張雪梅 李 兵 陳立杰 焦卓敏 黃 山 尚 宏

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 哈爾濱 150086)(2. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 哈爾濱 150080)

全球每年約有9%的死亡病例由腦卒中引起，而缺血性腦卒中的比例在其中約占80%，其發(fā)病率僅次于缺血性心臟疾病。因此對(duì)缺血性腦卒中進(jìn)行有效防治具有重要的醫(yī)學(xué)意義和社會(huì)貢獻(xiàn)?，F(xiàn)經(jīng)臨床證實(shí)唯一能縮小梗死體積、減輕神經(jīng)損傷的治療藥物是重組組織型纖溶酶原激活物(recombinant tissue plaminogen activator, rt-PA)，且其有效治療時(shí)間窗只有4.5 h，因而臨床應(yīng)用受到一定限制。其他藥物如抗凝、應(yīng)用神經(jīng)保護(hù)劑等，都不能對(duì)受損腦組織產(chǎn)生修復(fù)作用。因此，卒中的治療及預(yù)防成為當(dāng)前神經(jīng)科學(xué)研究的方向和熱點(diǎn)之一, 特別是其發(fā)病機(jī)制、臨床轉(zhuǎn)歸、新治療手段等成為目前卒中的基礎(chǔ)與臨床研究的熱點(diǎn)科學(xué)問(wèn)題。在基礎(chǔ)研究中如何簡(jiǎn)便，快速地建立卒中的動(dòng)物模型成為一個(gè)較為棘手的問(wèn)題。Balb/c小鼠是白變種實(shí)驗(yàn)室老鼠，與眾多常用亞系一樣，起源于小家鼠Musmusculus。Balb/c小鼠的遺傳背景為近交系，因而它們之間的個(gè)體差異較小，遺傳基因更純，整體素質(zhì)更好。如果能夠在Balb/c小鼠中成功地復(fù)制出卒中模型將為卒中的研究提供較好的動(dòng)物模型。為此，本課題組擬采用電凝方法，通過(guò)阻斷大腦中動(dòng)脈(middle cerebral artery occlusion, MCAO)的血流來(lái)成功復(fù)制Balb/c小鼠的局灶性腦缺血模型。為下一步進(jìn)行腦缺血發(fā)病過(guò)程中腦保護(hù)、神經(jīng)修復(fù)及發(fā)病機(jī)制等后續(xù)研究提供新的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年雄性Balb/c小鼠40只，體質(zhì)量22～ 25 g/只(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK-(黑)2013-001，實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物處置均符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部2016年發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》[1]。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

主要試劑與儀器：2% 氯化三苯四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride, TTC)，顯微鏡(BX41, Olympus, Japan)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型的制作： 步驟同以往實(shí)驗(yàn)方法[2]，小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，術(shù)前12 h禁食不禁水，稱重后用10% 的水合氯醛按450 mg/kg腹腔麻醉小鼠，保持小鼠麻醉1.5 ～2.0 h，將小鼠側(cè)臥固定于無(wú)菌手術(shù)臺(tái)上，術(shù)中應(yīng)用保溫毯保持小鼠直腸溫度在36.5～ 37.5 ℃。于小鼠左側(cè)眼裂至左耳外耳道之間切口，剝離顳肌，于梨狀骨與下頜骨交匯點(diǎn)向頭側(cè)1 mm，背側(cè)3.5 mm處用電鉆鉆一個(gè)直徑為1.0～ 2.0 mm的小孔。剝離硬腦膜暴露大腦中動(dòng)脈，用電凝刀電凝阻斷大腦中動(dòng)脈近端以確保持久的破壞，然后用牙科粘合劑封閉小孔，縫合切口。術(shù)后將小鼠置于27～ 28 ℃恒溫箱中飼養(yǎng)。

1.2.2模型制作成功評(píng)價(jià)方法 采用Longa的5級(jí)4分法標(biāo)準(zhǔn)[3]：0分：無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：輕度局灶性神經(jīng)功能缺損，即提尾不能伸展右側(cè)前爪；2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺損，即行走向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：重度局灶性神經(jīng)功能缺損，即行走困難，并向右側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)水平下降。手術(shù)后神經(jīng)功能評(píng)分為1～3分的小鼠入選本次研究。術(shù)后第2天隨機(jī)取2只小鼠，1只取出腦組織放入切腦模具中，間隔2.0 mm連續(xù)冠狀切片，再將腦片放入含2%氯化三苯四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride, TTC)的磷酸鹽緩沖液中(PBS, pH=7.4)，37 ℃恒溫避光孵育30 min后可見(jiàn)正常組織呈粉紅色，梗死灶呈白色。另1只小鼠取缺血區(qū)域腦組織進(jìn)行切片，經(jīng)HE染色確定缺血情況。

1.2.3神經(jīng)功能損傷評(píng)分: 小鼠的神經(jīng)功能損傷情況采用神經(jīng)系統(tǒng)疾病嚴(yán)重程度評(píng)分(mNSS)進(jìn)行評(píng)估[4]。實(shí)驗(yàn)前按評(píng)分方法對(duì)小鼠進(jìn)行一定的訓(xùn)練，選取評(píng)分為0分的正常小鼠，造模后24 h、72 h采用雙盲法分別進(jìn)行mNSS評(píng)分評(píng)估各組動(dòng)物神經(jīng)功能損傷狀況。mNSS包括運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)和平衡木試驗(yàn)，根據(jù)所能完成任務(wù)的分值統(tǒng)計(jì)得分。mNSS總分為12分，評(píng)分越高表明神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.2.4實(shí)驗(yàn)?zāi)X組織的提?。?0%的水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，迅速開胸暴露心臟，行主動(dòng)脈插管，剪開右心耳為灌注液流出口，在10～ 20 min內(nèi)經(jīng)左心室用37 ℃生理鹽水200 mL快速?zèng)_洗，然后用4%多聚甲醛/0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(4 ℃, pH=7.4) 300 mL灌注固定，40 min內(nèi)灌注完，迅速斷頭取腦，放入4%的多聚甲醛固定液，在4 ℃環(huán)境中放置24 h。然后將腦組織進(jìn)行沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋，以前囟為起始，切成等厚(15 μm)冠狀切面腦片，每10張取1張進(jìn)行HE染色。染色后顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 MCAO模型評(píng)估

MCAO術(shù)后小鼠出現(xiàn)右側(cè)前肢屈曲內(nèi)收，前進(jìn)不能，向右繞圈，站立不穩(wěn)，平衡能力明顯減弱，表明造模成功。

2.2 小鼠腦缺血區(qū)組織病理學(xué)檢測(cè)

術(shù)后24 h小鼠腦組織切片TTC染色, 假手術(shù)組織染成粉紅色，未見(jiàn)梗死灶(見(jiàn)圖1，H-L)，模型組左側(cè)大腦皮質(zhì)梗死灶呈白色(見(jiàn)圖1，C-G)，顯示手術(shù)半球明顯缺血。取小鼠損傷區(qū)域腦組織切片行 HE染色以確定損傷情況(見(jiàn)圖1，M-O)，結(jié)果顯示梗死病灶及周圍組織結(jié)構(gòu)變得疏松，間質(zhì)水腫伴隨空腔形成，且著色較淺，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，胞體皺縮，部分細(xì)胞輪廓欠清，有程度不等的神經(jīng)細(xì)胞變性壞死，核固縮, 核仁消失現(xiàn)象。證實(shí)腦缺血模型制作成功。

2.3 行為學(xué)觀察結(jié)果

如表1所示，局灶性腦缺血后存活動(dòng)物均有不同程度的神經(jīng)功能缺損。隨著存活時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)功能在短時(shí)間內(nèi)并沒(méi)有得到恢復(fù)。模型組在術(shù)后第24 h神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯高于假手術(shù)組，且這種差別可維持到術(shù)后第72 h (P<0.05)。

表1 電凝法對(duì)小鼠MCAO后神經(jīng)學(xué)評(píng)分Table 1 Evaluate the Neurological Scores of MCAOMice using the Electrocoagulation Method

圖1 小鼠腦缺血區(qū)組織病理學(xué)檢測(cè)注：A-B，活體觀察；C-L，TTC染色；M-O，HE×10Fig.1 Histopathological examination of cerebral ischemic tissue in ratsNote:A-B, somatoscopy; C-L, TTC staining; M-O, HE×10

3 討論

在發(fā)達(dá)國(guó)家，隨著人口的逐步老齡化，卒中成為發(fā)病率和死亡率都較高的疾病之一。缺血性卒中是由于腦血管(主要為大腦中動(dòng)脈)或其分支的血栓性或栓子性阻塞所致，約占所有類型卒中的 80%[5]。藥物或是機(jī)械再灌注治療是缺血性發(fā)作急性期最有效的治療方法，其中50%～ 70% 患者都有很好的愈后。然而因?yàn)橹委煏r(shí)間窗短等各種嚴(yán)格的限制，這些治療方法僅適用于不到 10% 的患者中[6]。卒中的治療及預(yù)防成為當(dāng)前神經(jīng)科學(xué)研究的方向和熱點(diǎn)之一，特別是其發(fā)病機(jī)制、臨床轉(zhuǎn)歸、新治療手段等成為目前卒中的基礎(chǔ)與臨床研究的熱點(diǎn)科學(xué)問(wèn)題。而建立一種可靠的模擬人類缺血性腦血管病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型對(duì)腦缺血的發(fā)病機(jī)制研究至關(guān)重要。

在各項(xiàng)研究中，鼠實(shí)驗(yàn)性急性腦缺血模型使用最為廣泛[7]，其中大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型是目前最常用的模擬人類缺血缺氧性腦病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。目前較為常用的方法有Tamura等在1981[8]年提出的電凝法和Longa等[9]于1989年提出的線栓法，其他方法還有光化學(xué)法[10]，微栓子栓塞法[11]等。目前線栓法是應(yīng)用最多的造模方法[12]，但是其缺點(diǎn)是模型之間梗死面積差異較大，均一性較低，梗死面積大，死亡率高[9]。電凝法也是應(yīng)用較多的一種造模方法，它具有均一性高，術(shù)后死亡率低，模型存活時(shí)間較長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)[8]。

目前MCAO模型的制備多采用大鼠，但是隨著腦缺血研究逐步向基因領(lǐng)域的延伸，并鑒于大多數(shù)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物來(lái)源于小鼠，因此迫切需要建立一種小鼠的局灶性腦缺血模型，以便于在基因水平進(jìn)行腦缺血損傷的病理生理改變的機(jī)制，預(yù)后及藥物治療作用的研究。但由于小鼠頸總動(dòng)脈較細(xì)，線栓插入困難，模型制作成功率低，小鼠死亡率高。我們采用開顱機(jī)械閉塞大腦中動(dòng)脈法在直視下操作準(zhǔn)確可靠，與人類缺血性卒中的病理改變較為接近，即MCA阻斷而側(cè)支循環(huán)尚存，受累腦組織包括嚴(yán)重缺血的中心區(qū)(梗塞灶)、缺血受損傷的周圍區(qū)(半暗帶)及接近正常的外圍帶, 梗死模型成功率較高，梗死范圍穩(wěn)定，梗死效果較好，動(dòng)物存活時(shí)間長(zhǎng)。

因此本研究采用小鼠，小鼠體質(zhì)量差異小，并且電凝法建立小鼠 MCAO 缺血模型操作簡(jiǎn)便，手術(shù)時(shí)間短，提高了模型制作的成功率，減少了術(shù)后動(dòng)物死亡率，提高了模型制作的穩(wěn)定性，縮短了模型制作的操作時(shí)間。為系統(tǒng)地研究腦缺血的病理生理及觀察藥物的治療作用提供了一個(gè)較接近臨床的、重現(xiàn)性好、可控的腦缺血模型。

腦組織厚片TTC染色是研究腦缺血梗死灶常用的染色方法。TTC與完整的線粒體氧化酶系反應(yīng)，誘發(fā)產(chǎn)生深紅色產(chǎn)物而使正常組織染色；缺血組織的線粒體損傷[13]，不能誘導(dǎo)染色反應(yīng)而呈白色，容易鑒別，因此我們采用此方法來(lái)觀察腦組織梗死灶。術(shù)后 24 h 小鼠腦組織切片 TTC 染色，可見(jiàn)大腦皮質(zhì)梗死灶呈白色，手術(shù)半球明顯缺血。由于卒中引起的腦損傷通常與運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)和認(rèn)知功能受損等相關(guān)，很多實(shí)驗(yàn)室的研究集中于評(píng)估與動(dòng)物模型的腦缺血相關(guān)的認(rèn)知和行為學(xué)改變。到目前為止，沒(méi)有單一的一種評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)被普遍承認(rèn)，大多數(shù)研究室都采用多種不同的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)價(jià)缺血效果。多種神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分系統(tǒng)被用于評(píng)價(jià)神經(jīng)功能障礙的嚴(yán)重程度[14-15]。在本研究中, 我們采用的神經(jīng)行為學(xué)觀察性評(píng)分指標(biāo)包括運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)和平衡木試驗(yàn)，對(duì)小鼠總體神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的分析顯示，缺血損傷可明顯增加缺血后小鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。此結(jié)果與 TTC 染色和鏡下病理組織變化結(jié)果相一致。

以上結(jié)果提示，我們采用的電凝法可以在Balb/c小鼠中成功制作小鼠局灶性腦缺血模型。