王 新,段佳燚,徐錦濤,楊 婧,叢 霞,秦志華,郭 沛,單 虎

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266109)

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)K88是引起新生和斷奶仔豬腹瀉的主要致病菌之一[1-2],能夠?qū)е伦胸i血液白細(xì)胞數(shù)量增多,多種促炎性細(xì)胞因子的生成。由于抗生素的濫用導(dǎo)致大腸桿菌的耐藥性不斷的增強(qiáng),獸藥殘留情況也越來越嚴(yán)重。中國的中藥資源豐富、且具有毒副作用小和無耐藥性等優(yōu)點(diǎn)[3-4]。黃芩湯的主要作用是清熱止痢,和中止痛,對于機(jī)體免疫力有一定的提高。本試驗(yàn)與探討黃芩湯對于防治小鼠感染大腸桿菌K88的效果,旨在為臨床應(yīng)用黃芩湯防治仔豬大腸桿菌性腹瀉提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(48T)-購自南京建成生物工程研究所;內(nèi)毒素檢測鱟試劑盒-購自廈門鱟試劑生物科技股份有限公司;黃芩湯由黃芩、芍藥、炙甘草和大棗組成,購自山東省青島市城陽人民醫(yī)院,按照《中華人民共和國藥典》[5]中記載的煎煮方法,稱取所需中藥,均用分體式電子智能保健煲煎煮兩次。第一次先加入8倍的水將藥材浸泡30 min,加熱煎煮1 h。第二次加入4倍的水,加熱0.5 h,去除藥渣保留藥液,將兩次煎煮所得全部藥液用3層紗布過濾后,取上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1 g/mL的中藥原液,高壓滅菌后4℃保存?zhèn)溆?0.1 g/mL氟苯尼考溶液,購自天津市諾維動物藥業(yè)有限公司。大腸桿菌K88由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院臨床診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈。SPF級昆明系小鼠,體重18～22 g,雌雄各半,購自山東省濟(jì)南市朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法 預(yù)防試驗(yàn)：選取健康且體重相近昆明系小鼠80只,隨機(jī)分為黃芩湯組、氟苯尼考組、對照組、空白對照組,每組20只,雌雄各半。黃芩湯組及氟苯尼考組小鼠攻毒之前連續(xù)給藥5 d,并分別灌服1 mL黃芩湯(濃度1 g/mL)、1%氟苯尼考溶液1 mL,對照組和空白對照組灌服等量的生理鹽水。黃芩湯組、氟苯尼考組和對照組分別于最后一次給藥3 h后腹腔注射0.1 mL大腸桿菌K88菌液(5×107CFU/mL),空白對照組注射等量的生理鹽水。

治療試驗(yàn)：選取健康且體重相近昆明系小鼠80只,按照預(yù)防試驗(yàn)的分組,每組20只,雌雄各半。黃芩湯組、氟苯尼考組和對照組分別于第一次給藥前3 h,腹腔注射0.1 mL大腸桿菌 K88菌液(5×107CFU/mL),空白對照組注射等量的生理鹽水。攻毒3 h后黃芩湯組灌服濃度1 mL黃芩湯(濃度1 g/mL),氟苯尼考組灌服1%氟苯尼考溶液1 mL,對照組、空白對照組灌服等量的生理鹽水。

1.3 測定指標(biāo) 記錄統(tǒng)計(jì)攻毒后48 h內(nèi)各組的死亡數(shù)以及死亡率;檢測小鼠白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板等血常規(guī)指標(biāo);使用血清參照鱟試劑盒和酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書進(jìn)行含量測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件中ANOVA(One way analysis of variance)法,用 Duncan法進(jìn)行均值的多重比較。結(jié)果用±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠死亡數(shù)和死亡率的動態(tài)變化 由表1可知,注射了大腸桿菌的對照組死亡率為80%,說明了大腸桿菌毒力很強(qiáng)。治療試驗(yàn)組的死亡率接近氟苯尼考組,說明了黃芩湯對大腸桿菌病的治療效果較佳。

表1 治療試驗(yàn)各組小鼠死亡數(shù)和死亡率的動態(tài)變化(n=20)

2.2 小鼠血液中細(xì)菌 LPS、TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量變化 由表2可知,黃芩湯組小鼠血清中LPS、TNF-α、IL-1β的含量與對照組差異極顯著(P＜0.01);且TNF-α的含量與氟苯尼考組差異極顯著(P＜0.01)。黃芩湯組小鼠血清中IL-6的含量與對照組差異顯著(P＜0.05)。

表2 預(yù)防試驗(yàn)各組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和LPS含量

由表3可知,黃芩湯組小鼠血清中LPS的含量與氟苯尼考治療組差異極顯著(P＜0.01)。黃芩湯組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量與對照組差異極顯著(P＜0.01)。

2.3 黃芩湯對感染大腸桿菌K88小鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響 由表4可知,對照組與空白對照組相比,白細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞的數(shù)目均有極顯著性(P＜0.01)增高;紅細(xì)胞數(shù)目、血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞壓積有極顯著性(P＜0.01)降低;血小板各項(xiàng)指標(biāo)均差異不顯著(P＞0.05)。黃芩湯組中,白細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)目極顯著(P＜0.01)低于對照組,紅細(xì)胞數(shù)目、血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞壓積與空白對照組相比均有顯著性(P＜0.05)降低。

表3 治療試驗(yàn)各組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和內(nèi)毒素含量

表4 預(yù)防試驗(yàn)血常規(guī)檢驗(yàn)結(jié)果

由表5可知,對照組與空白對照組相比白細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞的數(shù)目均有極顯著性(P＜0.01)增高;紅細(xì)胞數(shù)目、血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞壓積、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度均有極顯著性(P＜0.01)降低;血小板各項(xiàng)指標(biāo)均差異不顯著(P＞0.05)。黃芩湯組中,白細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞數(shù)目極顯著(P＜0.01)低于對照組。紅細(xì)胞數(shù)目、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度與平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度均顯著(P＜0.05)高于對照組。

表5 治療試驗(yàn)血常規(guī)檢驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 黃芩湯對小鼠死亡率的影響 試驗(yàn)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),使用大腸桿菌攻毒后能引起小鼠70% ～80%死亡,通過對比發(fā)現(xiàn),黃芩湯對小鼠感染大腸桿菌K88有顯著的預(yù)防及治療作用。嚴(yán)梅楨等[6]死亡保護(hù)法進(jìn)行體內(nèi)抗菌試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)黃芩湯代謝產(chǎn)物對分別由金黃色葡萄球菌和大腸桿菌感染引起的偽無菌小鼠死亡有明顯保護(hù)作用,與試驗(yàn)結(jié)果一致。

3.2 黃芩湯對血液中 LPS、TNF-α、IL-1 β 和 IL-6含量的影響 大腸桿菌K88主要以菌毛、腸毒素和細(xì)菌崩解后產(chǎn)生的內(nèi)毒素發(fā)揮致病作用[7]。LPS在細(xì)菌死亡崩解時大量釋放并且進(jìn)入循環(huán)血液,造成內(nèi)毒素血癥[8]。通過試驗(yàn)結(jié)果對比發(fā)現(xiàn),在治療試驗(yàn)中,氟苯尼考組小鼠的血清中LPS含量顯著升高,原因可能是氟苯尼考在殺滅大腸桿菌的同時,造成大腸桿菌大量崩解,釋放出大量LPS有關(guān),徐能武[9]、劉嵐[10]、王紅芳[11]的試驗(yàn)都證明,抗生素在殺滅細(xì)菌的同時能促進(jìn)LPS的釋放。TNF-α能夠促進(jìn)IL-1 β和IL-6的分泌,在發(fā)生炎癥和細(xì)胞凋亡的過程中具有重要意義[12]。黃芩湯能顯著降低小鼠血清中的LPS、IL-1β、IL-6和TNF-α的含量,說明黃芩湯能降低大腸桿菌感染小鼠后的炎癥反應(yīng)。該結(jié)果與王怡薇[13]等人的研究結(jié)果一致。

3.3 黃芩湯對小鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響 當(dāng)發(fā)生細(xì)菌性感染時血液中單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞明顯升高,活化的白細(xì)胞能分泌產(chǎn)生TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎細(xì)胞因子并相互作用。通過試驗(yàn)結(jié)果對比發(fā)現(xiàn),黃芩湯能顯著降低受大腸桿菌感染的小鼠血液中白細(xì)胞、提高小鼠血液中的紅細(xì)胞,對小鼠感染大腸桿菌后體內(nèi)免疫產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用,改善小鼠的貧血現(xiàn)象。李樂天[14]的試驗(yàn)證明,白芍能抑制炎癥反應(yīng)中白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的活化與增殖,并能顯著提高經(jīng)LPS誘導(dǎo)的炎癥小鼠紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白,說明白芍可抵抗炎癥性貧血。

4 結(jié)論

黃芩湯對感染大腸桿菌K88小鼠有極顯著的防治作用。黃芩湯的主要通過降低血液中的內(nèi)毒素及炎性因子的含量,進(jìn)而降低機(jī)體炎癥反應(yīng)水平,發(fā)揮保護(hù)作用。