杜江濤 武曉靜 戴方偉 盧領(lǐng)群 周莎桑 應(yīng)華忠 郭紅剛

(1.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院浙江省實驗動物中心，杭州 310013)(2.杭州市中醫(yī)院，杭州 310007)

隨著生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，越來越多的轉(zhuǎn)基因小鼠應(yīng)用到科學(xué)研究中。而在轉(zhuǎn)基因小鼠制備、飼養(yǎng)、運輸及品系共享等過程中，極易造成病原微生物的感染，生物凈化是目前去除病原微生物感染的有效途徑[1]。

生物凈化主要有剖宮取胎和體外受精-胚胎移植兩種方法。剖宮取胎操作相對簡單，但存在凈化不徹底和難以計算最佳剖宮時間等弊端；而體外受精-胚胎移植則需要掌握扎實的胚胎移植技術(shù)[2]。

體外受精-胚胎移植法在實際應(yīng)用中需要大量的成熟卵子，但在超排過程中，由于小鼠年齡、品系、激素用量等許多因素的影響，常常會出現(xiàn)超排失敗或只有少量成熟卵子排出的現(xiàn)象，造成凈化失敗。這對于轉(zhuǎn)基因小鼠，特別是一些珍稀轉(zhuǎn)基因品系來說，是一種巨大的資源浪費。本文旨在利用卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)(invitromaturation,IVM)，深度挖掘未排卵小鼠卵巢內(nèi)未成熟卵的發(fā)育潛力，以提高珍稀轉(zhuǎn)基因小鼠的卵子利用率，同時也作為常規(guī)促排卵失敗的一種補(bǔ)救措施。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

實體顯微鏡(LEICA,S8AP0)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)；超凈工作臺(蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司)。

α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液(M4526，Sigma)；胎牛血清(22011-8612，浙江天杭生物科技股份有限公司)；丙酮酸鈉(P4562，Sigma)；M2培養(yǎng)液(M1250，南京愛貝生物科技有限公司)；獲能液/體外受精液(MR-070-D，Millipore)；胚胎發(fā)育液(MR-121，Millipore)；PMSG(160926)和HCG(160820)均購自寧波第二激素廠。

1.2 實驗動物

待凈化轉(zhuǎn)基因小鼠，雌鼠4～6周齡，雄鼠8周齡，來源于科研用小鼠。

清潔級ICR小鼠，雌鼠4～6周齡，雄鼠6～8周齡。來源于上海斯萊克實驗動物公司，使用許可證號：SCXK(滬)2017-0005。

以上動物均飼養(yǎng)于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心屏障系統(tǒng)隔離包內(nèi)，動物飼養(yǎng)合格證號：SYXK(浙)2014-0008。自由采食飲水，光照12 h/d(7:00-19:00)。

1.3 結(jié)扎公鼠的制備

6～8周齡ICR雄鼠，1%戊巴比妥鈉麻醉后切開下腹部皮膚和肌肉，暴露兩側(cè)輸精管，無菌彎鑷在酒精燈火焰上燒燙后迅速將輸精管夾斷。將斷開的輸精管小心放置原位，撒上少許青霉素粉后縫合肌肉皮膚，1個月后使用。

1.4 小鼠超排

實驗分組：A組：注射PMSG和HCG后未排卵卵巢，取卵泡內(nèi)未成熟卵體外培養(yǎng)；B組：只注射PMSG，48 h后取卵泡內(nèi)未成熟卵體外培養(yǎng)；C組：注射PMSG和HCG后，輸卵管內(nèi)取成熟卵(正常超排組)直接進(jìn)行體外受精；D組：注射PMSG和HCG后未排卵卵巢，取卵泡內(nèi)裸卵和疑似成熟卵體外培養(yǎng)。下文均簡稱A組、B組、C組和D組。

下午5點，小鼠4周齡5 IU/只，5～6周齡7.5 IU/只，腹腔注射PMSG，48 h后注射相同劑量HCG，16～18 h后收集成熟卵母細(xì)胞、未成熟卵母細(xì)胞、裸卵和疑似成熟卵。只注射PMSG組則在注射PMSG 46～48 h后取未成熟卵，體外成熟培養(yǎng)16～18 h后進(jìn)行體外受精與體外胚胎培養(yǎng)(具體方法詳見1.6)。

1.5 培養(yǎng)基準(zhǔn)備

體外成熟培養(yǎng)液按參考文獻(xiàn)配制，主要成分為：α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，5%胎牛血清(FBS)，3ng/mL EGF，50mIU/mL rhFSH，0.25 mmol/L丙酮酸鈉，青霉素與鏈霉素各0.5%[3]，0.2 μm濾膜過濾后分裝冷凍備用。

采卵前一天，用直徑35 mm培養(yǎng)皿分別做IVM液、獲能液/受精液、KSOM培養(yǎng)液等液滴，上覆石蠟油，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)過夜孵育。

1.6 精子獲能、體外受精與未成熟卵IVM

1.6.1精子獲能：采卵前1 h，頸椎脫臼處死雄鼠，在1∶200稀釋萬潔消毒液中浸泡消毒，置于干凈衛(wèi)生紙上吸干液體。無菌手術(shù)器械取其兩側(cè)附睪尾，剔除多余脂肪組織，在無菌濾紙上來回滾動數(shù)次除去血漬，放入提前過夜孵育的獲能皿的石蠟油中。用無菌鑷夾住附睪尾使其繃緊，并用1 mL無菌注射器針頭刺破附睪尾，將溢出的精液移到獲能液滴中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中獲能1 h。

1.6.2體外受精：凈化用轉(zhuǎn)基因雌鼠，HCG注射16～18 h后，頸椎脫臼處死，1∶200稀釋萬潔消毒液中浸泡消毒，取其兩側(cè)卵巢和輸卵管，將其置于提前預(yù)熱至37 ℃的M2培養(yǎng)液中。M2培養(yǎng)液中再次清洗后，放在無菌濾紙上吸干液體，然后轉(zhuǎn)到提前過夜孵育的受精液滴皿的石蠟油中?？拷芫旱危业捷斅压芘虼蟛?，用1 mL無菌注射器劃破膨大部，將卵子移到受精液滴中。未見膨大部的卵巢則置于M2培養(yǎng)液中，37 ℃保溫備用。

取在培養(yǎng)箱中獲能1 h的獲能液滴皿，顯微鏡下檢查精子活力和精子數(shù)量。用移液器吸取獲能液滴周邊精子10 μL(約含精子200個/μL)，加入到已移入卵子的受精液滴中(50～100個)。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中受精4 h，然后將所有卵子轉(zhuǎn)至胚胎發(fā)育液KSOM中。

1.6.3未成熟卵IVM：取M2中保存的未超排卵巢，實體顯微鏡下用鑷子將卵巢周邊的脂肪及輸卵管剝離干凈，M2中清洗2～3次后，轉(zhuǎn)入事先37 ℃預(yù)熱的α-MEM中。用1 mL注射器針頭劃破卵泡，釋放卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)。無菌玻璃管在酒精燈火焰上烤熱熔化后迅速拉至直徑比COCs稍粗的玻璃針(提前準(zhǔn)備)，用口吸管吸取至少有3層顆粒細(xì)胞包裹的COCs，轉(zhuǎn)至另一皿干凈的α-MEM中。撿卵結(jié)束后將所有的COCs轉(zhuǎn)至事先在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱過夜孵育的IVM液滴中，清洗2～3次后轉(zhuǎn)至200 μL大液滴，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16～18 h，然后進(jìn)行體外受精。精子獲能、體外受精方法同上。體外受精4 h后轉(zhuǎn)至胚胎發(fā)育液KSOM中。

取注射PMSG和HCG后未排卵卵巢卵泡內(nèi)的裸卵和疑似成熟卵(卵丘顆粒細(xì)胞已擴(kuò)散)，分為三組進(jìn)行實驗：直接受精；體外成熟培養(yǎng)6 h后受精和體外成熟培養(yǎng)16～18 h后受精。受精4 h后轉(zhuǎn)至胚胎發(fā)育液KSOM中。

1.7 受體小鼠的挑選、合籠與胚胎移植

體外受精當(dāng)天下午5點左右，挑取陰門紅腫發(fā)情的ICR雌鼠，與結(jié)扎雄鼠1∶1合籠交配。于次日早上挑取有陰栓的小鼠(即受體小鼠)，無菌環(huán)境下從隔離包轉(zhuǎn)至超凈工作臺。

受體小鼠1%戊巴比妥鈉麻醉，背部剃毛，75%酒精，碘酊再75%酒精消毒。在卵巢位置剪一縱向小口，依次剪開皮膚、肌肉、腹膜后，用鑷子找到脂肪墊，將其和卵巢、輸卵管一起拉出。用脂肪夾夾住脂肪墊，固定好卵巢和輸卵管，在顯微鏡下找到輸卵管膨大部并將其調(diào)整至最高位。玻璃針最前端吸取3個氣泡，然后吸取20～30個2-細(xì)胞胚，在輸卵管膨大部前端進(jìn)針，將2-細(xì)胞胚吹至膨大部。當(dāng)三個氣泡均吹至膨大部時，說明全部2-細(xì)胞胚已經(jīng)移植到輸卵管膨大部內(nèi)。

2 結(jié)果

2.1 A組和B組與C組卵細(xì)胞體外成熟率、二胞率、囊胚率及出生率

注射PMSG和HCG后，未排卵卵巢(A組)，取卵泡內(nèi)未成熟卵體外培養(yǎng)，3次重復(fù)實驗，其成熟率為：88.6%(62/70)，83.3%(45/54)，89.2%(66/74)。二胞率為：67.1%(47/70)，42.6%(23/54)，55.4%(41/74)。13枚二細(xì)胞胚胎體外發(fā)育，有3枚發(fā)育至囊胚，囊胚發(fā)育率為23.1%(3/13)。將41枚二細(xì)胞胚胎移植到2只受體鼠體內(nèi)，其中1只生出5只幼崽，產(chǎn)仔率為12.2%(5/41)。

只注射PMSG，48 h后取卵泡內(nèi)未成熟卵(B組)，4次體外成熟培養(yǎng)，其成熟率為：79.3%(65/82)，88.1%(140/159)，82.4%(131/159)，86.0%(92/107)。二胞率為：59.8%(49/82)，44.0%(70/159)，43.4%(69/159)，59.8%(64/107)。囊胚率為：36.7(18/49)，58.6(41/70)，30.4(21/69)，28.1(18/64)。

注射PMSG和HCG后，輸卵管內(nèi)取成熟卵(C組)，直接進(jìn)行體外受精，受精后二胞率為：79.5%(167/210)，79.0%(233/295)，78.3%(195/249)。囊胚率為：73.7%(123/167)，79.8%(186/233)，80.5%(157/195)。見表1。

A組與B組相比，其成熟率和二胞率均無顯著性差異(P>0.05)。A組二胞率與C組相比，有顯著性差異(P<0.05)。B組二胞率與C組相比，有極顯著性差異(P<0.01)。A組和B組與C組相比，囊胚率均有極顯著性差異(P<0.01)。

表1 A組、B組和C組卵細(xì)胞體外發(fā)育結(jié)果Table 1 Oocytes in vitro development results of group A,B and C.

2.2 D組不同成熟培養(yǎng)時間卵細(xì)胞體外成熟率、二胞率及囊胚率

注射PMSG和HCG后未排卵的卵巢，取卵泡內(nèi)裸卵和疑似成熟卵(D組)，體外成熟培養(yǎng)時間分為三組：成熟培養(yǎng)0 h(即直接進(jìn)行體外受精)；成熟培養(yǎng)6 h和成熟培養(yǎng)16～18 h。受精后成熟培養(yǎng)0 h兩次重復(fù)實驗二胞率為10.2%、15.6%，囊胚率為0.0%、22.7%；成熟培養(yǎng)6 h二胞率為5.7%，囊胚率為0.0%；成熟培養(yǎng)16～18 h兩次重復(fù)實驗二胞率為1.3%、18.6%，囊胚率為0.0%、3.3%。(詳見表2)。

表2 D組卵細(xì)胞體外發(fā)育結(jié)果Table 2 Oocytes in vitro development results of group D

D組中體外成熟培養(yǎng)0 h、6h和16～18 h，其二胞率和囊胚率與組A、B、C相比均有極顯著性差異。

3 討論

3.1 超數(shù)排卵

通過超數(shù)排卵獲得大量整齊優(yōu)質(zhì)的卵子是生物凈化、轉(zhuǎn)基因、克隆等研究的基礎(chǔ)之一。影響超排的因素有很多，如：供體雌鼠的品系、年齡與體質(zhì)量、激素的注射劑量和注射時間、環(huán)境因素(溫度、濕度和噪聲)等[4]。

我們在試驗中，對不同品系小鼠一律采用：3～4周腹腔注射5 IU PMSG和HCG；5～6周注射7.5 IU PMSG和HCG；而對7周及以上則注射10 IU PMSG和HCG，兩種激素注射間隔時間均為48 h。結(jié)果表明，C57BL/6 J小鼠超排效果最好且穩(wěn)定。宋紹征等[5]研究發(fā)現(xiàn)在相同劑量激素條件下，ICR小鼠和C57BL/6 J小鼠的超排效果顯著優(yōu)于BALB/c小鼠和FVB小鼠，我們試驗結(jié)果與其相一致，原因可能是近交系的遺傳因素導(dǎo)致BALB/c、FVB、129等小鼠的繁殖能力較差。

3～4周小鼠相較于其它周齡小鼠，可獲得最好的超排效果，這與徐平[6]的研究結(jié)果相一致，這可能是性成熟后的小鼠固有的性周期和性激素對外源性的超排激素(PMSG和HCG)有影響。

關(guān)于小鼠超排最合適的激素用量，目前國外多采用eCG/PMSG和HCG各5IU或各7.5IU劑量[3, 7-9]，國內(nèi)有的采用PMSG和HCG各5IU或各10IU劑量。而我們在試驗過程中，則根據(jù)小鼠年齡體質(zhì)量的不同做了適當(dāng)調(diào)整。

年齡較大雌鼠和一些近交系小鼠(BALB/c、FVB、129等)的超排效果一直較差，甚至無排卵，正是這些問題的存在，迫使我們尋找一種新的方法來提高卵子利用率，卵母細(xì)胞體外成熟則為解決這一問題提供了新的途徑。

3.2 卵母細(xì)胞體外成熟

卵母細(xì)胞體外成熟(invitromaturation,IVM)是一項重要的輔助生殖技術(shù)和研究工具。因其可以生產(chǎn)成熟卵子被廣泛應(yīng)用于各研究領(lǐng)域，如：人類不孕癥治療、家畜人工育種中的胚胎生產(chǎn)、克隆、干細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等[9]。

小鼠卵母細(xì)胞體外成熟一般是在注射eCG/PMSG 44或48 h后直接從卵泡中取未成熟卵體外培養(yǎng)[10-12]，而我們在生物凈化中則是針對注射PMSG和HCG后未排卵的卵巢。為了比較注射HCG對卵巢卵泡內(nèi)未成熟卵體外發(fā)育的影響，我們設(shè)置了兩組試驗：注射PMSG和HCG后未排卵組(A組)和只注射PMSG，48 h后取未成熟卵組(B組)，同時以注射PMSG和HCG后正常超排卵組(C組)作為對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：注射HCG對卵泡內(nèi)未成熟卵體外成熟、體外受精、體外胚胎發(fā)育等并無影響，A組與B組的成熟率、二胞率均無顯著性差異(P>0.05)。因A組體外受精后大部分二細(xì)胞胚胎用于移植，只有很少一部分(13枚)用來做體外胚胎發(fā)育，所以A組與B組的囊胚率并無可比性。A組的二細(xì)胞胚胎做了3次移植試驗，分別移植34、23和41枚二細(xì)胞胚，但因受體等各種因素的影響，只成功了一次。41枚二細(xì)胞胚移植到兩只受體小鼠輸卵管內(nèi)，其中一只成功受孕生出5只小鼠(2雄3雌)，5只小鼠性成熟后相互交配可產(chǎn)下正常的后代，說明通過IVM技術(shù)出生的小鼠是健康可育的[13]。

但是，注射HCG可導(dǎo)致超排后的卵巢質(zhì)地松軟，卵巢表面缺少較好的卵泡，卵泡內(nèi)部大部分為裸卵或卵丘顆粒細(xì)胞已經(jīng)擴(kuò)散的卵(疑似成熟卵)。與只注射PMSG相比，注射HCG后獲得的質(zhì)量較好的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物(COCs，至少有三層顆粒細(xì)胞包裹)大大減少。但是只要有顆粒細(xì)胞包裹的COCs，在體外成熟培養(yǎng)16～18 h后，顆粒細(xì)胞均會擴(kuò)散，經(jīng)體外受精后大部分可卵裂至二細(xì)胞胚胎，其成熟率和受精率均較理想。

A組、B組與正常超排卵對照組(C組)相比，卵細(xì)胞成熟率、二胞率和囊胚率均有顯著性差異，說明在現(xiàn)有的技術(shù)條件下，卵細(xì)胞體外成熟仍不能完全模擬其體內(nèi)發(fā)育環(huán)境和條件，對卵細(xì)胞成熟的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

PMSG和HCG注射后未排卵卵巢，卵泡內(nèi)有大量裸卵和疑似成熟卵(卵丘顆粒細(xì)胞已擴(kuò)散卵)，為了進(jìn)一步挖掘這部分卵子的利用價值，我們分三組進(jìn)行試驗：體外成熟培養(yǎng)0 h(直接進(jìn)行體外受精)、體外成熟培養(yǎng)6 h后體外受精和體外成熟培養(yǎng)16～18 h后體外受精。直接進(jìn)行體外受精組，兩次重復(fù)實驗，受精后二胞率分別為15.6%(22/141)和10.2(5/49)，囊胚率分別為22.7%(5/22)和0%(0/5)。說明在這些裸卵和疑似成熟卵中，有真正的成熟卵，但只是占很少一部分比例。體外成熟培養(yǎng)6 h組二胞率為5.7%(3/53)，囊胚率為0%(0/3)；體外成熟培養(yǎng)16～18 h組，兩次重復(fù)實驗，二胞率分別為18.6%(30/161)和1.3%(1/79)，囊胚率分別為3.3%(1/30)和0%(0/1)。說明在這些裸卵和疑似成熟卵中，只有很少一部分可以在體外成熟培養(yǎng)后獲得受精能力。不管是直接進(jìn)行體外受精，還是體外成熟培養(yǎng)6 h、16～18 h后進(jìn)行體外受精，裸卵和疑似成熟卵受精后的二胞率、囊胚率都不盡如人意。分析其原因可能是這部分卵子，由于沒有卵丘顆粒細(xì)胞的包裹，所以在體外成熟培養(yǎng)中不能很好地接受成熟因子的調(diào)控[8]。然而，只注射PMSG(B組)的卵泡中，大部分是有顆粒細(xì)胞包裹的未成熟卵，裸卵只有很少一部分，并且未見到有疑似成熟卵。由此得出結(jié)論：注射PMSG和HCG后未排卵卵巢卵泡內(nèi)大量的裸卵和疑似成熟卵是HCG作用的結(jié)果，至于為什么沒有排出原因尚不清楚。

綜上所述，卵母細(xì)胞體外成熟(IVM)可以作為生物凈化中小鼠促排卵失敗的一種補(bǔ)救措施，并且可以提高一些珍稀轉(zhuǎn)基因品系小鼠的卵子利用率。