作用。

圖5 36 h添加不同濃度Ca2+時丙酮酸羧化酶酶活Fig.5 Activity of PC enzyme with different concentrations of Ca2+ at 36 h

a-生物量；b-葡萄糖；c-丙酮酸；d-琥珀酸圖6 添加不同濃度Ca2+后菌株2-1CΔSDH2-RoPYC發(fā)酵曲線Fig.6 Fermentation curve of 2-1CΔSDH2-RoPYC with diverse concentration of Ca2+

PC酶是生物素依賴型酶，在催化過程中，羧基生物素易位至羧基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域后轉(zhuǎn)移至受體底物丙酮酸，故缺乏生物素不利于酶促反應(yīng)[24]。本實(shí)驗考察了不同濃度生物素對丙酮酸羧化酶活性及琥珀酸積累的作用。添加質(zhì)量濃度為16、32、64、96 μg/L生物素,PC酶酶活較未添加生物素分別提高5.87%、22.24%、15.12%、14.05%。且添加32 μg/L生物素時，PC酶酶活提高最明顯。發(fā)酵實(shí)驗表明，添加生物素琥珀酸產(chǎn)量提高，且生物素質(zhì)量濃度為32 μg/L時，琥珀酸產(chǎn)量最高，為(0.964±0.02) g/L，相較于未添加生物素提高了87.5%，但添加適當(dāng)濃度生物素，丙酮酸產(chǎn)量下降(圖7、圖8)。由圖8(b)可知，外源添加生物素有利于菌株2-1CΔSDH2-RoPYC葡萄糖消耗能力的提高。

圖7 36 h添加不同濃度生物素時PC酶活Fig.7 Activity of PC enzyme with different concentrations of biotin at 36 h

a-生物量；b-葡萄糖；c-丙酮酸；d-琥珀酸圖8 添加不同濃度生物素后菌株2-1CΔSDH2-RoPYC發(fā)酵曲線Fig.8 Fermentation curve of 2-1CΔSDH2-RoPYC with diverse concentration of biotin

3 結(jié)論

早前已有研究人員在谷氨酸棒桿菌中共表達(dá)丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因PYC和PPC促進(jìn)了琥珀酸積累[25]，且在缺乏丙酮酸羧化酶的大腸桿菌[21]中引入外源PC酶可以增強(qiáng)草酰乙酸的回補(bǔ)增加TCA循環(huán)的碳流量，從而提高琥珀酸產(chǎn)量。本研究敲除琥珀酸脫氫酶復(fù)合體基因SDH2，成功構(gòu)建了琥珀酸合成途徑，使琥珀酸產(chǎn)量由(0.011±0.002) g/L提高至(0.709±0.015) g/L。在此基礎(chǔ)上過量表達(dá)米根霉丙酮酸羧化酶基因提高PC酶活,使琥珀酸產(chǎn)量進(jìn)一步提高至(0.841±0.020) g/L。說明PC酶酶活提高有利于琥珀酸積累，進(jìn)而探究其輔因子對琥珀酸積累作用，發(fā)現(xiàn)添加32 μg/L生物素,琥珀酸達(dá)到(0.964±0.02) g/L。綜上，丙酮酸羧化酶作為連接糖酵解途徑和TCA循環(huán)的節(jié)點(diǎn)，對琥珀酸積累起促進(jìn)作用，同時也成為改造釀酒酵母積累琥珀酸的關(guān)鍵點(diǎn)，為代謝工程策略改造釀酒酵母積累琥珀酸提供新思路。在今后的研究中則要進(jìn)一步考察PC酶不同表達(dá)量對釀酒酵母積累琥珀酸的作用。