董章勇, 陳欣瑜, 舒永馨，羅 梅，向梅梅

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學院，廣東 廣州 510225)

【研究意義】茄子是一種十分重要的農(nóng)作物，在我國的栽種面積逐年增加。至今為止，茄子的栽種面積高達20余萬hm2[1]。近年來，茄子病害的發(fā)病程度與日俱增，其中茄子枯萎病是一種對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)影響嚴重并且非常常見的土傳性病害,其發(fā)病率在10 %～40 %[2]。茄子枯萎病發(fā)病流行期可使植株整株死亡，使病田中茄子產(chǎn)量減產(chǎn)20 %～30 %[3]。茄子枯萎病在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有“難防治，防治效果差”的特點。引起茄子枯萎病菌的病原物是由尖孢鐮刀菌所引起的。尖孢鐮刀菌屬于半知菌亞門(Deuteromycotina)梗胞目(Moniliales)鐮刀菌屬(Fusarium)[4]。Snyder和Hansen把鐮刀菌屬里面組內(nèi)的全部的種都合為1個種，并命名為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)[5]。而由尖孢鐮刀菌是引起的茄子枯萎病對茄科作物的危害極大，能夠在對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上造成嚴重的經(jīng)濟損失[6]。尖孢鐮刀菌的防控是十分艱難的，主要是因為它不僅能在宿主植物中存活，還能在土壤及空氣中存活8年以上并且仍然能夠表現(xiàn)出非常強的致病性[7]。對于其致病機理的研究顯得尤其重要。而效應蛋白被認為在植物病原物與寄主間的相互作用中發(fā)揮著重要的作用?！厩叭搜芯窟M展】效應因子(effector)也稱效應子或效應蛋白，廣義上是指能夠選擇性地結合其他目標蛋白及調(diào)節(jié)其生物活性的一類小分子蛋白[8-11]。依據(jù)病原菌效應分子的特點，絕大多數(shù)效應分子都是分泌蛋白[9,12]。效應分子一般具有以下特征：①含有N-端信號肽；②沒有跨膜結構域；③定位于細胞質(zhì)；④序列具有特異性；⑤富含半胱氨酸；⑥重復元件多；⑦小分子蛋白[13-14]。前期有眾多關于病原菌效應蛋白的研究?！颈狙芯壳腥朦c】本研究以本實驗室前期測序獲得的茄子枯萎病菌菌株Fomg14004全基因組的16485個蛋白序列為研究材料進行效應子的篩選。依靠前述的7個特點以及病原互作數(shù)據(jù)庫(PHI)進行候選效應子的初步篩選。研究結果一方面為茄子枯萎病菌的致病機理研究建立材料基礎，另一方面為其它植物病原菌的效應因子篩選提供方法參考?！緮M解決的關鍵問題】篩選出茄子枯萎病菌效應蛋白，為進一步研究其功能提供材料。

1 材料與方法

1.1 茄子枯萎病菌全基因組序列

茄子枯萎病菌菌株Fomg14004的全基因組序列來自本實驗室測序組裝預測數(shù)據(jù)，共16 485個蛋白質(zhì)序列。

1.2 方法

1.2.1 分泌蛋白組的預測 利用SignalP v4.1進行信號肽的預測[15]。得到具有信號肽的蛋白序列。利用TMHMM v2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進行跨膜層數(shù)的預測[16-17]。將具有信號肽的蛋白序列文件提交。得到跨膜數(shù)小于2的蛋白序列。采用TargetP v1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)分析軟件[18]。將跨膜層數(shù)小于2 的蛋白序列進行篩選。使用ProtCompv9.0(http://linux1.softberry.com/berr y.phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)在線分析軟件[17]。篩選出蛋白質(zhì)定位于細胞質(zhì)器中的蛋白序列。

1.2.2 分泌蛋白組的特征分析 利用perl工具進行分泌蛋白組的特征分析，分析出經(jīng)過分泌蛋白組預測的蛋白序列的長度特征。將最終結果復制到Excel中進行統(tǒng)計，并作圖。

1.2.3 效應因子的致病性預測 在Linux系統(tǒng)中采用perl程序?qū)?jīng)過分泌蛋白組預測的蛋白序列進行cysteine含量分析。篩選出cysteine含量大于等于6的蛋白序列，并進行cysteine含量柱形圖統(tǒng)計。使用T-Reks(http://bioinfo.montp.cnrs.fr/?r=t-reks/)在線分析軟件[18]。得到高重復性高氨基酸含量的蛋白序列。再使用PHI數(shù)據(jù)庫進行蛋白序列的分析(http://www.Phi-base.org/downloadLink.htm)。將小于或等于300個氨基酸殘基的小分子蛋白序列挑取出來，作為候選的致病效應因子。

2 結果與分析

2.1 分泌蛋白組的預測

茄子枯萎病菌全基因組共16 485個蛋白序列。經(jīng)過SignalP v4.1分析后得到1601個具有信號肽的蛋白序列；然后經(jīng)過TMHMM v2.0分析得到1481個跨膜數(shù)小于2的蛋白序列；1481個具有信號肽的蛋白經(jīng)過TargetP v1.1分析得到1449個定位為S的蛋白序列；最后經(jīng)過ProtComp v9.0分析，得到1376個蛋白質(zhì)定位于細胞質(zhì)中的分泌蛋白序列。

2.2 1376個分泌蛋白序列長度分析結果

將1376個蛋白序列進行長度分析后，得到516個蛋白序列長度小于300(圖1)，占37.5 %；632個蛋白序列長度在300～599，占45.93 %； 178個蛋白序列長度在600～999，占12.94 %；46個蛋白序列長度在1000～2000，占3.34 %；4個蛋白序列長度大于2000，占0.29 %。

圖1 1376個基因蛋白長度分類Fig.1 1376 gene protein length classification

2.3 致病效應因子的預測結果

2.3.1 分泌組蛋白的半胱氨酸含量和重復元件分析結果 將1376個蛋白序列進行cysteine含量分析,得到cysteine含量大于等于6的蛋白序列共733個(圖2)。將733個cysteine含量大于或等于6的蛋白序列進行multiple tandem repeats分析。最終得到219個multiple tandem repeats大于或等于9的蛋白序列。

2.3.2 病原寄主互作數(shù)據(jù)庫分析比對結果 將富含半胱氨酸且高重復性的219個蛋白序列和Pathogen-Host Interaction database(PHI)數(shù)據(jù)庫進行比對。共216個蛋白在PHI數(shù)據(jù)中獲得注釋。其中，97個蛋白被證明缺失后會造成致病力減弱(reduced virulence)，占總數(shù)的50 %；11個蛋白缺失后會完全失去致病力(loss of pathogenicity)，占總數(shù)的6 %，推測其為致病因子；10個蛋白已被證明是植物無毒效應因子(Effectors)，占總數(shù)的5 %；其中17個Mixed outcome蛋白序列里面有7個蛋白序列分別為失去致病力-毒性減弱和毒性減弱-失去致病力，歸為候選效應因子，占總數(shù)的4 %；剩余的65個蛋白則被認為是不影響病原的致病力的，占總數(shù)的33 %。因此，作為候選效應因子的基因共有125個，其中包括：植物無毒效應因子10個，致病力減弱基因97個，致病力喪失基因11個，混合型基因7個，具體分類及基因功能如表1所示。

圖2 733個分泌基因的半胱氨酸含量分類Fig.2 Number of cysteine residues of the 733 secretome genes

2.3.3 小分子蛋白的篩選結果 一般的效應因子都是小分子蛋白，其蛋白序列長度均應小于300個氨基酸，因此，將上述步驟獲得的125個基因序列進行長度篩選，去除大于300個氨基酸的蛋白序列。最終得到29個基因序列，這29個基因序列則被認為是候選致病相關效應因子(表2)。

表1 219種蛋白的基因功能的匯總Table 1 Summary of gene functions of 219 proteins

表2 29個候選致病相關效應因子Table 2 29 candidate pathogenic effectors

續(xù)表2 Continued table 2

序號Code基因名稱Genename蛋白長度ProteinlengthCysteine數(shù)目Thenumberofcysteine基因的功能Genefunction6g2630.t127913毒力減弱Reducedvirulence7g2867.t119213毒力減弱Reducedvirulence8g4309.t11976毒力減弱Reducedvirulence9g4311.t12039毒力減弱Reducedvirulence10g5742.t124826毒力減弱Reducedvirulence11g5896.t12298毒力減弱Reducedvirulence12g5964.t113011毒力減弱Reducedvirulence13g6744.t12627效應子(植物無毒性決定簇)Effector(plantavirulencedeterminant)14g7829.t11088毒力減弱Reducedvirulence15g8388.t12079毒力減弱Reducedvirulence16g9248.t12939毒力減弱Reducedvirulence17g10142.t11978毒力減弱Reducedvirulence18g10352.t12288效應子(植物無毒性決定簇)Effector(plantavirulencedeterminant)19g10355.t12966毒力減弱Reducedvirulence20g11621.t12147毒力減弱Reducedvirulence21g12071.t12916毒力減弱Reducedvirulence22g12442.t124020毒力減弱Reducedvirulence23g12923.t12646毒力減弱Reducedvirulence24g13311.t12967毒力減弱Reducedvirulence25g13540.t12808毒力減弱Reducedvirulence26g13889.t118110毒力減弱Reducedvirulence27g15041.t12997毒力減弱Reducedvirulence28g15627.t12819毒力減弱Reducedvirulence29g16404.t12929毒力減弱Reducedvirulence

3 討 論

病原菌是通過分泌一定數(shù)量的效應因子到寄主體內(nèi)完成侵入、定殖和擴展，從而實現(xiàn)致病過程，因此效應因子是植物病原菌的重要功能蛋白[8-11,20]。隨著大量病原真菌基因組測序的完成，許多植物病原真菌基因組的效應因子被逐漸預測和分析。曹友志[17]利用楊生褐盤二孢菌(Marssoninabrunnea)全基因組數(shù)據(jù)，基于真菌效應因子的普遍特征，利用生物信息學工具預測出約106個符合要求的候選效應因子基因。李孟瓊[18]從稻瘟菌數(shù)據(jù)庫中的到21個效應因子基因的開放閱讀框序列。由此可見，效應因子在各個物種維持正常生命活動中扮演著重要角色，但在不同物種中效應因子的功能差異很大。本論文首次對茄子枯萎病菌Fomg14004 全基因組的16 485個蛋白質(zhì)的氨基酸序列進行預測，除了使用SignalP v4.1, TargetP v1.1, TMHMM v2.0和ProtComp v9.0等主流分泌蛋白分析軟件進行篩選外，還結合半胱氨酸含量、蛋白重復序列，PHI數(shù)據(jù)庫比對以及小分子蛋白篩選等步驟，最終獲得29個候選致病效應因子。與上述已經(jīng)報道到的其他真菌的全基因組效應分子的預測所得到的數(shù)量相比，本次試驗所得的候選效應分子的數(shù)量更少、更嚴謹，也更有利用下游的基因功能驗證實驗。

目前，效應子雖然已經(jīng)歸納出了一些分析特征[23-25]，依照不同的標準分析還是可能得到不同的結果。曹友志[17]將篩選條件設定為：① 氨基酸序列長度：50～300 aa；②含有信號肽；③ 不含跨膜區(qū)域；④富含半胱氨酸；⑤具有高度序列特異性。其篩選到106個蛋白為效應子。閆麗斌等[26]是基于對玉米大斑病菌全基因組序列進行分泌蛋白的篩選，繼而對其蛋白半胱氨酸含量、信號肽長度及冗余性分析，其獲得了60個候選效應分子。而本研究將獲得的219個蛋白序列進一步跟PHI數(shù)據(jù)庫進行比對分析，且保留了小于300個氨基酸序列的蛋白作為最后的候選效應子，最后得到29個候選效應子。這可以進一步將一些已經(jīng)確認的非致病性的蛋白剔除，有利于縮小范圍進行后續(xù)功能驗證實驗的開展。

4 結 論

本論文首次對茄子枯萎病菌全基因組的致病相關效應因子進行了預測和分析，流程簡單，耗時較少，結果準確。一方面，獲得的29個致病相關效應因子可作為下一步致病功能的研究材料；另一方面，本論文所建立的方法則為其它植物病原真菌的效應因子篩選提供方法參考。