董建一 許 堯 胡雨奇 張利龍龍尚琴 李鵬飛 王靖宇 李 明

(1.大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，大連 116044)(2. 大連醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院，大連 116044)(3.大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生態(tài)學(xué)教研室，大連 116044)

導(dǎo)盲犬是輔助視障人士出行的工作犬。我國導(dǎo)盲犬事業(yè)與歐美國家相比起步較晚[1]，導(dǎo)盲犬培訓(xùn)成功率低、成本高、周期長是各國導(dǎo)盲犬培訓(xùn)機(jī)構(gòu)都面臨的問題[2]。導(dǎo)盲犬培訓(xùn)共分為寄養(yǎng)期、培訓(xùn)期、服役期三個(gè)階段，其中寄養(yǎng)期和培訓(xùn)期是導(dǎo)盲犬的早期篩選階段[3]，篩選的主要方式是通過動(dòng)物行為學(xué)測(cè)試對(duì)犬的行為反應(yīng)和認(rèn)知功能進(jìn)行評(píng)判[4]。但是，此評(píng)估方法具有一定的主觀性、局限性和未知性[1,3]，所以采用客觀評(píng)估數(shù)據(jù)輔助犬的早期篩選具有重要意義。腸道菌群是許多哺乳動(dòng)物重要的“微生態(tài)器官”，可通過多種途徑影響哺乳動(dòng)物的行為、情緒和認(rèn)知功能[5-6]。本研究通過PCR-DGGE技術(shù)分析導(dǎo)盲犬和淘汰犬之間的差異性腸道菌群，進(jìn)而在動(dòng)物行為學(xué)測(cè)試基礎(chǔ)上為導(dǎo)盲犬的早期篩選提供一種新的輔助手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選擇身體健康、無消化道疾病及其他疾病的導(dǎo)盲犬16只和淘汰犬10只，動(dòng)物均由中國導(dǎo)盲犬大連培訓(xùn)基地提供，所有導(dǎo)盲犬經(jīng)中國導(dǎo)盲犬大連培訓(xùn)基地行為學(xué)測(cè)試并通過，符合《導(dǎo)盲犬》國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 36186—2018)，所有淘汰犬經(jīng)測(cè)試后均不通過，不符合《導(dǎo)盲犬》國家標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑:DNA提取：E.Z.N.A.?Stool DNA kit購于美國Omega公司；PCR體系：2×Easytaq PCR SuperMix(+dye)、引物338F和518R等購于寶生物工程(大連)有限公司；DGGE體系：尿素、丙烯酰胺、N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺、去離子甲酰胺等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3實(shí)驗(yàn)分組：隨機(jī)抽取部分導(dǎo)盲犬(GD，9只)和淘汰犬(ED，4只)分為兩組，并且將全部導(dǎo)盲犬和淘汰犬按照犬的品種和性別進(jìn)一步分為拉布拉多雄性導(dǎo)盲犬(GD-ML，7只)和拉布拉多雄性淘汰犬(ED-ML，6只)，拉布拉多雌性導(dǎo)盲犬(GD-FL，6只)和拉布拉多雌性淘汰犬(ED-FL，2只)，金毛雄性導(dǎo)盲犬(GD-MG，3只)和金毛雄性淘汰犬(ED-MG，2只)。導(dǎo)盲犬和淘汰犬之間進(jìn)行對(duì)比分析，相同品種和性別的導(dǎo)盲犬和淘汰犬之間進(jìn)行對(duì)比分析，共分為4組相互平行的配對(duì)。

1.2 方法

1.2.1樣本收集和DNA提取:收集糞便樣本前一個(gè)月內(nèi)，導(dǎo)盲犬和淘汰犬均統(tǒng)一飼食，犬飼食由中國導(dǎo)盲犬大連培訓(xùn)基地提供。分別收集各組犬新鮮糞便5～10 g，取樣后加入糞便DNA保護(hù)劑，-80 ℃保存。對(duì)各組犬糞便樣本進(jìn)行DNA提取，DNA提取方法按照E.Z.N.A.?Stool DNA kit試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2PCR擴(kuò)增:PCR擴(kuò)增腸道菌群多樣性變化采用16S rDNA基因V3區(qū)特異性序列作為靶標(biāo)進(jìn)行PCR-DGGE分析。引物序列為：上游引物(338F)和下游引物(518R)。反應(yīng)體系總體積為50 μL：內(nèi)含25 μL 2×Easytaq PCR SuperMix(+dye)，1 μL 518R (10 pmol/μL)，1 μL 338F (10 pmol/μL)，3 μL DNA模板，20 μL dddH2O。反應(yīng)條件為：93 ℃預(yù)熱，93 ℃變性5 min，93 ℃ 30 s、54.5 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s進(jìn)行30次循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4℃ 10 min。反應(yīng)完成后通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物并保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3變性梯度凝膠電泳(DGGE):(1)配膠：使用8%聚丙烯酰胺凝膠，25%～55%平行變性梯度。25%變性梯度凝膠由0.4 mL 50×TAE buffer，2 mL去離子甲酰胺，4 mL 40%丙烯酰胺，2.1 g尿素，11.5 mL ddH2O制成；55%變性梯度凝膠由0.4 mL 50×TAE buffer，4.4 mL去離子甲酰胺，4 mL 40%丙烯酰胺，4.62 g尿素，6.55 mL ddH2O制成。(2)灌膠：灌膠前分別向25%低梯度膠和55%高梯度膠中加入80 μL過硫酸銨，混合均勻，再分別加入18 μL四甲基乙二胺，迅速混合，將高、低梯度膠平行勻速推入預(yù)先裝好的玻璃架中，室溫凝固。(3)點(diǎn)樣：微量進(jìn)液器點(diǎn)樣。(4)電泳：于60 ℃恒溫條件下，200 V電壓下，電泳10 min。150 V電壓下，電泳約4 h。(5)染色：溴化乙錠染色8 min，去離子水漂洗。(6)凝膠成像分析：凝膠成像儀成像，image lab軟件進(jìn)行數(shù)字化處理，并進(jìn)行分析，切膠后進(jìn)行回收純化，再送至大連賽拓生物科技有限公司測(cè)序，利用NCBI數(shù)據(jù)庫對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 導(dǎo)盲犬(GD)和淘汰犬(ED)腸道菌群差異

GD和ED糞便菌群PCR-DGGE圖譜如圖1-1所示，同一泳道不同條帶代表不同的腸道菌群，條帶灰度體現(xiàn)了腸道菌群的相對(duì)含量。相似性聚類分析結(jié)果如圖1-2所示，1～4泳道相似度較高，歸為一類，5～13泳道相似度較高，歸為一類，表明GD和ED腸道菌群存在差異。腸道菌群多樣性、豐富度和均勻度分析結(jié)果如表1所示，GD與ED的多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)分別為2.786±0.189和2.641±0.445、17.800±2.859和16.500±6.021、0.9720±0.0114和0.9738±0.0044，且與ED相比，GD多樣性指數(shù)(t=0.7579,P=0.4644)、豐富度指數(shù)(t=0.4770,P=0.6427)和均勻度指數(shù)(t=0.2868,P=0.7796)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如圖1所示，GD中差異性條帶1所代表的菌株相對(duì)含量高于ED，條帶測(cè)序結(jié)果(表2)顯示該菌株為MegamonasfuniformisYIT 11815，則表明與ED相比，GDMegamonasfuniformisYIT 11815菌株增多。

圖1 GD和ED腸道菌群DGGE圖譜分析和相似性聚類分析注：同一泳道不同條帶代表不同的腸道菌群，條帶灰度體現(xiàn)了腸道菌群的相對(duì)含量，紅色箭頭為差異性測(cè)序條帶Fig.1 DGGE analysis and similarity cluster analysis of gut microbiota between GD and EDNote: Different bands in the same lane represent different gut microbiota, the gray scale of the bands reflects the relativecontent of the gut microbiota, and the red arrow represents the differential sequencing band

組別Groups樣本數(shù)Number of samples多樣性指數(shù)Diversity index豐富度指數(shù)Richness index均勻度指數(shù)Evenness indexED 42.641±0.44516.500±6.0210.9738±0.0044GD 92.786±0.18917.800±2.8590.9720±0.0114t檢驗(yàn)Student’s t testt=0.7579P=0.4644t=0.4770P=0.6427t=0.2868P=0.7796ED-ML 63.277±0.11629.143±3.2700.9737±0.0016GD-ML 73.309±0.18630.333±6.0740.9756±0.0027t檢驗(yàn)Student’s t testt=0.3553P=0.7291t=0.4124P=0.6880t=1.4540P=0.1738ED-FL 22.883±0.14519.500±2.5000.9731±0.0068GD-FL 62.786±0.23018.000±4.3200.9735±0.0064t檢驗(yàn)Student’s t testt=0.4870P=0.6435t=0.4033P=0.7007t=0.0720P=0.9449ED-MG 22.283±0.59212.500±6.5000.9603±0.0161GD-MG 32.637±0.09415.700±1.8860.9617±0.0125t檢驗(yàn)Student’s t testt=0.7881P=0.4882t=0.6159P=0.5815t=0.0859P=0.9370

2.2 相同品種及性別的導(dǎo)盲犬和淘汰犬腸道菌群差異

2.2.1拉布拉多雄性導(dǎo)盲犬(GD-ML)和淘汰犬(ED-ML)腸道菌群差異分析:GD-ML和ED-ML糞便菌群PCR-DGGE圖譜如圖2-1所示。相似性聚類分析結(jié)果如圖2-2所示，1和10泳道相似度較高，11和12泳道相似度較高，均單獨(dú)歸為一類；2-6泳道相似度較高，歸為一類；7～9、13泳道相似度較高，歸為一類，表明GD-ML和ED-ML腸道菌群存在差異。腸道菌群多樣性、豐富度和均勻度分析結(jié)果如表1所示，GD-ML與ED-ML的多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)分別為3.309±0.186和3.277±0.116、30.333±6.074和29.143±3.270、0.9756±0.0027和0.9737±0.0016，且與ED-ML相比，GD-ML多樣性指數(shù)(t=0.3553,P=0.7291)、豐富度指數(shù)(t=0.4124,P=0.6880)和均勻度指數(shù)(t=1.4540,P=0.1738)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如圖2-1所示，GD-ML中差異性條帶1、2、3和6所代表的腸道菌株相對(duì)含量高于ED-ML，差異性條帶4和5所代表的腸道菌株相對(duì)含量低于ED-ML，條帶測(cè)序結(jié)果(表2)顯示條帶1～6分別為SuccinatimonashippeiYIT 12066、LactobacillusacidophilusNCFM、LactobacillusvaginalisDSM 5837、PrevotellacopriDSM 18205、CollinsellaaerofaciensATCC 25986、FaecalibacteriumprausnitziiA2-165菌株，則表明相比于ED-ML，GD-MLSuccinatimonashippeiYIT 12066、LactobacillusvaginalisDSM 5837、LactobacillusacidophilusNCFM和FaecalibacteriumprausnitziiA2-165菌株增多，CollinsellaaerofaciensATCC 25986和PrevotellacopriDSM 18205菌株減少。

圖2 GD-ML和ED-ML腸道菌群DGGE圖譜分析和相似性聚類分析Fig.2 DGGE analysis and similarity cluster analysis of gut microbiota between GD-ML and ED-ML

組別Groups條帶編號(hào)Strip number同源菌株名稱Name of homologous strains同源性Identity門類PhylumGD and ED1Megamonas funiformis YIT 1181593%FirmicutesGD-ML and ED-ML1Succinatimonas hippei YIT 1206694%Proteobacteria2Lactobacillus acidophilus NCFM99%Firmicutes3Lactobacillus vaginalis DSM 5837100%Firmicutes4Prevotella copri DSM 1820598%Bacteroidetes5Collinsella aerofaciens ATCC 25986100%Actinobacteria6Faecalibacterium prausnitzii A2-16599%FirmicutesGD-FL and ED-FLaRuminococcus gnavus AGR215492%FirmicutesbFusobacterium russii ATCC 2553390%FusobacteriaGD-MG and ED-MGATropheryma whipplei str. Twist94%Actinobacteria

2.2.2拉布拉多雌性導(dǎo)盲犬(GD-FL)和淘汰犬(ED-FL)、金毛雄性導(dǎo)盲犬(GD-MG)和淘汰犬(ED-MG)腸道菌群差異分析:GD-FL和ED-FL、GD-MG和ED-MG糞便菌群PCR-DGGE圖譜如圖3-1所示。相似性聚類分析結(jié)果如圖3-2所示，12、13泳道各單獨(dú)歸為一類；1～6泳道相似度較高，歸為一類，7～8泳道歸為一類；9～11泳道歸為一類，結(jié)果表明GD-FL和ED-FL、GD-MG和ED-MG腸道菌群存在差異。腸道菌群多樣性、豐富度和均勻度分析結(jié)果如表1所示，GD-FL和ED-FL的多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)分別為2.786±0.230和2.883±0.145、 18.000±4.320和19.500±2.500、0.9735±0.0064和0.9731±0.0068，且與ED-FL相比，GD-FL多樣性指數(shù)(t=0.4870,P=0.6435)、豐富度指數(shù)(t=0.4033,P=0.7007)和均勻度指數(shù)(t=0.0720,P=0.9449)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GD-MG和ED-MG的多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)分別為2.637±0.094和2.283±0.592、15.700±1.886和12.500±6.500、0.9617±0.0125和0.9603±0.0161，且與ED-MG相比，GD-MG多樣性指數(shù)(t=0.7881,P=0.4882)、豐富度指數(shù)(t=0.6159,P=0.5815)和均勻度指數(shù)(t=0.0859,P=0.9370)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如圖3-1所示，GD-FL中差異性條帶a和b所代表的腸道菌株相對(duì)含量低于ED-FL，GD-MG中差異性條帶A所代表的腸道菌株相對(duì)含量高于ED-MG，條帶測(cè)序結(jié)果(表2)顯示條帶a、b和A分別為RuminococcusgnavusAGR2154、FusobacteriumrussiiATCC 25533和Tropherymawhippleistr. Twist菌株，則表明與ED-FL相比，GD-FLRuminococcusgnavusAGR2154、FusobacteriumrussiiATCC 25533菌株減少；與ED-MG相比，GD-MGTropherymawhippleistr. Twist菌株增加。

圖3 GD-FL和ED-FL、GD-MG和ED-MG腸道菌群DGGE圖譜分析和相似性聚類分析Fig.3 DGGE analysis and similarity cluster analysis of gut microbiota between GD-FL and ED-FL, GD-MG and ED-MG

3 討論

3.1 結(jié)果分析

已有研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群與哺乳動(dòng)物的行為、情緒和認(rèn)知功能密切相關(guān)，可直接調(diào)控其中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，例如，大腸桿菌(Escherichiacoli)可損害小鼠的學(xué)習(xí)能力并導(dǎo)致記憶障礙，而約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)可減輕2,4,6-三硝基苯磺酸處理小鼠的結(jié)腸炎和記憶障礙癥狀[7]；Crumeyrolle-Arias等研究發(fā)現(xiàn)無菌大鼠相比于SPF(Specific pathogen Free)大鼠具有更多焦慮樣行為[8]。因此，導(dǎo)盲犬的腸道菌群可能與犬的行為和情緒等氣質(zhì)特征密切相關(guān)，有利于輔助導(dǎo)盲犬的早期篩選。

本研究應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)分別分析GD和ED以及相同品種和性別導(dǎo)盲犬和淘汰犬腸道菌群差異。相似性聚類分析結(jié)果顯示，GD和ED各分為一類(圖1-2)；GD-ML和ED-ML各分為一類(圖2-2)，1和10泳道相似度較高，單獨(dú)歸為一類，但是兩者為不同組別，可能是由于個(gè)體差異造成的影響；GD-FL、ED-FL和GD-MG各歸為一類(圖3-2)，12、13泳道各單獨(dú)歸為一類，可能存在個(gè)體差異，7～8和9～11泳道歸為同一大類，但兩組為不同犬種，可能是由于犬品種及性別的不同所造成的影響。腸道菌群多樣性、豐富度和均勻度分析結(jié)果顯示，每兩個(gè)配對(duì)組之間多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。差異性條帶測(cè)序分析結(jié)果顯示，與ED相比，GD中Firmicutes門的MegamonasfuniformisYIT 11815菌株增多；與ED-ML相比，GD-ML中Proteobacteria門的SuccinatimonashippeiYIT 12066、Firmicutes門的LactobacillusacidophilusNCFM、LactobacillusvaginalisDSM 5837和FaecalibacteriumprausnitziiA2-165菌株增多，Actinobacteria門的CollinsellaaerofaciensATCC 25986、Bacteroidetes門的PrevotellacopriDSM 18205菌株減少；與ED-FL相比，GD-FL中Firmicutes門的RuminococcusgnavusAGR2154、Fusobacteria門的FusobacteriumrussiiATCC 25533菌株減少；與ED-MG相比，GD-MG中Actinobacteria門的Tropherymawhippleistr. Twist菌株增多。

3.2 展望與意義

3.2.1腸道菌群調(diào)節(jié)犬行為、情緒和認(rèn)知功能的可能途徑:腸道菌群可通過多種途徑影響哺乳動(dòng)物的行為、情緒和認(rèn)知功能，腦-腸軸是其中重要的作用途徑之一。腦-腸軸是大腦和胃腸道之間緊密連接的雙向通路，在調(diào)節(jié)機(jī)體行為反應(yīng)、認(rèn)知功能等方面起到了重要作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群可調(diào)節(jié)5-羥色胺(5-HT)[9]、多巴胺(DA)[10-11]、γ-氨基丁酸(GABA)[12]等多種神經(jīng)遞質(zhì)的合成和代謝活動(dòng)，從而參與調(diào)控和影響宿主的行為和功能；免疫途徑[13]、短鏈脂肪酸(SCFAs)代謝途徑[14]等也可能是腸道菌群參與調(diào)節(jié)的作用途徑。

已有研究從神經(jīng)遞質(zhì)途徑、免疫途徑、SCFAs代謝途徑等腦-腸軸的角度闡述了本導(dǎo)盲犬和淘汰犬之間部分差異菌株的功能和作用。自閉癥譜系障礙(Autism spectrum disorder，ASD)是一種以社交和認(rèn)知功能缺陷為特征的神經(jīng)疾病，目前認(rèn)為腸道菌群與腦-腸軸的相互作用是ASD發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要因素[15]，已有研究發(fā)現(xiàn)相比于正常兒童，ASD兒童糞便中Prevotellacopri和Feacalibacteriumprausnitzii菌屬相對(duì)豐度減少，且ASD兒童糞便中GABA濃度較低[16]。有趣的是，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相比于ED-ML，GD-ML中Prevotellacopri菌屬豐度減少而Feacalibacteriumprausnitzii菌屬豐度增多，因此這兩種菌屬是否可能通過腦-腸軸神經(jīng)遞質(zhì)途徑影響犬的行為、情緒和認(rèn)知功能有待于進(jìn)一步研究。LactobacillusacidophilusNCFM菌株是一種益生菌，研究表明該菌可刺激腸上皮細(xì)胞系中細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生[17]；FaecalibacteriumprausnitziiA2-165菌株對(duì)人類和小鼠樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生IL-10具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)能力，并能夠調(diào)節(jié)T細(xì)胞反應(yīng)[18]；另有研究發(fā)現(xiàn)Ruminococcusgnavus菌屬同樣具有對(duì)多種免疫因子的調(diào)節(jié)作用[19-20]，本研究結(jié)果表明相比于ED-ML，GD-ML中LactobacillusacidophilusNCFM、FaecalibacteriumprausnitziiA2-165菌株豐度增多，與ED-FL相比，GD-FL中RuminococcusgnavusAGR2154菌株減少，因此這些差異菌株可能通過腦-腸軸免疫途徑產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。廣泛性焦慮癥(generalized anxiety disorder，GAD)與GABA、5-HT和去甲腎上腺素(NE)等多種神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)有關(guān)[21]，研究發(fā)現(xiàn)GAD患者腸道菌群豐富度和多樣性顯著降低，而Ruminococcusgnavus等產(chǎn)SCFAs細(xì)菌過度增多，經(jīng)抗抑郁藥物治療后GAD患者癥狀有所改善，但腸道菌群失調(diào)并未好轉(zhuǎn)或恢復(fù)[22]，本研究結(jié)果表明與ED-FL相比，GD-FL中RuminococcusgnavusAGR2154菌株豐度減少，則該菌也可能通過SCFAs代謝途徑影響犬的情緒和認(rèn)知功能。除此之外，與ED相比，GD中MegamonasfuniformisYIT 11815菌株增多，與ED-ML相比，GD-ML中SuccinatimonashippeiYIT 12066和LactobacillusvaginalisDSM 5837菌株增多，CollinsellaaerofaciensATCC 25986菌株減少；與ED-FL相比，GD-FL中FusobacteriumrussiiATCC 25533菌株減少；與ED-MG相比，GD-MG中Actinobacteria門的Tropherymawhippleistr. Twist菌株增多，目前還沒有相應(yīng)的研究闡明上述差異菌群在腦-腸軸方面的功能和作用。腸道菌群與腦-腸軸存在廣泛而深刻的聯(lián)系，因此，研究導(dǎo)盲犬的特征性優(yōu)勢(shì)菌群與神經(jīng)遞質(zhì)和其他代謝產(chǎn)物之間的聯(lián)系有助于探索腸道菌群的可能作用機(jī)制。

3.2.2腸道菌群調(diào)節(jié)幼犬的氣質(zhì)類型：廣泛的實(shí)驗(yàn)研究和臨床實(shí)踐證明益生菌和益生元治療在改善哺乳動(dòng)物焦慮、抑郁等異常行為和情緒方面具有明顯的積極作用[23-24]，例如，Gareau等發(fā)現(xiàn)服用乳酸菌能夠明顯改善由母子分離刺激導(dǎo)致的大鼠應(yīng)激反應(yīng)[25]。因此，益生菌和益生元用于幼犬的早期發(fā)育階段可能改善其腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成，促使幼犬的氣質(zhì)類型朝向有利于導(dǎo)盲犬篩選的預(yù)期方向發(fā)展。

3.3 不足之處

本研究首次就導(dǎo)盲犬和淘汰犬腸道菌群的差異進(jìn)行分析和研究，但仍存在以下幾點(diǎn)不足之處：①目前尚未闡明兩者差異菌群的具體功能以及作用機(jī)制和途徑，仍有待于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步研究；②由于部分組別犬?dāng)?shù)量有限，實(shí)驗(yàn)結(jié)果無疑會(huì)受到個(gè)體差異的影響；③本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的PCR-DGGE技術(shù)只能作定性分析，存在一定的主觀性和局限性，而腸道菌群的高通量測(cè)序技術(shù)是目前用于腸道微生物研究最前沿、最常見的檢測(cè)技術(shù)[26]，利用高通量測(cè)序技術(shù)有助于發(fā)現(xiàn)豐度較低的微生物或未知微生物，可全面、準(zhǔn)確地獲取腸道菌群的定量化信息[27]；④腸源細(xì)菌物質(zhì)可能是調(diào)節(jié)腦-腸軸的關(guān)鍵，以代謝組學(xué)結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)探索可能機(jī)制是更好的選擇。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)盲犬和淘汰犬腸道菌群存在差異，有文獻(xiàn)表明兩者特征性的差異菌群可通過腦-腸軸影響宿主的行為、情緒和認(rèn)知功能。但限于當(dāng)前研究水平，本研究尚未對(duì)兩者差異菌群的功能及作用途徑展開深入研究。值得肯定的是，對(duì)腸道菌群的深入分析可能會(huì)成為導(dǎo)盲犬早期篩選的有效補(bǔ)充手段，有助于縮短培訓(xùn)周期，節(jié)約培訓(xùn)成本。