戴愛玲,劉建奎,王德永,魏春華,林日丹,楊小燕

(1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,福建 龍巖 364000;2.福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心,福建 龍巖 364000)

豬瘟(Classic Swine Fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classic Swine Fever virus,CSFV)引起的一種高度接觸傳染病,發(fā)病率高,死亡率高,嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展[1-3]]。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為A類傳染病,我國定為Ⅰ類烈性傳染病。我國自20世紀(jì)50年代成功研制豬瘟兔化弱毒疫苗(C株或HCLV)以來,豬瘟的流行得到有效控制,但是在長期免疫壓力下,豬瘟病毒出現(xiàn)一定程度變異,臨床表現(xiàn)日趨復(fù)雜[2],溫和型和非典型豬瘟的廣泛流行給豬瘟的臨床診斷與防控提出挑戰(zhàn),因此及早檢測被感染豬群,對于豬瘟的防控具有重要的意義。臍帶血是母豬分娩后,仔豬斷臍時(shí)殘留在臍帶中的血液,由于豬胎盤特性,絕大部分免疫球蛋白都無法通過胎盤屏障,但某些疫病能通過胎盤屏障感染仔豬。因此,臍帶血檢測對豬疫病早期預(yù)警及防控具有較高臨床應(yīng)用價(jià)值[4][。

豬瘟病毒囊膜糖蛋白E2是病毒識別和吸附宿主細(xì)胞的病毒結(jié)構(gòu)蛋白,在CSFV增殖過程中具有重要作用,同時(shí)E2蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,E2結(jié)構(gòu)蛋白抗原變異與免疫逃逸有關(guān),是導(dǎo)致豬場CSFV持續(xù)感染的主要原因之一[5]。福建省某存欄母豬550頭的規(guī)?；i場,母豬豬瘟疫苗采取一年普免3次的免疫方式,ST傳代細(xì)胞活疫苗2.5頭份/頭。該豬場哺乳仔豬出現(xiàn)個(gè)別弱仔、拉稀現(xiàn)象,發(fā)病仔豬經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測為豬瘟病原陽性。為了明確哺乳仔豬的發(fā)病是否與CSFV經(jīng)胎盤垂直感染有關(guān),本試驗(yàn)連續(xù)收集分娩母豬的臍帶血,應(yīng)用熒光定量PCR檢測臍帶血CSFV,RT-PCR方法對陽性樣品進(jìn)行擴(kuò)增、克隆以及CSFV E2基因測序,分析豬瘟病原遺傳變異情況。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 臍帶血收集于福建省某存欄母豬550頭的規(guī)?；i場,每頭分娩母豬至少采集5頭以上初生且未吃初乳的仔豬,每頭仔豬采集2 mL,混合后-20℃保存,標(biāo)明采集日期和對應(yīng)母豬的耳號,共計(jì)采集117份臍帶血。

1.2 主要試劑 M-MuL反轉(zhuǎn)錄酶、RAN酶抑制劑、Taq DNA聚合酶,購自寶生物工程(大連)有限公司;RNA提取試劑盒百泰克生物技術(shù)北京有限公司;凝膠回收試劑盒,購自天根生化科技(北京)有限公司;豬瘟病毒熒光定量PCR檢測試劑盒,購自北京尚儀有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 參考文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)合成1對特異性引物用于CSFV E2基因的擴(kuò)增,擴(kuò)增片段大小約為272 bp,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 CSFV E2基因引物序列

1.4 熒光定量PCR檢測 取250 μL臍帶血,按照RAN提取試劑盒方法提取病毒基因組RNA,參照豬瘟熒光定量RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行熒光PCR檢測。

1.5 RT-PCR鑒定 通過RT-PCR方法對熒光定量RT-PCR檢測為陽性的樣品進(jìn)行CSFV E2基因擴(kuò)增。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄M-MμL酶將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR 的反應(yīng)體系 25μL：10 × Buffer 2.5 μL,dNTP(2.5 mmol/L)2 μL。 模板 cDNA 2 μL,上下引物各1 μL(10 pmol/mL),Taq酶(5u/μL)0.2 μL,用DEPC水補(bǔ)齊25 μL。PCR擴(kuò)增程序：96℃ 3 min;95℃ 45 s,56.2℃ 45 s,72℃ 45 s,35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 目的基因克隆與序列分析 目的片段經(jīng)膠回收后連接到pMD19-T載體上,將鑒定均為陽性的重組菌株送往北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序。采用DNAStar軟件對CSFV E2基因進(jìn)行核苷酸序列和氨基酸序列同源性比對及分析,同時(shí)繪制出遺傳系統(tǒng)發(fā)生樹。本研究所用的國內(nèi)外參考毒株見表2。

表2 CSFV E2基因參考株

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR檢測結(jié)果 采用熒光定量RTPCR方法對117份臍帶血進(jìn)行檢測,結(jié)果表明,CSFV感染率為7.69%(9/117),部分熒光定量PCR結(jié)果如圖1所示。

圖1 部分樣品CSFV E2基因熒光定量PCR結(jié)果

2.2 RT-PCR檢測結(jié)果 應(yīng)用RT-PCR對9份陽性樣品進(jìn)行CSFV E2擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,均在約270 bp處出現(xiàn)擴(kuò)增條帶,大小與預(yù)期結(jié)果相符(圖2)。

圖2 CSFV E2基因片段的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 目的基因序列測定及分析

2.3.1 核苷酸序列同源性分析 將5株CSFV E2基因(編號 1 ～ 5,樣品號：2253、3137、2639、3573、3733)與20株CSFV參考毒株(表2)核苷酸序列進(jìn)行比對,結(jié)果表明,5株CSFV E2基因之間的同源性為97.8%～100%,與參考株之間的同源性為80.0% ～97.5%,與94.4-IL-94-TWN株同源性最低為80.0%,與C株和HCLV株的同源性分別為95.6% ～96.7%、96.4% ～97.5%,與 Shimen株的同源性為92.7%～94.5%。

2.3.2 氨基酸同源性序列分析 將5株CSFV E2基因(編號1～5)推導(dǎo)的氨基酸序列與20株CSFV參考毒株(表2)序列進(jìn)行比對。結(jié)果顯示,5株毒株E2基因之間的氨基酸同源性為97.8%～100%,與參考株之間同源性為83.5% ～96.7%,與C株和HCLV株同源性為95.5% ～96.7%,與經(jīng)典強(qiáng)毒株Shimen株的同源性為94.4% ～95.6%,與P97株基因型為3.4同源性最低為83.5%。

2.4 遺傳進(jìn)化樹分析 為了進(jìn)一步研究5株CSFV遺傳特征,利用DNAStar軟件對CSFV E2基因進(jìn)行了比對和分析。結(jié)果表明,5個(gè)毒株均處于1.1亞群,與C株和HCLV株親緣關(guān)系最近(圖5)。

2.5 氨基酸序列分析 對5株CSFV E2基因推導(dǎo)的氨基酸位點(diǎn)和疫苗HCLV株E2基因氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行比對分析,結(jié)果顯示,與HCLV相比,5株CSFV E2基因推導(dǎo)的氨基酸序列均存在D5→N、R88→G88和S89→F89的突變。此外,3137株在存在S3→T3的變異,3573株存在在15位點(diǎn)氨基酸T15→I15的變異,這些氨基酸位點(diǎn)變異可能導(dǎo)致分離株抗原發(fā)生變化(圖6)。

圖3 CSFV E2基因的核苷酸同源性分析

圖4 CSFV E2基因的氨基酸同源性分析

圖5 CSFV E2基因核苷酸的遺傳進(jìn)化樹

圖6 5株CSFV E2基因與疫苗株HCLV E2基因推導(dǎo)氨基酸序列比對

3 討論

豬瘟病毒在世界范圍廣泛流行,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬瘟病毒只有一個(gè)血清型,但是不同毒株之間的毒力差異較大,導(dǎo)致其流行形式發(fā)生變化,現(xiàn)臨床上以溫和型和非典型豬瘟為主,豬瘟帶毒豬無明顯臨床癥狀,帶毒妊娠母豬不僅造成繁殖障礙還會垂直感染仔豬,同時(shí)持續(xù)排毒的特點(diǎn)影響整個(gè)豬群的健康,所以對妊娠母豬豬瘟病原監(jiān)測與病原特性分析對豬瘟防控顯得尤為重要。已有應(yīng)用臍帶血檢測技術(shù)在防控產(chǎn)房仔豬腹瀉[4]、評估生產(chǎn)母豬重要病原感染狀況的報(bào)道[7]。臍帶血與血樣和組織樣品比較,獲取方便、不會對豬群產(chǎn)生應(yīng)激更具優(yōu)勢。因此,采用臍帶血進(jìn)行病原檢測具有更好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

本試驗(yàn)應(yīng)用熒光定量PCR對117份臍帶血進(jìn)行檢測,豬瘟病原陽性率為7.69%。根據(jù)9份陽性樣品編號對應(yīng)的母豬進(jìn)行臨床追溯調(diào)查,結(jié)果9頭母豬中有6胎次及以上的母豬占55.6%(5/9)5頭,3胎以下比例33.3%(3/9),平均產(chǎn)仔數(shù)8.3頭,活仔率84.8%,窩產(chǎn)仔數(shù)低于7頭的母豬有3頭,早產(chǎn)母豬2頭。表明該場臍帶血豬瘟病原陽性的母豬生產(chǎn)性能較差,低于豬場母豬平均生產(chǎn)性能(平均總產(chǎn)仔為10.6頭,平均活仔豬數(shù)為9.9頭,總仔活率為93.5%)。由此可見,母豬豬瘟病毒帶毒是引起母豬生產(chǎn)性能較低的主要因素之一。

CSFV E2基因是公認(rèn)遺傳分型靶標(biāo)段,也是抗原變異核心區(qū)域,從分子水平對CSFV流行毒株進(jìn)行遺傳分型可以追蹤病毒的來源[8]。研究表明,對CSFV E2基因進(jìn)行核苷酸序列及遺傳進(jìn)化分析能在一定程度上能夠揭示病毒變異情況。通過對5株CSFV E2基因擴(kuò)增、克隆、測序,并與國內(nèi)外毒株進(jìn)行基因序列比較,5株CSFV E2基因之間核苷酸同源性均為97.8% ～100%,與C株和HCLV株同源性分別為95.6% ～96.7%、96.4% ～97.5%,與Shimen株的同源性為92.7% ～94.5%;氨基酸同源分析表明,5株CSFV E2基因推導(dǎo)的氨基酸之間同源性為97.8% ～100%,但是與疫苗株HCLV同源性為95.5%～96.7%,氨基酸變異位點(diǎn)分析表明其基因序列發(fā)生了較小程度的變異,與疫苗株HCLV相比較,均在 aa 5(D→N)、aa 88(R→G)、aa 89(S→F)位點(diǎn)發(fā)生突變,其中3 137株第3位氨基酸S突變成T,3573株在15位點(diǎn)氨基酸T變成I。遺傳進(jìn)化樹表明,分離毒株與C株和疫苗株HCLV親緣關(guān)系較近,且都處于1.1亞群。王琴等[9-10]通過對我國1985-2011年豬瘟病毒分子流行病學(xué)調(diào)查表明,我國豬瘟病毒具有遺傳多樣性,大部分地區(qū)流行的豬瘟病毒依然是基因2.1亞群和1.1亞群為主。本課題組對福建地區(qū)2013-2014年31株豬瘟病毒E2基因分型表明,福建地區(qū)以基因2.1亞群和1.1亞群為主,處于1.1亞群的23分離株與HCLV株親緣關(guān)系較近[11]。2014-2015年李棟梁報(bào)道了河南省1株1.1亞群的CSFV E2與HCLV株親緣關(guān)系較近[12]。SHEN等在研究中國華南地區(qū)豬瘟病毒E2基因時(shí),與經(jīng)典毒株(HCLV)比較,發(fā)現(xiàn)了4個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變,表明處于1.1亞群且與HCLV株親緣關(guān)系較近的毒株可能是弱毒株[13-14]。

綜上所述,該豬場通過胎盤屏障感染仔豬的豬瘟病毒可能來源于疫苗株,這種現(xiàn)象應(yīng)該引起重視。