高琛琛 薛曉偉 劉玥宏 李利生 徐敬東

(1. 首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學與病理生理學系, 北京 100069)(2. 北京協(xié)和醫(yī)院病理科,北京 100005)(3.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院,北京 100054)(4.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院機能實驗中心，北京 100069)

組織學評價和免疫組織化學特征在生理學研究中非常重要，因而在保持組織標本完整性和緊密性的基礎上選擇適當?shù)墓潭ǚ椒ê荜P鍵。常用的組織固定液有卡諾液，Susa液，Helly干液，4%多聚甲醛，Bouin液等[1]。研究表明，結腸杯狀細胞內含有大量的黏液顆粒，內含黏蛋白分泌入腸腔，并在黏膜表層形成一層致密黏液層，作為腸道重要黏膜屏障之一，與其它細胞及不同機制共同參與維持腸道穩(wěn)態(tài)[2]?；诖?，本實驗通過對大鼠結腸杯狀細胞的數(shù)量、著色度的觀察與分析來對比不同標本分別用卡諾液與甲醛固定液對黏液固定和著色度的區(qū)別。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

正常SD大鼠與便秘模型大鼠，6周齡，體質量220～250 g，SPF級，購于首都醫(yī)科大學實驗動物中心,實驗動物許可證號:SCXK(京)2016-0001。

1.2 主要試劑

卡諾液，甲醛固定液，HE染液，高碘酸希爾法阿爾新藍染液。

1.3 便秘模型大鼠的制備

在常規(guī)飲食、環(huán)境、周齡等其他條件相同的基礎上，將用于模型制備的大鼠以地酚諾酯(長春長紅制藥有限公司，國藥準字H22022037)70 mg/kg體質量的濃度溶于1 mL生理鹽水，灌胃，每日1次，持續(xù)2周，致使其出現(xiàn)大便秘結，糞便數(shù)量減少，含水量減少等便秘癥狀。

1.4 大鼠結腸標本的制作

將大鼠麻醉后取結腸組織，立即投入固定液，分別用卡諾液與甲醛固定液處理后通過脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟得到組織蠟塊，經(jīng)修整切片(4 μm)后，分別用HE染液、高碘酸希爾法阿爾新藍染液染色固封得到結腸石蠟切片標本，使用NikonDS-U3觀察結腸杯狀細胞和黏液細胞的形態(tài)學；取結腸放入質量分數(shù)為2.5%的戊二醛(pH7.2)中固定5 min后取出組織，切成1 mm3組織塊繼續(xù)固定。常規(guī)乙醇脫水，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片(50 nm)，醋酸雙氧鈾硝酸鉛染色，透射電鏡(Hitachi，HT7700 日本)觀察結腸杯狀細胞和黏液細胞的超微結構并拍片。

1.5 結腸組織標本的觀察與杯狀細胞指標統(tǒng)計

1.5.1杯狀細胞的形態(tài)學觀察：通過Nikon DS-U3顯微鏡分別以×20、×100視野觀察正常大鼠與便秘模型大鼠的結腸標本，并對比兩種固定方法和染色技術處理后杯狀細胞形態(tài)和杯狀細胞內黏液顆粒及黏蛋白的分泌情況。通過電鏡進一步觀察結腸黏液層的結構特點。

1.5.2統(tǒng)計指標的統(tǒng)計：用NIS-Elemets BR4.10軟件，通過顏色強度設定統(tǒng)計8個不同視野下杯狀細胞的數(shù)量和著色度，所有結果均使用prism6.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準誤(Mean±SEM)，P<0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 杯狀細胞的形態(tài)學觀察

光鏡下，高碘酸希爾法阿爾新藍染液染色結腸標本上皮組織中充滿大量杯狀細胞，邊界清晰，胞內布滿紅染的黏液顆粒，亦可見被噴向腸腔的黏液(見圖1，A1、A2和B1、B2)；用卡諾液固定、高碘酸希爾法阿爾新藍染液染色的標本杯狀細胞著色度明顯強于甲醛固定液處理標本的杯狀細胞(見圖1，B1、B2和C1、C2)；甲醛固定液處理、HE染色標本的杯狀細胞成空泡狀，胞核被染成深藍色，位于細胞底部，(見圖1，D1、D2)。電鏡下，便秘模型大鼠相比于正常大鼠，結腸黏膜表層黏液層變薄，分子篩樣[3]作用減弱，細菌易位，接近甚至直接接觸腸道黏膜上皮細胞，提示便秘模型的結腸黏液層與正常相比變薄且不完整(見圖2，A、B)。

2.2 杯狀細胞數(shù)量及著色度的比較

高碘酸希爾法阿爾新藍染色標本中，如圖3，4和表1所示，與正常大鼠相比，便秘模型大鼠的杯狀細胞數(shù)量減少13.81%(P<0.05,見圖3A)，而其著色度顯著性增強(P<0.001,見圖3B)。便秘模型大鼠結腸標本中，卡諾液處理與甲醛固定液處理的標本相比，杯狀細胞數(shù)量無顯著性差異(P>0.05,見圖4A)，但著色度明顯增強(P<0.05,見圖4B)。結果提示，卡諾液處理與甲醛固定液處理的正常大鼠結腸標本的杯狀細胞數(shù)量及著色度對比結果無顯著性差異，而便秘模型組杯狀細胞數(shù)量無顯著性差異，但是著色度有顯著性差異。

表1 正常與便秘模型大鼠結腸杯狀細胞數(shù)量和著色度比較Table 1 Comparison of the number and color intensity of normal and constipation models colon goblet cells

注：與正常組比較，*P<0.05，***P<0.001.與甲醛固定液處理組比較，**P<0.01

Note：compared with the control group，*P<0.05，***P<0.001.Compared with the formaldehyde fixative fixed group，**P<0.01

圖3 正常與便秘模型大鼠結腸杯狀細胞的特征比較注：A.結腸陷窩內含有杯狀細胞的數(shù)量對比；B.杯狀細胞著色度的對比。與正常組比較，* P<0.05，***P<0.001.Fig.3 Comparison of the characteristic of colon goblet cells of normal and model rats Note：A. Comparison of the number of goblet cells along colonic depth. B. Comparison of percent of color intensity in goblet cells.Compared with the control group，*P<0.05，***P<0.001.

圖4 不同固定液處理的組織杯狀細胞特性比較注：A.杯狀細胞數(shù)量的對比；B.杯狀細胞著色度的對比,與正常組比較，**P<0.01.Fig.4 Comparison of the characteristic of colon goblet cells treated with different fixative Note:A. Comparison of the number of goblet cells. B. Comparison of the percent of color intensity in goblet cells.Compared with the control group，**P<0.01.

3 討論

腸黏膜與免疫屏障、腸道共生菌群、營養(yǎng)和代謝產(chǎn)物等相互作用共同維持腸道穩(wěn)態(tài)[4]。由腸道杯狀細胞分泌的黏蛋白是腸道固有免疫第一防線黏液層的主要組成部分[5]，其中由杯狀細胞分泌的黏蛋白和一些其他活性物質構成的腸道黏液層，為腸道抵御內源或外源性的刺激和微生物的侵襲提供了保障[6]，并有助于維持腸道共生菌群的平衡[7]。因此，杯狀細胞是維持腸道健康必不可少的保護者。研究表明[8]，杯狀細胞黏液必須伴隨水分的擴散分泌入腸腔，本實驗用以制備便秘模型大鼠的地芬諾酯，可以阻滯腸黏膜上的水通道，消除腸黏膜的蠕動反射而減弱腸蠕動，并使腸內容物通過延遲，腸腔內水分的吸收增加，腸道內的水分減少，所以，便秘模型大鼠結腸杯狀細胞與正常大鼠相比，不僅數(shù)量減少，而且黏液分泌減少，胞內黏液顆粒密度增高，著色度加深，結腸黏液層厚度變薄，容易引起細菌易位(如圖2所示)。由此可見，杯狀細胞分泌的黏蛋白對于維持腸道穩(wěn)態(tài)不可或缺。另有研究表明[9]，結腸腸道杯狀細胞分泌的黏蛋白主要為MUC2黏蛋白，實質為高度糖基化的糖蛋白，具有水溶性，這可能就是因為用4%多聚甲醛處理標本，致使表層黏液蛋白溶解其中，導致組織標本中的黏蛋白含量降低，使其著色度降低；而卡諾液是由無水乙醇：氯仿：冰醋酸(6∶3∶1)組成，其不含蒸餾水[1]，可以完整地保存了標本杯狀細胞及結腸黏液層中黏液蛋白含量，因而能夠看到黏膜表面紅染的黏液層。因此，在杯狀細胞的形態(tài)學及黏液分泌的觀察中，用卡諾液處理標本優(yōu)于甲醛固定液。

綜上所述，本實驗通過對杯狀細胞形態(tài)學觀察以及數(shù)量與著色度的統(tǒng)計，結果提示卡諾液與甲醛固定液處理標本的差異性。從而應該注意的是，在不同實驗，不同標本的制備中，對于固定液的選擇應根據(jù)實驗研究對象的特性而確定，同時，不可忽視應用不同固定劑處理標本，實驗得到的數(shù)據(jù)可能有差異性。因此，要觀察結腸黏液分泌的標本時，相較于甲醛固定、HE染色方法，卡諾液固定、高碘酸希爾法阿爾新藍染色處理標本的方法更為合適。