李 剛 喻紅彪 任思宏

(南充市中心醫(yī)院麻醉科，南充 637000)

高濃度的氧對(duì)嚴(yán)重的呼吸衰竭有良好的治療作用，一般在重癥監(jiān)護(hù)室應(yīng)用較多[1]。但是長(zhǎng)時(shí)間地吸入高濃度的氧氣卻會(huì)造成肺損傷[2]。高氧造成的肺損傷的原因主要是線粒體產(chǎn)生的活性氧，活性氧可活化炎癥細(xì)胞，以及釋放炎性介質(zhì)，引起肺組織結(jié)構(gòu)的重建與上皮細(xì)胞死亡，是急性肺損傷的原因[3]。右美托咪定是一種高選擇性的腎上腺素受體激動(dòng)劑[1-2]，近年來(lái)在臨床上的使用已經(jīng)越來(lái)越廣泛。右美托咪定對(duì)血流動(dòng)力學(xué)影響輕微[3]，已被廣泛應(yīng)用于外科手術(shù)。右美托咪定可以通過(guò)抑制凋亡和抗炎作用從而保護(hù)機(jī)體的大腦，肝臟，腸胃，心臟以及肺部組織[4]。炎癥小體是調(diào)節(jié)先天性免疫的多蛋白復(fù)合物[4]，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在大量與腦損傷有關(guān)的炎癥小體[5]。目前國(guó)內(nèi)外在眾多的炎癥小體的研究中，NLRP3是研究的熱點(diǎn)[6]。炎癥小體和肺損傷機(jī)制關(guān)聯(lián)研究則相對(duì)較少。本研究探究右美托咪定對(duì)炎癥小體NLPR3抑制作用以及肺損傷的恢復(fù)機(jī)制，為右美托咪定預(yù)防及治療肺損傷方面提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取成年雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量為(285.67±8.3)g，購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證：SCXK滬2002-0010)；鹽酸右美托咪定購(gòu)自江蘇恩華藥業(yè)(批號(hào)：20131768)；兔源抗β-actin單克隆抗體來(lái)自碧云天公司；兔抗鼠Cav-1和NLRP3抗體均來(lái)自美國(guó)CST公司；基因的相關(guān)引物設(shè)計(jì)來(lái)自天津賽默飛公司。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模：將大鼠編號(hào)，隨機(jī)分為空白對(duì)照、模型組及右美托咪定組，各組10只。各組大鼠新環(huán)境適應(yīng)期3 d，空白對(duì)照組呼吸正常室內(nèi)空氣，模型高氧組大鼠放置于密閉氧氣環(huán)境內(nèi)，艙內(nèi)連接有輸氧管和測(cè)氧儀，實(shí)驗(yàn)組高氧濃度為100%，高氧呼吸時(shí)間為1周，期間不斷檢測(cè)氧氣濃度。右美托咪定組大鼠在高氧艙內(nèi)期間，尾靜脈單次注射右美托咪定溶液，劑量為0.6 μg/kg體質(zhì)量，注射時(shí)間30 s。各組大鼠攝食飲水正常，飼養(yǎng)溫度23～25 ℃。

1.2.2生化指標(biāo)檢測(cè)

1.2.2.1 大鼠呼吸頻率檢測(cè):應(yīng)用成都儀器廠生產(chǎn)的DHX-150動(dòng)物呼吸機(jī)來(lái)監(jiān)測(cè)大鼠呼吸頻率，將各組SD大鼠麻醉以后，套上呼吸機(jī)，潮氣量：4 mL/100 g，呼吸比：1∶1參數(shù)下檢測(cè)大鼠呼吸次數(shù)，記錄對(duì)比。

1.2.2.2 大鼠血清中IL-6、iNOS等含量檢測(cè):完成呼吸頻率監(jiān)測(cè)后1 h取大鼠尾靜脈外周血5 mL。應(yīng)用酶聯(lián)免疫ELISA法監(jiān)測(cè)血清中的可溶性IL-6、iNOS等含量，將抗凝劑加入到提前準(zhǔn)備好的潔凈試管中以后，于1 000 r/min離心，20 min，4℃條件下收取血清，在超低溫下冷凍保存。解凍以后使用試劑盒測(cè)定其濃度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組的血清中IL-6、iNOS濃度。

1.2.2.3 大鼠肺組織干濕重比例測(cè)定:SD大鼠在高氧倉(cāng)飼養(yǎng)1周后，麻醉處死大鼠，取其肺部組織，精準(zhǔn)稱(chēng)量右肺組織濕重，稱(chēng)量之后立即放入到100 ℃的烘箱中，鼓風(fēng)干燥48 h后稱(chēng)量質(zhì)量，所稱(chēng)得為組織干重。肺組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.2.2.4 大鼠基因引物設(shè)計(jì):IL-2，TNFα以及β-actin引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR過(guò)程中引物序列(n=16)Table 1 Primer sequences in RT-PCR (n=16)

1.2.2.5 RT-PCR法測(cè)定SD大鼠血清中VEGF和bFGF表達(dá)量:使用軟件設(shè)計(jì)小鼠β-actin，TNF-α和IL-2上下游引物序列，選取長(zhǎng)度小于150 bp的片段。RNA的提?。簩⒏鹘M60 mg的肺部組織置入離心管以后，加入Trizol試劑，研磨后離心取上清，后加入氯仿繼續(xù)離心取上清，加入異丙醇，吸取上清取沉淀，后用DEPC水溶解，于PCR擴(kuò)增儀中擴(kuò)增。上樣：將50×的TAE 稀釋為1× TAE 溶液作為溶劑，稱(chēng)取0.52 g 瓊脂糖，加入到1×TAE溶液當(dāng)中，之后微波爐加熱煮沸，后加入 4 μL的核酸染料，搖晃混勻。最后將瓊脂糖凝膠水平放入電泳槽，依次加入 6 μL的 DNA Marker 以及目的基因 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.2.6 Western Blot法測(cè)定大鼠IL-2、TNFα、NLPR3和Cav-1蛋白含量:取各組大鼠左肺組織60 mg，剪碎后置到離心管中，加RIPA裂解液和PMSF研磨1 min，后離心15 min取上清。用考馬斯法檢測(cè)各管吸光值，將各組蛋白調(diào)至同樣濃度后進(jìn)行蛋白上樣。把NC膜放入到平皿后在容器中添加脫脂奶粉并在搖床上暗處封閉0.5～1.5 h。棄去奶粉后取出NC膜置于TBST中沖洗3次以后加入兔抗鼠Cav-1,β-actin和NLRP3抗體，4 ℃下孵育過(guò)夜。第2天取出NC膜，于TBST溶液中洗滌4次后加入2抗孵育，發(fā)光液a液和b液按1∶1 的比例現(xiàn)用現(xiàn)配，由左至右緩慢滴加到膜上，轉(zhuǎn)移到暗室進(jìn)行膠片沖洗。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織干濕重比和呼吸頻率

造模前，各組大鼠呼吸頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模后，與對(duì)照組比較，模型組和右美托咪定組大鼠呼吸頻率顯著降低；與模型組比較，右美托咪定組大鼠呼吸頻率顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，模型組肺組織干濕重比例顯著升高；與模型組比較，右美托咪定組肺組織干濕重比例顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.2 血清VEGF和bFGF含量結(jié)果比較

在造模1周后，與對(duì)照組比較，模型組和右美托咪定組血清中VEGF和bFGF水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，右美托咪定組血清中VEGF和bFGF水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠肺組織干濕重和呼吸頻率結(jié)果Table 2 Results of dry and wet weight and respiratory rate of lung tissue in each

注：與對(duì)照組相比較，*P<0.05；與模型組相比較，#P<0.05

Note: compared with the control group,*P<0.05; compared with the model group,#P<0.05

表3 各組大鼠血清中VEGF和bFGF含量比較(n=16)Table 3 Comparison of serum VEGF and bFGF levelsin each group of rats (n=16)

注：與對(duì)照組相比較，*P<0.05；與模型組相比較，#P<0.05

Note: compared with the control group,*P<0.05;compared with the model group,#P<0.05

2.3 血清IL-6和iNOS蛋白含量比較

在造模1周以后，與對(duì)照組比較，模型組和右美托咪定組IL-6和iNOS水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，右美托咪定組IL-6和iNOS水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠血清中IL-6和iNOS含量比較(n=16)Table 4 Comparison of serum IL-6 and iNOS (n=16)

注：與對(duì)照組相比較，*P<0.05；與模型組相比較，#P<0.05

Note: compared with the control group,*P<0.05; compared with the model group,#P<0.05

2.4 IL-2和TNFα表達(dá)情況

RT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組IL-2和TNFα的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。右美托咪定組的IL-2和TNFα表達(dá)量與模型組相比降低，與對(duì)照組相比略有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表5，圖1。

表5 各組大鼠IL-2和TNFα表達(dá)量比較(n=16)Table 5 Comparison of IL-2 and TNFα expression(n=16)

注：與對(duì)照組相比較，*P<0.05；與模型組相比較，#P<0.05

Note: compared with the control group,*P<0.05;compared with the model group,#P<0.05

圖1 RT-PCR 檢測(cè)IL-2和TNFα表達(dá)情況Fig.1 RT-PCR detection of IL-2 and TNFα expression

2.5 NLPR3和Cav-1蛋白表達(dá)情況

蛋白質(zhì)免疫印記檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組和右美托咪定組的NLPR3和Cav-1蛋白表達(dá)量顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，右美托咪定組NLPR3和Cav-1蛋白表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表6，圖2。

表6 各組大鼠NLPR3和Cav-1蛋白表達(dá)量比較(n=16)Table 6 Comparison of NLPR3 and Cav-1protein expression (n=16)

注：與對(duì)照組相比較，*P<0.05；與模型組相比較，#P<0.05

Note: compared with the control group,*P<0.05;compared with the model group,#P<0.05

圖2 Western Blot 檢測(cè)NLPR3和Cav-1蛋白表達(dá)情況Fig.2 Western Blot detection of NLPR3 andCav-1 protein expression

3 討論

急性肺損傷指的是直接或者間接因素引起的肺泡及毛細(xì)血管細(xì)胞的損傷[7-8]，導(dǎo)致肺部間質(zhì)水腫以及急性呼吸功能不全，呼吸窘迫。由高氧引起的急性肺損傷案例目前已有很多報(bào)道[9]，一方面氧氣量的保障對(duì)不能自主呼吸的病人十分重要，另一方面長(zhǎng)時(shí)間的吸入高純度的氧又會(huì)造成肺損傷，所以尋求合適的方式治療或預(yù)防由高氧引起的急性肺損傷十分重要。

VEGF和bFGF 在血管生成作用中占有重要的位置，可改善組織的缺氧狀態(tài)，研究表明血清中VEGF和bFGF的含量與肺損傷嚴(yán)重程度相關(guān)[10-11]。本研究顯示，大鼠在高氧倉(cāng)飼養(yǎng)1周造模以后，模型組和右美托咪定組血清中VEGF和bFGF含量整體變低。右美托咪定組SD大鼠VEGF和bFGF含量與正常相比略有變化，與模型組相比恢復(fù)明顯。此外，SD大鼠在實(shí)驗(yàn)期間肺組織的干濕重比例結(jié)果顯示，模型組的肺組織干濕重比明顯高于空白對(duì)照組和右美托咪定組，呼吸也變緩慢甚至衰竭，當(dāng)給藥以后各項(xiàng)指標(biāo)均大幅恢復(fù)接近空白對(duì)照組，此結(jié)果初步探討了右美托咪定對(duì)肺損傷的恢復(fù)作用。綜合以往研究結(jié)果顯示[3,6]，右美托咪定對(duì)大鼠呼吸頻率及其它指標(biāo)恢復(fù)更顯著，但其作用機(jī)制尚不明確。

白介素的表達(dá)量會(huì)直接引起炎癥反應(yīng)[12-13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在構(gòu)建高氧模型以后，血清中的IL-6和IL-2表達(dá)量升高，高于空白對(duì)照組，經(jīng)過(guò)右美托咪定干預(yù)后，IL-2和IL-6表達(dá)量降低，接近正常水平，結(jié)果顯示，右美托咪定可以降低肺損傷，減少白介素的過(guò)度表達(dá)。TNF-a是腫瘤壞死因子，腫瘤壞死因子是炎癥反應(yīng)過(guò)程中直接相關(guān)的炎癥因子[14]。報(bào)道顯示，TNF-α的表達(dá)量升高直接反應(yīng)機(jī)體炎癥程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在構(gòu)建高氧模型以后，模型組的TNF-α的表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組，但是經(jīng)過(guò)右美托咪定干預(yù)后，TNF-α表達(dá)量降低，肺損傷程度也對(duì)應(yīng)降低，提示右美托咪定對(duì)急性肺損傷的治療可能與炎癥因子調(diào)控相關(guān)。

NLRP3是細(xì)胞凋亡的重要蛋白[15-16]，本研究發(fā)現(xiàn)，建模以后，NLRP3的蛋白表達(dá)量明顯升高，注射右美托咪定之后，NLRP3蛋白表達(dá)量降低，此結(jié)果驗(yàn)證右美托咪定阻遏高氧引起的急性肺部損傷有NLRP3的參與。Cav-1是重要的結(jié)構(gòu)與調(diào)節(jié)蛋白，會(huì)參與到各組通路信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)當(dāng)中，調(diào)節(jié)細(xì)胞的跨膜和轉(zhuǎn)運(yùn)，研究表明，Cav-1所在通路的激活會(huì)調(diào)控炎癥因子的表達(dá)，使肺損傷加重[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組Cav-1的蛋白表達(dá)量與空白對(duì)照組相比呈升高趨勢(shì)，進(jìn)一步提示右美托咪定可以通過(guò)降低Cav-1蛋白表達(dá)量來(lái)緩解急性肺損傷。本研究顯示，右美托咪定可降低由高氧引起的肺損傷導(dǎo)致的呼吸頻率降低，肺組織干濕重比例變大。此外，右美托咪定還可以降低血清中的白介素IL-6，iNOS，VEGF和bFGF的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)IL-2和TNF-α等促炎因子的表達(dá)水平。蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，右美托咪定可降低NLRP3和Cav-1蛋白的表達(dá)量，因此我們認(rèn)為右美托咪定治療急性肺損傷可以通過(guò)下調(diào)NLRP3炎癥小體，激活Cav-1所在通路，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)肺高氧損傷保護(hù)。既往相關(guān)機(jī)制研究主要集中于TLR通路調(diào)控，本研究為右美托咪定肺部保護(hù)機(jī)制提供了新的方向。

綜上，右美托咪定可通過(guò)抑制NLRP3的異常表達(dá)，減少下游關(guān)鍵蛋白Cav-1等的表達(dá)，抑制重要的炎癥相關(guān)因子IL-2，IL-6，TNF-a等炎癥因子的表達(dá)，緩解急性肺損傷。