張潔宏 覃輝艷 李 彬 楊 慧 王 芳 陳華鳳

(廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心，南寧 530028)

食蟹猴又稱(chēng)長(zhǎng)尾猴，屬于猴科，獼猴亞科，獼猴屬，食蟹猴種，因其喜歡在退潮后到海邊覓食螃蟹及貝類(lèi)而得名，主要分布在亞洲東南部老撾、越南、印度尼西亞、馬來(lái)西亞等國(guó)家地區(qū)，國(guó)內(nèi)主要為人工飼養(yǎng)種群。因其體型較小，適應(yīng)性強(qiáng)，容易馴養(yǎng)繁殖，在生物進(jìn)化上與人類(lèi)的遺傳物質(zhì)有98.5%的同源性，組織結(jié)構(gòu)，生理代謝等與人類(lèi)較接近，在生物學(xué)、心理學(xué)、醫(yī)學(xué)等多種生命科學(xué)研究中有著其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)法替代的重要地位[1]。特別是在心腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、生殖系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、艾滋病、結(jié)核等惡性傳染病、器官移植等研究中食蟹猴有著極高的應(yīng)用價(jià)值[2-3]。目前，食蟹猴已成為生命科學(xué)研究最常用的大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，我國(guó)也是全世界作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和出口食蟹猴最多的國(guó)家，檢測(cè)食蟹猴遺傳質(zhì)量，建立遺傳背景清楚的食蟹猴種群，提供標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)食蟹猴，將有力保障研究結(jié)果的準(zhǔn)確性、科學(xué)性和有效性。但目前我國(guó)食蟹猴遺傳背景研究較少。因此，本研究應(yīng)用20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)廣西食蟹猴進(jìn)行遺傳檢測(cè)，探討廣西食蟹猴的遺傳背景，并為建立廣西食蟹猴遺傳質(zhì)量檢測(cè)方法和種群資源庫(kù)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取廣西3家最大最具有代表性的食蟹猴養(yǎng)殖公司(以下分別簡(jiǎn)稱(chēng)為F、N和W)進(jìn)行無(wú)關(guān)個(gè)體隨機(jī)采樣，共采樣成年食蟹猴30只，每個(gè)公司各10只，雌雄各半，年齡為3～4歲，體質(zhì)量為3～4 kg，F(xiàn)、N和W 3家食蟹猴養(yǎng)殖公司目前的種猴數(shù)量均為4千只左右，總存欄猴數(shù)量均為1～1.2萬(wàn)只，為避免選擇的個(gè)體相互間存在父子、母子、同胞關(guān)系，本研究根據(jù)養(yǎng)殖公司給定的記錄譜系，從育成待發(fā)猴群的不同欄舍進(jìn)行無(wú)關(guān)個(gè)體隨機(jī)抽樣，空腹自上肢靜脈抽取全血2 mL，EDTA抗凝。

1.2 主要儀器與試劑

儀器：Sigma高速冷凍離心機(jī)、Bio-Rad電泳儀、UVP GelDoc-It2凝膠成像分析儀、ABI梯度PCR儀、ABI 3730XL測(cè)序儀等。

試劑：Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit核酸提取試劑盒、Takara Premix Ex TaqTMHot Start Version PCR反應(yīng)試劑盒等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1核酸樣品制備：全血樣品使用Qiagen公司貨號(hào)為69504的試劑盒DNeasy Blood & Tissue Kit(50)提取核酸。核酸提取后采用ND-1000 紫外分光光度計(jì)分析提取核酸的純度和濃度。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA樣品是否含有主帶。

1.3.2微衛(wèi)星位點(diǎn)選取與引物合成：根據(jù)文獻(xiàn)[1，4-8]和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的信息，選擇等位基因數(shù)、多態(tài)性含量豐富、盡可能分布于多條不同染色體的20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，其中位點(diǎn)D1S533、D10S611、D2S146、D3S1768、D3S3045、D4S1645、D5S1466、D6S311、D8S1106、D9S934、D11S1352、D12S67、D13S797、D15S644、D18S536、DXS6810選取于文獻(xiàn)1～6，位點(diǎn)D12S375、D16S409、D17S800、D22S419選取于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)序列均在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)查找。各位點(diǎn)引物使用FAM標(biāo)記，由華大基因合成。引物編號(hào)和序列見(jiàn)表1。

1.3.3PCR反應(yīng)：PCR反應(yīng)體系為：Premix Ex Taq Hot Start Version 10 μL、模板1 μL、10 μmol/L正向引物0.5 μL、10 μmol/L反向引物0.5 μL、無(wú)酶水補(bǔ)足至20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min、94 ℃變性30 s，最佳退火溫度(見(jiàn)表1)30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次，72 ℃保持10 min。

1.3.5毛細(xì)管電泳：將甲酰胺與分子量?jī)?nèi)標(biāo)按100∶1 的體積比混勻后，取9 μL加入上樣板中，再加入1 μL稀釋10 倍的PCR產(chǎn)物，使用ABI 3730XL 測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳。利用Genemarker 中的Fragment(Plant)片段分析軟件對(duì)測(cè)序儀得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將各泳道內(nèi)分子量?jī)?nèi)標(biāo)的位置與各樣品峰值的位置做比較分析，得到片段大小。

表1 20 個(gè)食蟹猴微衛(wèi)星位點(diǎn)的擴(kuò)增條件和染色體分布Table 1 Amplifying condition and chromosomedistribution of 20 microsatellite DNAloci in Macaca fascicularis

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用POPGENE32和NTSYS軟件對(duì)樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析。計(jì)算各引物的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀測(cè)雜合度、期望雜合度、香隆信息指數(shù)、Nei’s基因多樣度以及多態(tài)信息含量等群體內(nèi)的遺傳變異和遺傳距離、遺傳相似系數(shù)、F-統(tǒng)計(jì)量、基因流等群體間遺傳關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)片段大小

30個(gè)樣品20個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)毛細(xì)管電泳片段大小范圍見(jiàn)表2。

2.2 群體遺傳多態(tài)性分析

由表3可見(jiàn)，30個(gè)樣本共檢測(cè)到等位基因237個(gè)，其觀察等位基因數(shù)Na為5～19個(gè)，平均為11.85個(gè)，其中最多的位點(diǎn)是D12S67，高達(dá)19個(gè)，最少的位點(diǎn)是D18S536，有5個(gè)等位基因。有效等位基因數(shù)Ne為3.2374～12.3288個(gè)，平均為6.9473個(gè)；觀察雜合度Ho為0.3～1，平均為0.7833，期望雜合度He為0.8508～0.9345，平均為0.85，平均期望雜合度He 略高于平均觀察雜合度Ho；Nei’s基因多樣度H為0.6911～0.9189，平均為0.8358；香隆信息指數(shù)I為1.3914～2.7085，平均為2.0954；多態(tài)信息含量PIC為0.6609～0.9135，平均為0.817，均大于0.5；表明廣西食蟹猴總?cè)后w在微衛(wèi)星水平上表現(xiàn)出較高的遺傳多態(tài)性。分別對(duì)3個(gè)群體進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析(見(jiàn)表4)，3個(gè)群體(F、N和W)分別檢測(cè)到等位基因158、158和173個(gè)，平均期望雜合度He分別為0.8371、0.8318和0.8642；平均多態(tài)信息含量PIC分別為0.7692、0.7653和0.8001，3個(gè)群體亦存在較高的遺傳多態(tài)性。

表2 20個(gè)微衛(wèi)星DNA檢測(cè)位點(diǎn)片段大小Table 2 DNA fragment size of 20 microsatellite DNA loci

表3 30個(gè)樣品20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)遺傳多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果Table 3 Genetic polymorphism measured at 20 microsatellite loci in 30 samples

表4 3個(gè)群體遺傳多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果Table 4 Genetic polymorphism in 3 groups

2.3 Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)

Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)結(jié)果表明(見(jiàn)表5)，多數(shù)位點(diǎn)處于H-W平衡，只有F群體在位點(diǎn)D6S311、DXS6810上，N群體在位點(diǎn)D13S797、DXS6810上，W群體在位點(diǎn)D1S533、D9S934、D22S419上存在不平衡，P<0.05。

表5 Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)結(jié)果Table 5 Result of Hardy-Weinberg equilibrium

2.4 遺傳距離和遺傳相似系數(shù)

表6星號(hào)上方是遺傳相似系數(shù)，下方是遺傳距離。由表6可見(jiàn)，3個(gè)群體遺傳距離變化范圍為0.2556～0.3223，遺傳相似度范圍為72.45%～77.45%。

表6 Nei’s遺傳距離和遺傳相似系數(shù)檢測(cè)結(jié)果Table 6 Nei’s unbiased measures of geneticdistance and genetic identity

2.5 聚類(lèi)分析

利用Nei’s遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)分析，得到2大類(lèi)，結(jié)果見(jiàn)圖1。F群體和N群體先聚為一類(lèi)，再和W群體聚為一類(lèi)。

圖1 基于Nei’s遺傳距離的UPGMA聚類(lèi)圖Fig.1 UPGMA dendrogram based onNei’s genetic distance

2.6 F-統(tǒng)計(jì)量和基因流

由表7可見(jiàn)，F(xiàn)is均值為0.0235，F(xiàn)it均值為0.0628，表明群體受近親交配和人工選擇影響小。Fst均值為0.0402，Nm均值為5.9616，表明群體間遺傳分化小。

表7 F-統(tǒng)計(jì)量和基因流檢測(cè)結(jié)果Table 7 Result of F-statistics and gene flow

3 討論

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量檢測(cè)是評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的一個(gè)重要手段，其目的是為了確定被檢動(dòng)物是否符合該品系或種群的生物學(xué)特性以及檢測(cè)該種群動(dòng)物的近交程度等。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)遺傳標(biāo)記研究主要集中在DNA分子水平上。微衛(wèi)星是由2～6個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)片段構(gòu)成的DNA序列，因其具有分布廣泛、多態(tài)性豐富、易于檢測(cè)、結(jié)果穩(wěn)定可靠等特點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于親緣關(guān)系鑒定、人類(lèi)疾病診斷、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量檢測(cè)、生物群體遺傳多樣性遺傳結(jié)構(gòu)與物種資源保護(hù)等多領(lǐng)域[9]。2007年Kikuchi 等[10]從人類(lèi)基因庫(kù)中選取148個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)首次研究報(bào)道了食蟹猴的微衛(wèi)星標(biāo)記。近年來(lái)，Nikzad等[11]應(yīng)用18個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)評(píng)估了馬來(lái)西亞6個(gè)島嶼野生食蟹猴的遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示總?cè)后w平均觀察雜合度為0.497，平均期望雜合度為0.803，Sunggala和Penang島食蟹猴群體具有較高的遺傳多樣性，馬來(lái)西亞食蟹猴遺傳距離和地理位置之間沒(méi)有較大關(guān)聯(lián)。Smith等[12]應(yīng)用15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)比較分析了菲律賓食蟹猴與印度尼西亞、新加坡、毛里求斯、柬埔寨食蟹猴的遺傳特性，菲律賓、毛里求斯食蟹猴遺傳多樣性較印度尼西亞、新加坡和柬埔寨低，群體間存在較大遺傳分化。國(guó)內(nèi)李瑞生等[1]、劉歡[8]分別應(yīng)用20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)、18個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)有效分析了國(guó)內(nèi)食蟹猴群體的遺傳多樣性，國(guó)內(nèi)飼養(yǎng)食蟹猴的遺傳多樣性較高于東南亞地區(qū)。

本研究采用20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)探討廣西食蟹猴的遺傳質(zhì)量，多個(gè)基因位點(diǎn)的遺傳參數(shù)平均值是衡量群體遺傳變異大小和群體遺傳多樣性常用的指標(biāo)，其中多態(tài)信息含量PIC是反應(yīng)微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性的理想指標(biāo)，當(dāng)PIC>0.5時(shí)，微衛(wèi)星位點(diǎn)具有高度多態(tài)性。雜合度是衡量群體內(nèi)遺傳變異最直接和最有效的指標(biāo)，其值越高群體的遺傳多樣性越豐富[13]。本研究結(jié)果顯示20個(gè)微衛(wèi)星多態(tài)信息含量PIC均大于0.5，為0.6609～0.9135，平均為0.817，表明20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均為高多態(tài)性位點(diǎn)，能較好地反應(yīng)廣西食蟹猴的遺傳多樣性，與文獻(xiàn)[1,4-8]報(bào)道的微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性相同。30個(gè)樣品20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)觀察等位基因數(shù)Na為5～19個(gè)，平均觀察等位基因數(shù)Na為11.85個(gè)，平均有效等位基因數(shù)Ne為6.9473個(gè)，亦與文獻(xiàn)[1,4-8]檢測(cè)到的觀察等位基因數(shù)大致相同?？?cè)后w平均觀察雜合度Ho為0.7833，平均期望雜合度He為0.85，且Nei’s基因多樣度H和香隆信息指數(shù)I均較高，表明廣西食蟹猴猴群等位基因數(shù)多、雜合度大，遺傳多樣性豐富。分別對(duì)3個(gè)生產(chǎn)群(F、N和W)進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，3個(gè)生產(chǎn)群雜合度H、多態(tài)信息含量PIC、Nei’s基因多樣度H和香隆信息指數(shù)I均較高，表明3個(gè)生產(chǎn)群亦存在較高的遺傳多態(tài)性。3個(gè)群體平均觀察雜合度接近平均期望雜合度，Hardy—Weinberg平衡檢測(cè)每個(gè)生產(chǎn)群在2～3個(gè)位點(diǎn)處于不平衡外，多數(shù)位點(diǎn)處于H-W平衡， F—統(tǒng)計(jì)量Fis均值和Fit均值均較低，表明各群體受人工選擇和近親交配影響小，基本處于隨機(jī)交配狀態(tài)，3家養(yǎng)殖公司開(kāi)展的遺傳繁育方式較合理。種群的基因多樣性與群體來(lái)源的復(fù)雜程度、群體大小及繁育方式有著直接的關(guān)聯(lián)，廣西F、N和W 3家食蟹猴養(yǎng)殖公司食蟹猴基本以來(lái)源于越南、柬埔寨、緬甸和老撾等多個(gè)國(guó)家的野生群體為主，經(jīng)過(guò)多次引種和本場(chǎng)育種形成，引種來(lái)源覆蓋面廣，且時(shí)間跨度大，存欄數(shù)量大，開(kāi)展的遺傳繁育方式較合理，故本次檢測(cè)廣西食蟹猴雜合度較高。皮道元等[14]采用11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)分析了廣西引種回來(lái)的柬埔寨、越南和老撾食蟹猴群體的遺傳多樣性，共檢測(cè)到平均等位基因數(shù)Na為11.82個(gè)，平均有效等位基因8.15個(gè)，總?cè)后w期望雜合度為0.8562。劉歡[8]采用18個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)我國(guó)廣東、廣西、云南和海南4省飼養(yǎng)的食蟹猴進(jìn)行遺傳多樣性分析亦顯示，廣西群體平均觀察雜合度分別為0.6546、0.6299、0.6948，平均期望雜合度分別為0.8390、0.8135、0.8326，與本研究雜合度相似。李瑞生等[1]的研究結(jié)果亦表明食蟹猴個(gè)體間均呈現(xiàn)高度的多態(tài)性，基因多樣性為0.7832～0.8801，香隆信息指數(shù)為1.5651～2.1592，且雌雄個(gè)體間無(wú)差異。

對(duì)3個(gè)生產(chǎn)群的群體間遺傳關(guān)系分析可見(jiàn)，群體間的遺傳分化系數(shù)Fst均值為0.0402，依據(jù)Wright[15]建議，當(dāng)Fst在0～0.05之間說(shuō)明種群間遺傳分化很小，0.05～0.15之間中等遺傳分化，0.15～0.25之間遺傳分化大，大于0.25遺傳分化極大。本研究3個(gè)生產(chǎn)群間的遺傳分化很小，平均95.98%的遺傳變異存在于群體之內(nèi)，只有4.02%的遺傳變異存在于群體之間，群體內(nèi)的遺傳變異是主要的變異來(lái)源。群體間的遺傳分化水平與基因流密切相關(guān)，Wright認(rèn)為若基因流Nm<1，有限的基因流是促使群體發(fā)生遺傳分化的主要原因，若Nm>1，基因流能防止不同地區(qū)亞群體間發(fā)生遺傳分化[16]。本研究Nm均值為5.9616，群體間基因流動(dòng)較頻繁，可防止群體間產(chǎn)生遺傳分化。對(duì)3個(gè)生產(chǎn)群的遺傳距離和親緣關(guān)系分析亦可見(jiàn)，3個(gè)群體的遺傳距離較小，親緣關(guān)系較近，F(xiàn)群體和N群體遺傳距離最近，為0.2556，遺傳相似度最高，達(dá)77.45%，N群體和W群體的遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.3223，遺傳相似度為72.45%。聚類(lèi)分析也顯示，F(xiàn)群體和N群體先聚為一類(lèi)，再和W群體聚為一類(lèi)，符合3個(gè)繁殖猴場(chǎng)各自關(guān)聯(lián)引種歷史特征。劉歡[6]對(duì)國(guó)內(nèi)廣西等4省籠養(yǎng)的食蟹猴進(jìn)行遺傳多樣性研究，結(jié)果亦表明廣西群體遺傳距離為0.2126～0.3571，遺傳相似度為69.97%～80.85%，與本研究相似。

本研究運(yùn)用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù)有效分析了廣西食蟹猴的遺傳多態(tài)性和群體間的遺傳關(guān)系，為今后建立廣西食蟹猴遺傳背景資源庫(kù)，指導(dǎo)食蟹猴的生產(chǎn)繁殖，建立遺傳背景清楚的食蟹猴種群提供了理論依據(jù)。同時(shí)也為在廣西建立食蟹猴微衛(wèi)星DNA遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)奠定了基礎(chǔ)。