溫書恒 ，田志嶺 ，張淼 ，張孟周 ，王帥 ，陳京偉 ，孫英富 ，王昌亮 ，4，趙銳 ，官大威

（1.中國醫(yī)科大學法醫(yī)學院 法醫(yī)司法鑒定中心，遼寧 沈陽 110013；2.遼寧省智慧檢務創(chuàng)新研究院 智慧司法鑒定聯(lián)合實驗室，遼寧 沈陽 110122；3.司法鑒定科學研究院 上海市法醫(yī)學重點實驗室 上海司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務平臺，上海 200063；4.遼寧省人民檢察院，遼寧 沈陽 110033）

在日常生活中，骨骼肌損傷的發(fā)生率較高。在法醫(yī)學、運動醫(yī)學等領(lǐng)域中對骨骼肌損傷愈合的研究有一定的科研價值。在法醫(yī)學實際應用中，對損傷時間的推斷一直是法醫(yī)學鑒定中需要解決的重要問題之一[1-2]。精確推斷損傷時間或縮小推測時間的范圍，可以對案件發(fā)生的時間、嫌疑人的確認或排除提供重要的參考依據(jù)。因此更好地了解和掌握骨骼肌損傷愈合的一般過程，可以為法醫(yī)學損傷時間推斷提供參考依據(jù)。

研究結(jié)果[3]表明，骨骼肌損傷修復是一個受多因素調(diào)節(jié)的炎癥性組織愈合過程，可分為急性期、修復期和組織塑形期，全過程包括損傷肌纖維的壞死，炎癥細胞的募集，生肌細胞的激活、分化并融合為新的肌纖維，以及肌成纖維細胞形成纖維組織瘢痕[4-5]。目前，已知骨骼肌中有多種細胞具有肌源性潛能，其中衛(wèi)星細胞以往被認為是骨骼肌修復再生過程中最重要的細胞[6-7]，近年來，研究的注意力投向了在嬰幼兒骨骼肌生長過程中不可或缺的周細胞[8-10]。

在骨骼肌中，周細胞參與構(gòu)成衛(wèi)星細胞的“鞘”結(jié)構(gòu)，不僅促進其肌源性分化，還參與誘導衛(wèi)星細胞的靜息狀態(tài)[11-12]。骨骼肌周細胞具有異質(zhì)性，尚無單一特異的標記物，公認的是神經(jīng)元膠原抗原2（neuron-glial antigen2，NG2）和血小板源性生長因子受體β（plateletderived growth factor receptor beta，PDGFRβ）[13-16]，NG2和PDGFRβ雙陽性的細胞被認為是周細胞，并可以將周細胞分為1型（nestin-GFP-/NG2/PDGFRβ陽性）和2型（nestin-GFP+/NG2/PDGFRβ陽性）兩個主要亞型[17-18]。在骨骼肌損傷和疾病中，周細胞可以自發(fā)地與成肌細胞融合形成肌管，有助于骨骼肌再生[19]。此外，文獻報道在骨骼肌損傷后，肌纖維基底膜下部分移植的周細胞可表達衛(wèi)星細胞標記物配對盒轉(zhuǎn)錄因子（paired-box transcription factor，Pax7）蛋白[10]，這一現(xiàn)象與骨骼肌周細胞可以生成衛(wèi)星細胞的假設相印證[20]。目前，周細胞在肌肉組織損傷后是否具有時間規(guī)律性的表達尚不明確。

本課題組持續(xù)關(guān)注如2型大麻素受體（cannabinoid receptor type 2，CB2R）[21]、肌鈣蛋白Ⅰ（troponinⅠ）[22]、α7尼古丁乙酰膽堿受體（α7-nicotine acetylcholine receptor）[23]、Pax7及生肌決定因子（myoblast determination，MyoD）1[24]、同源域相互作用蛋白激酶2（homeodomain interacting protein kinase 2，HIPK2）[25]等指標在皮膚和骨骼肌損傷時間推斷中的應用。本研究擬應用雙重及三重免疫熒光染色等方法，研究在小鼠骨骼肌挫傷后周細胞的時間規(guī)律性表達，并初步探討其可能的作用，以期為法醫(yī)學的肌肉損傷時間推斷提供一個新的參考指標，同時為肌肉損傷愈合的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物模型制作及分組

動物模型的建立與操作遵照“中國醫(yī)科大學實驗室動物管理辦法”的標準，并經(jīng)中國醫(yī)科大學實驗動物福利與倫理委員會（Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC）審查通過。根據(jù)本課題組前期小鼠骨骼肌挫傷模型建立方法[25]，取雄性C57B6/L小鼠40只，周齡8～10周，體質(zhì)量18.1～24.1g。經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉（350mg/kg）麻醉后，將小鼠右后肢置于伸膝、踝背屈90°位置，將質(zhì)量80 g的不銹鋼小球（直徑12mm）在高45cm處通過內(nèi)徑14mm的管道自由垂直落于打擊器上，打擊處于靜止狀態(tài)的小鼠右后小腿腓腸肌中部，打擊器的打擊面積為28.26 mm2。挫傷后，各鼠分籠飼養(yǎng)，保持12h晝夜循環(huán)交替環(huán)境，墊料清潔及空氣通暢。

小鼠于挫傷后1、3、5、7、9、14、28d（各時間段5只小鼠）腹腔注射致死量的戊巴比妥鈉（350 mg/kg）。5只對照組小鼠經(jīng)腹腔注射致死量的戊巴比妥鈉（350mg/kg）。取小鼠右后肢腓腸肌用于組織病理學觀察。解剖證實骨骼肌損傷率達100%，且未見脛、腓骨骨折。

1.2 蘇木素-伊紅染色

取常規(guī)石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟后，梯度乙醇水化。由蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片后在Olympus cellSens Entry 1.18顯微成像系統(tǒng)（日本Olympus公司）中觀察染色結(jié)果。

1.3 免疫熒光染色

1.3.1 NG2/PDGFRβ雙重免疫熒光染色

小鼠骨骼肌樣本經(jīng)4%多聚甲醛和磷酸鹽緩沖液（pH=7.4，phosphate buffer saline，PBS）固定后，進行石蠟包埋，制作3μm厚組織病理學切片，通過NG2和PDGFRβ雙重免疫熒光染色進行周細胞鑒定和定位檢測。組織病理學切片經(jīng)脫蠟、檸檬酸熱修復后，用5%驢正常非免疫血清（中國Solarbio Life Science公司）封閉。其后將切片與小鼠源性NG2單克隆抗體（MAB5384，德國Merck公司）和山羊源性PDGFRβ多克隆抗體［GT15065，安諾倫（北京）生物科技有限公司］經(jīng)抗體稀釋液（TA-125-ADQ，美國Thermo Fisher Scientific公司）稀釋（體積稀釋濃度均為1∶200）后，在4℃孵育過夜。Alexa Fluor?488驢抗小鼠IgG（1∶200，A-21202，美國Thermo Fisher Scientific公司）和Alexa Fluor?594驢抗山羊IgG（A-11055，美國Thermo Fisher Scientific公司）經(jīng)抗體稀釋液稀釋后（體積稀釋濃度均為1∶200）于室溫與切片孵育2h。應用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚［4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI］染色液進行細胞核染色。切片經(jīng)防熒光淬滅封片劑封片，并通過熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果。切片以PBS代替一抗作為陰性對照，未見非特異染色。

1.3.2 NG2/PDGFRβ/Pax7和 NG2/PDGFRβ/MyoD1三重免疫熒光染色

為明確骨骼肌周細胞與衛(wèi)星細胞的關(guān)系，分別選取衛(wèi)星細胞處于靜息狀態(tài)和激活狀態(tài)的挫傷后1 d、挫傷后3d組的組織病理學切片，通過NG2、PDGFRβ、Pax7或NG2、PDGFRβ、MyoD1三重免疫熒光染色進行周細胞與靜息或激活狀態(tài)衛(wèi)星細胞的共定位檢測。組織病理學切片經(jīng)脫蠟、檸檬酸熱修復后，用5%驢正常非免疫血清封閉。其后小鼠源性NG2單克隆抗體、山羊源性PDGFRβ多克隆抗體和兔源性Pax7多克隆抗體（1∶200，ab187339，英國Abcam公司）或兔源性MyoD1多克隆抗體（1∶200，ab64159，英國Abcam公司）經(jīng)抗體稀釋液稀釋后與切片在4℃孵育過夜。然后，Alexa Fluor?488驢抗小鼠IgG（A-21202，美國Thermo Fisher Scientific公司）、Alexa Fluor?594驢抗山羊IgG和Alexa Fluor?647驢抗兔IgG經(jīng)抗體稀釋液稀釋（1∶200）后于室溫與切片孵育2 h。應用DAPI進行細胞核染色。切片經(jīng)防熒光淬滅封片劑封片，并通過熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果。切片以PBS代替一抗作為陰性對照，未見非特異染色。

1.4 形態(tài)學測量分析及統(tǒng)計學分析

在DMi8激光掃描共聚焦顯微鏡（德國Leica公司）×400倍鏡下，每張切片分別于挫傷中心區(qū)及周邊區(qū)各隨機選擇10個視野，進行陽性細胞計數(shù)。挫傷周邊區(qū)限定為挫傷中心區(qū)邊界至其外200 μm范圍內(nèi)。對每個鏡下視野中的NG2/PDGFRβ陽性、NG2/PDGFRβ/Pax7陽性和NG2/PDGFRβMyoD1陽性細胞進行計數(shù)，10個隨機選擇視野的陽性細胞數(shù)取平均值以評估各挫傷樣本。應用Image-Pro Plus 6.0軟件進行形態(tài)學觀察和分析。

通過GraphPad Prism 6軟件，應用比例檢驗（ratio）對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。應用獨立樣本單因子變異數(shù)分析（one-way ANOVA）對細胞數(shù)組間數(shù)據(jù)進行分析，應用Fisher精確檢驗對各組間細胞數(shù)比例進行統(tǒng)計學分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色

小鼠骨骼肌挫傷后，挫傷區(qū)內(nèi)可見組織出血、肌纖維水腫以及壞死等改變（圖1）。挫傷后1d，挫傷區(qū)內(nèi)可見大量分葉核細胞。圓形的單個核細胞在挫傷后1d出現(xiàn)，并在挫傷后3d數(shù)量增加。挫傷后3d，紡錘狀的成纖維樣細胞出現(xiàn)在挫傷區(qū)內(nèi)。挫傷后5～9 d，挫傷區(qū)內(nèi)可見大量多核新生肌管以及成纖維樣細胞。挫傷后14 d和28 d，新生肌管的核逐漸邊聚、數(shù)量逐漸減少，挫傷區(qū)內(nèi)仍可見少量成纖維樣細胞并伴隨膠原纖維沉積。

圖1 小鼠骨骼肌挫傷后組織病理學改變（HE×100）

2.2 NG2/PDGFRβ雙重免疫熒光染色

為檢測周細胞在挫傷后不同時間的狀態(tài)和數(shù)量變化情況，應用周細胞標記物NG2和PDGFRβ進行雙重免疫熒光染色定位周細胞（圖2）。形態(tài)學上，與正常骨骼肌中細長形態(tài)的周細胞相比，挫傷后1d開始，挫傷區(qū)NG2/PDGFRβ陽性細胞體積增大、形態(tài)變圓，細胞核呈圓形，其中挫傷周邊區(qū)和中心區(qū)分別于挫傷后14 d和28 d可見恢復至正常細長形態(tài)的NG2/PDGFRβ陽性細胞。此外，挫傷后5～14d，挫傷中心區(qū)可見大量NG2/PDGFRβ陽性的新生肌管（圖2A）。

圖2 小鼠骨骼肌挫傷后NG2/PDGFRβ雙重免疫熒光染色

經(jīng)分析檢驗，挫傷中心區(qū)、周邊區(qū)與全挫傷區(qū)的NG2/PDGFRβ陽性細胞數(shù)量及NG2/PDGFRβ陽性細胞與總細胞數(shù)的比例在挫傷后各時間段均呈單峰分布（表1）。NG2/PDGFRβ陽性細胞數(shù)量在挫傷中心區(qū)于挫傷后5 d達到峰值（P＜0.05），挫傷周邊區(qū)于挫傷后5d和7d達到峰值（P＜0.05），全挫傷區(qū)于5、7、9d達到峰值（P＜0.05）。挫傷后28 d，挫傷中心區(qū)、周邊區(qū)及全挫傷區(qū)的NG2/PDGFRβ陽性細胞數(shù)量均仍高于對照組（P＜0.05）。NG2/PDGFRβ陽性細胞與總細胞數(shù)的比例在挫傷中心區(qū)于挫傷后5、7d達峰值（P＜0.05），挫傷周邊區(qū)于挫傷后7 d達到峰值（P＜0.05），全挫傷區(qū)于5、7、9d達到峰值（P＜0.05）。挫傷后28d，挫傷中心區(qū)、周邊區(qū)及全挫傷區(qū)NG2/PDGFRβ陽性細胞與總細胞數(shù)的比例與對照組相比差異均仍具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 NG2/PDGFRβ/Pax7和NG2/PDGFRβ/MyoD1三重免疫熒光染色

挫傷后1 d，挫傷區(qū)可見大量NG2/PDGFRβ/Pax7陽性細胞，并可見少量NG2/PDGFRβ/MyoD1陽性細胞（圖3）；挫傷后3d，挫傷區(qū)可見大量NG2/PDGFRβ/MyoD1陽性細胞，并可見少量NG2/PDGFRβ/Pax7陽性細胞（圖4）。

表1 小鼠骨骼肌挫傷后各時間段NG2/PDGFRβ陽性細胞數(shù)及陽性細胞比例

圖3 挫傷后1d NG2/PDGFRβ/Pax7三重免疫熒光染色結(jié)果

圖4 挫傷后3d NG2/PDGFRβ/MyoD1三重免疫熒光染色結(jié)果

3 討 論

衛(wèi)星細胞被普遍認為在骨骼肌再生中起主要作用[7]。已有研究[26]表明，肌肉損傷后處于靜息狀態(tài)的衛(wèi)星細胞會被激活、增殖并向損傷區(qū)域遷移，最終與損傷的肌纖維相融合形成新生肌管，從而參與肌肉修復再生過程。骨骼肌周細胞更多被認為是衛(wèi)星細胞或其他生肌細胞的前體細胞[20]。而近年來的研究[15，18]逐漸揭示了周細胞在肌組織損傷后也會參與骨骼肌修復再生，并同時參與組織塑形期的膠原生成和纖維組織沉積過程。有研究[20]發(fā)現(xiàn)，在骨骼肌損傷后，肌纖維基底膜下小部分移植入體內(nèi)的周細胞表達衛(wèi)星細胞標記物Pax7，提示損傷后部分骨骼肌周細胞可能會發(fā)揮衛(wèi)星細胞的功能。體外實驗[9-10]證實，骨骼肌周細胞在細胞培養(yǎng)中可形成肌管，生成肌纖維；在體實驗中，移植入體內(nèi)損傷區(qū)域的周細胞可以增殖生成肌纖維而參與肌肉修復再生過程。從本研究得到的挫傷后骨骼肌周細胞的表達情況來看，挫傷后1d，部分周細胞表達靜息狀態(tài)衛(wèi)星細胞標記物Pax7，挫傷后3d也有部分周細胞表達激活狀態(tài)衛(wèi)星細胞標記物組織病理學切片，與周細胞在骨骼肌損傷后可以發(fā)揮衛(wèi)星細胞功能的研究發(fā)現(xiàn)相互印證，并進一步提示周細胞的作用可能還包含了募集和激活衛(wèi)星細胞并參與骨骼肌再生和修復的過程。而挫傷后5d可觀察到有表達周細胞標記物的新生肌管，這與前述骨骼肌周細胞可以生成肌管的發(fā)現(xiàn)相一致，提示了周細胞在肌肉再生過程中除起到前體細胞的輔助作用之外，可能還參與生肌作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，挫傷中心區(qū)和挫傷周邊區(qū)的周細胞數(shù)量和周細胞與所有細胞的比例在骨骼肌損傷后的急性期、修復期和組織塑形期過程中均有明顯增加，提示在骨骼肌損傷修復的全過程中，周細胞均參與并發(fā)揮作用。此外，挫傷中心區(qū)在挫傷后28d可見形態(tài)恢復至正常細長狀的周細胞，而挫傷周邊區(qū)則在挫傷后14d觀察到恢復至正常形態(tài)的周細胞，結(jié)合挫傷中心區(qū)在挫傷后28d仍處于修復期和組織塑形期，而挫傷周邊區(qū)則在挫傷后14d基本完成了骨骼肌修復再生過程。因此，挫傷中心區(qū)與挫傷周邊區(qū)周細胞形態(tài)恢復時間的差異，提示骨骼肌周細胞的形態(tài)改變與其參與組織修復過程相關(guān)。

在法醫(yī)學實踐中，大多數(shù)研究應用較為簡便的組織學和免疫組織化學實驗進行損傷時間判定[1，27]。本研究采用雙重免疫熒光染色共定位法對小鼠骨骼肌挫傷后周細胞表達的時間規(guī)律性進行了觀察。結(jié)合本研究結(jié)果，小鼠骨骼肌挫傷中心區(qū)、挫傷周邊區(qū)及全挫傷區(qū)的周細胞（NG2/PDGFRβ陽性細胞）數(shù)量、周細胞與總細胞數(shù)的比例均在挫傷后有時間規(guī)律性表達，且在挫傷后特定的時間范圍（3～9 d、5～7 d、14～28 d）及時間點（5、7d）存在人體肌肉損傷時間推斷的潛在參考意義，有可能在中長期肌肉損傷時間推斷中發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究表明小鼠骨骼肌挫傷后，部分周細胞表達衛(wèi)星細胞標記物，部分新生肌管也表達周細胞標記物，提示周細胞參與骨骼肌損傷后的肌肉修復再生過程。挫傷區(qū)周細胞的數(shù)量變化具有一定的時間規(guī)律性，提示其可能作為肌肉損傷時間推斷的一個參考指標。