郭君潔，李 偉，朱鳳云，李大紅，李鴻雁

(黃淮學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南 駐馬店 463000)

【研究意義】RACK1(蛋白激酶C1受體)基因是含有7個β-螺旋槳結(jié)構(gòu)的多功能支架蛋白，是色氨酸、天冬氨酸重復(fù)(WD重復(fù))蛋白家族的一員。 植物中RACK1同源基因作為細(xì)胞生長素誘導(dǎo)基因，第一次在煙草BY-2懸浮細(xì)胞被鑒定出來[1]。隨后，RACK1的同源氨基酸序列在所有檢測過的真核生物中都被發(fā)現(xiàn)[2]。RACK1在多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和不同信號分子調(diào)節(jié)過程中，RACK1的作用是控制cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、信使RNA翻譯調(diào)控、細(xì)胞骨架重構(gòu)和蛋白質(zhì)的降解。許多報告顯示，RACK1與生物脅迫相關(guān)[3-5]。因此，開展羽衣甘藍(lán)BoRACK1基因抗病性研究，有助于探討羽衣甘藍(lán)BoRACK1基因參與生物脅迫的分子機(jī)理，為改良植物抗病性提供新的選擇?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】2008年Nakashima等[6]報道在水稻幼苗中的OsRACK1A過表達(dá)促進(jìn)活性氧(ROS)的產(chǎn)生。轉(zhuǎn)基因水稻植株和細(xì)胞培養(yǎng)的分析表明，RACK1A可以促進(jìn)ROS的生產(chǎn)和提高抗稻瘟病感染的能力。Wang等[7]采用PCR技術(shù)克隆玉米RACK1基因(ZmRACK1)。玉米中的ZmRACK1過表達(dá)導(dǎo)致由玉米葉片上的大斑病菌引起的癥狀減少。Komatsu等[4]研究發(fā)現(xiàn)，盡管活化蛋白激酶C1 (RACK1)在大豆細(xì)胞核中積累，但在受澇逆境中，蛋白激酶C1 (RACK1)降低了其mRNA的水平。許多報道表明，RACK1與哺乳動物的免疫系統(tǒng)和疾病有關(guān)[8-10]。迄今，雖然RACK1基因在擬南芥和水稻等模式植物中有一些研究，但有關(guān)BoRACK1基因抗病性未見報道。本研究從羽衣甘藍(lán)中的編碼蛋白質(zhì)序列(xp_013610846)分離出1個RACK1基因，與擬南芥中RACK1序列同源性高達(dá)87.1 %，而水稻OsRACK1同源性高達(dá)87.2 %?！颈狙芯壳腥朦c】本文主要研究羽衣甘藍(lán)RACK1基因過表達(dá)對抗病性的響應(yīng)及相關(guān)機(jī)理進(jìn)行研究本研究克隆BoRACK1基因, 采用PCR和Southern blot對其進(jìn)行檢測分析，并對RACK1基因過表達(dá)對抗病性的研究。 【擬解決的關(guān)鍵問題】以期研究RACK1在羽衣甘藍(lán)中的抗病功能, 為完善該基因在生物脅迫中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與真菌菌株

羽衣甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar. acephala f.tricolor)由駐馬店市南海公園提供。霜霉菌菌株由本實驗保存。

1.2 BoRACK1基因的克隆

利用試劑盒提取總RNA。DNaseⅠ處理方法，對處理過的總RNA(2 μg)進(jìn)行變性處理并反轉(zhuǎn)錄，使用第一鏈cDNA合成試劑盒進(jìn)行總RNA反轉(zhuǎn)錄(Thermo Scientific)。正向引物P1和一個反向引物P2(表1)是基于對羽衣甘藍(lán)的mRNA序列中核苷酸序列(GenBank登錄號：Loc106317602)而設(shè)計的。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min的預(yù)變性，95 ℃ 1 min 30個循環(huán)，53 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min。 PCR產(chǎn)物由1 %瓊脂糖凝膠電泳后回收。純化的片段克隆到pMD18-T載體(TaKaRa，中國大連)，通過測序確定cDNA插入片段(捷瑞，中國上海)。

1.3 質(zhì)粒的構(gòu)建和羽衣甘藍(lán)轉(zhuǎn)化

為了獲得羽衣甘藍(lán)中的BoRACK1基因過表達(dá)植物，用BamH I和BclI雙酶切后與表達(dá)載體相連，組成一個過表達(dá)BoRACK1基因的質(zhì)粒，植物表達(dá)載體中有花椰菜花葉病毒35S啟動子(CaMV35S)和NOS終止子(圖1A)。酶切法驗證BoRACK1基因。以同樣的方式構(gòu)建了RNA干擾(RNAi)載體(引物序列：正向P3和反向P4)，質(zhì)粒標(biāo)記為P-RNAi(圖1B)。首先把RACK1過表達(dá)和RACK1RNAi質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，然后采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法[11]導(dǎo)入到羽衣甘藍(lán)中。T0代種子種在含有50 mg/L潮霉素MS(Murashige和Skoog，1962)培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)芽，對小苗進(jìn)行PCR和southern blot檢測，引物見表1，方法依照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行。

1.4 實時PCR檢測

利用RNA試劑盒提取總RNA。 DNaseⅠ處理后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用qRT-PCR技術(shù)(7500 ABI)與iTaqTMUniversal SYBR R Green Supermix (Bio-Rad)測量每個基因的轉(zhuǎn)錄水平。在對數(shù)生長期內(nèi)，基因表達(dá)使用管家基因Boactin(AF044573)作為內(nèi)參進(jìn)行定量測定。每個實驗進(jìn)行3個生物復(fù)制。qRT-PCR的引物序列如表1所示。

圖1 植物表達(dá)載體構(gòu)建模式Fig.1 Pattern of plant expression vector construction

1.5 病原體的脅迫實驗

室溫控制在25～28 ℃，采用自然日光，相對濕度為30 %～60 %，把T2轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)的種子種植在陶盆蛭石中，生長直到8～10片葉。

在28 ℃的黑暗環(huán)境下把霜霉病菌培養(yǎng)物放在18 g/L葡萄糖的OA(Oatmeal agar)培養(yǎng)基上生長10 d，然后轉(zhuǎn)移到20 ℃，12 h光照/12 h暗的環(huán)境下生長3 d。用無菌蒸餾水進(jìn)行水培產(chǎn)生分生孢子懸浮液，用顯微鏡載玻片刮去表面驅(qū)除孢子然后用紗布過濾。濃度最后達(dá)到0.1 %時加入吐溫20。把分生孢子懸浮液均勻接種在葉片表面上，每個葉片接種2個點。在23 ℃的潮濕的條件下(90 %的相對濕度)、12 h/d光照的生長，溫室中進(jìn)行孵化。接種后2周拍攝疾病區(qū)域照片。壞死和褪綠的損害總尺寸用CAD軟件測量病變區(qū)的大小。每株植物測定3個葉片，6個生物重復(fù)。H2O2測定使用BBoxiProbeTM過氧化氫檢測試劑盒，具體方法參考BBoxi公司說明書。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因植株的獲得與檢測

RACK1基因與載體CaMV35S-pBIACAM1301重組，獲得CaMV35S-pBIACAM1301-RACK1基因表達(dá)載體。酶切鑒定確認(rèn)后導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404菌株中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入羽衣甘藍(lán)中。經(jīng)過 2～3 周分化培養(yǎng)，當(dāng)有抗性芽再生時，在苗長至0.5～1.0 cm 時轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根，共獲得再生轉(zhuǎn)基因植株27個株系。

用載體HPT基因的特異引物對轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)進(jìn)行PCR檢測，共有8株擴(kuò)增出預(yù)期大小(660 bp)的片段，野生型(wildtype，WT)沒有擴(kuò)增出該片段(圖2A)，初步證明RACK1基因基因已成功地轉(zhuǎn)入羽衣甘藍(lán)。對8個陽性T0 代轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)，提取DNA，經(jīng)NcoI和EcorI酶解后，利用HPT基因的特異引物進(jìn)行southern blot分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)基因中都有一個單拷貝(圖2B)，證明RACK1基因轉(zhuǎn)入羽衣甘藍(lán)中。對8個陽性轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行定量PCR檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RACK1基因在轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)中都有一定量的表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。其中，O13, O19 和 O24 的表達(dá)量較高，其他的表達(dá)量相對較低(圖2C)；而在RNAi的BoRACK1表達(dá)仍然能被檢測(圖2C)，結(jié)果表明， O13，O19 和 O24這些轉(zhuǎn)基因植物顯示在植物控制的幼苗期，RACK1表達(dá)較高，但 RNAi 載體卻沒有抑制表達(dá)。因此，筆者研究了表達(dá)BoRACK1轉(zhuǎn)基因植物BoRACK1基因是否也參與了抗病性。

2.2 羽衣甘藍(lán)的BoRACK1過表達(dá)抗病性分析

過表達(dá)BoRACK1的T2純合株系用于接種霜霉病。該疾病癥狀在植物葉子上發(fā)展很快，如圖3A所示。侵染14 d后測定葉面感染面積。觀察退綠、壞死病變的大小和病變的擴(kuò)張速度來評價羽衣甘藍(lán)的抗逆能力。實驗用(O13，O19和O24)3個株系進(jìn)行6個獨立的實驗。3 d后，在O13，O19和O24 3個過表達(dá)株系上病變開始出現(xiàn)并孵化，而野生型植株的病變也相應(yīng)開始從接種部位向四周擴(kuò)大。與野生型(對照)相比，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出的病害癥狀顯著減少。褪綠和壞死病變的大小與野生型有顯著差異(圖3A)。統(tǒng)計分析表明，在所有3個轉(zhuǎn)基因株系的病斑面積與對照相比極顯著減少(P<0.01，圖3B)，由此可以看出，BoRACK1過表達(dá)增強(qiáng)羽衣甘藍(lán)抗葉枯病的病原菌。

A:PCR;B.Southern blotting; C.qRT-PCR圖2 轉(zhuǎn)基因植株分子檢測Fig.2 Molecular assaying methods for transgenic plants

A.各基因型接種2周后感染菌斑面積；B.各基因型菌斑面積平均值。**表示與野生型相比有極顯著差異(P<0.01)，下同圖3 不同基因型羽衣甘藍(lán)對霜霉菌抗性的影響Fig.3 Effect of BoRACK1 overexpression on disease-resistance of B. oleracea

2.3 羽衣甘藍(lán)的BoRACK1過表達(dá)對H2O2的影響

當(dāng)一個病原體的攻擊植物時，植物的先天免疫性顯示其固有抗病性如產(chǎn)生活性氧物種(ROS)和改變細(xì)胞壁的組成的植保素及誘導(dǎo)病程相關(guān)基因的表達(dá) 。已經(jīng)證明ROS是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞循環(huán)的信使，并且在植物防御病原菌感染中起關(guān)鍵作用。測試羽衣甘藍(lán)轉(zhuǎn)基因植物對感染的反應(yīng)。BoRACK1過表達(dá)的植物葉片比非轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植物接種1 d后，顯著提高的過氧化氫的生產(chǎn)能力(圖4)。結(jié)果表明，BoRACK1基因與羽衣甘藍(lán)的ROS生產(chǎn)相關(guān)。

2.4 BoRACK1調(diào)控PR基因的表達(dá)

相關(guān)致病蛋白(PR)是由致病性感染和相關(guān)非生物脅迫誘導(dǎo)的一組異質(zhì)性蛋白。在各種刺激包括病原體攻擊和脫水脅迫條件下觀察到PR基因的誘導(dǎo)。在轉(zhuǎn)基因水稻和玉米的過表達(dá)RACK1基因中已觀察到PR基因的表達(dá)顯著增加。 這些數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)基因植物在基因表達(dá)上可能會改變它們對生物脅迫的反應(yīng)。PR-1蛋白參與了水楊酸(SA)的主動防御反應(yīng)，這個反應(yīng)具有抗真菌活性能力，并在分子水平抗御一定數(shù)量的植物病原真菌。PRB-1蛋白和PR1具有類似的功能[13]。為了確定轉(zhuǎn)基因植物的抗病性機(jī)理，分別從野生型和轉(zhuǎn)基因株O13，O19和O24葉片(接種后3 d)提取總RNA。實時熒光定量PCR分析表明， O13，O19和O24株系的PR-1和PRB-1表達(dá)量比野生型高2.5～4倍(圖5A，B)。這些結(jié)果表明，BoRACK1過表達(dá)激活致病相關(guān)基因在轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)的轉(zhuǎn)錄，從而提高羽衣甘藍(lán)植株的抗感染能力。

圖4 不同基因型接種霜霉病后對H2O2的影響Fig.4 Effect of leaves after infection with P. brassicae on H2O2

3 討 論

RACK1是作為支架蛋白發(fā)揮多種作用，它是WD-40重復(fù)蛋白家族的成員之一[14]。BoRACK1是從羽衣甘藍(lán)中分離出來的一種蛋白質(zhì)，其編碼有7個WD重復(fù)序列，包括典型的GH和WD二肽[15]。氨基酸序列比較表明，BoRACK1與水稻RACK1、擬南芥RACK1相似[15]。作為一種多功能支架蛋白，RACK1與不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)[16]，它能與膜受體和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合[17]。此外，作為核糖體結(jié)合蛋白，RACK1對蛋白質(zhì)翻譯有也影響[17]。這些過程不是獨立的；它們形成了一個三維網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)生物體中的一些中心生命過程。

本文利用農(nóng)桿菌侵染羽衣甘藍(lán)愈傷組織獲得RACK1過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系，觀察發(fā)現(xiàn)RACK1過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)與野生型羽衣甘藍(lán)無明顯的差異。PCR與southern blot檢測分析表明，RACK1基因已經(jīng)插入到羽衣甘藍(lán)植物基因組中。同時對RACK1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)進(jìn)行抗病實驗，接種霜霉病菌驗證并計算羽衣甘藍(lán)葉片菌落數(shù)的發(fā)病情況與菌斑大小，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因與對照植株有較明顯的差異，從而確定RACK1轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)對霜霉病具有很好的抵抗作用，其抗病明顯優(yōu)于野生型羽衣甘藍(lán)，說明過表達(dá)RACK1能提高羽衣甘藍(lán)的抗病性(圖3)。

圖5 各基因型PRs表達(dá)量的變化Fig.5 Transcript levels of PRs in different genotypes

在這項研究中，發(fā)現(xiàn)BoRACK1調(diào)節(jié)ROS的產(chǎn)生。ROS主要由O2-和H2O2組成，是調(diào)節(jié)各種逆境耐受的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子[18]。將ROS調(diào)節(jié)到適當(dāng)水平是至關(guān)重要的，因為它們過度積累會造成損害。本研究發(fā)現(xiàn)，在生物脅迫后過表達(dá)BoRACK1增強(qiáng)ROS積累(圖4)。 表明BoRACK1有助于植物抗病性可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS水平和參與ROS信號而實現(xiàn)的。ROS信號是植物對生物脅迫適應(yīng)反應(yīng)的一個組成部分，在脅迫下保護(hù)細(xì)胞免受ROS升高的傷害。

一些研究表明，RACK1基因的過量表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因植物對環(huán)境脅迫響應(yīng)的能力[5-6]。植物先天免疫研究發(fā)現(xiàn)NB-LRR類型R類蛋白易位到細(xì)胞核并使其產(chǎn)生免疫功能[19-21]。因此，存在于質(zhì)膜外圍初始免疫復(fù)合物的某些成分移向細(xì)胞核是有可能的。在這方面，RACK1可能是一個應(yīng)激蛋白，它在動物細(xì)胞中的各種細(xì)胞內(nèi)(包括質(zhì)膜、細(xì)胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng))起作用，能與細(xì)胞表面受體、蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白交互作用[22]。為了進(jìn)一步研究RACK1基因過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株抗病性的機(jī)理，本研究在病原菌脅迫下，對相關(guān)病程基因的表達(dá)量進(jìn)行測試，PR-1和PRB-1表達(dá)量比野生型高2.5～4倍(圖5A，B)。本結(jié)果說明BoRACK1過表達(dá)激活致病相關(guān)基因在轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)的轉(zhuǎn)錄，能提高羽衣甘藍(lán)植株的抗感染能力。

4 結(jié) 論

在植物免疫反應(yīng)中RACK1過表達(dá)對霜霉菌有明顯的抗性，它可能是通過提高過氧化氫的產(chǎn)生及提高相關(guān)抗性基因的表達(dá)實現(xiàn)的。有關(guān)RACK1在抗病性的機(jī)理也將是未來研究的主題。