遲乃玉，劉 洋，于 爽，希 倫，李美玉，張慶芳*

（1.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116622）

肌氨酸氧化酶（sarcosine oxidase，SOX）屬于黃素蛋白氧化酶類，在自然界中分布廣泛。其是酶法測(cè)定肌酐中研究較多的一種酶，可催化肌氨酸中的N-甲基氧化，可偶聯(lián)肌酐酶和肌酸酶降解肌酐。作為一種重要的診斷酶制劑，是測(cè)定血清或尿液中肌酐含量的關(guān)鍵酶之一，應(yīng)用于腎臟的健康程度的診斷[1]。

為了滿足工業(yè)用酶的需求，趙更鋒等[2-9]已從肌氨酸氧化酶的分布、酶學(xué)性質(zhì)以及分子生物學(xué)方面進(jìn)行了大量研究。SUZUKIM[10]最早發(fā)現(xiàn)棒狀桿菌屬（Corynebacterium sp.）可以產(chǎn)肌氨酸氧化酶，隨后相繼發(fā)現(xiàn)假單胞菌（Pseudomonas）、鏈霉菌（Streptomyces）、芽孢桿菌（Bacillus）和節(jié)桿菌（Arthrobacter）等微生物均可產(chǎn)肌氨酸氧化酶[11-16]。但目前依然存在著許多不足之處，如熱穩(wěn)定性普遍較差，使其在一些領(lǐng)域的應(yīng)用中受到限制。MORIN等[17]從土壤中篩選出一株產(chǎn)單聚體肌氨酸氧化酶的銨鐠柱胞霉菌（Cylindrocarpon didymium）M-1，測(cè)得該單聚體肌氨酸氧化酶分子質(zhì)量為48 kDa，最適pH值為7.5，最適溫度為40℃，將該酶在45℃處理10 min，殘余酶活力為75%。

本研究從渤海海泥中分離、篩選一株高產(chǎn)低溫肌氨酸氧化酶菌株，采用形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定，并對(duì)其所產(chǎn)的肌氨酸氧化酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究，為腎臟疾病診斷試劑盒的研發(fā)提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

海泥樣品：遼寧省大連渤海灣（N：39°7′，S：121°41′）。

1.1.2 試劑

肌酸：大連凱美化工工程配套有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）純化試劑盒：大連寶生物有限公司；酵母膏、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、碘化鉀、淀粉、牛肉膏、胰蛋白胨、氯化鈉：生工生物工程（上海）股份有限公司；所有試劑均為國產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基[18]

富集培養(yǎng)基：肌酸5.0 g/L，酵母膏0.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，海水1 L，pH 7.0。

分離培養(yǎng)基：肌酸5.0 g/L，酵母膏5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，碘化鉀1.7 g/L，淀粉10 g/L，海水1 L，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 10 g/L，海水1 L，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：肌酸5.0 g/L，酵母膏5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，海水1 L，pH 7.0。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L。

以上固體培養(yǎng)基中加入20 g/L瓊脂，培養(yǎng)基均在0.1 MPa、121℃條件下高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

HZP-256全溫振蕩培養(yǎng)箱：上海智誠分析儀器制造有限公司；CX21FS3顯微鏡：日本OLYMPUS公司；NB-1630超凈工作臺(tái)、UV-H232可見紫外分光光度計(jì)：菲迪康樂（廣州）科學(xué)儀器有限公司；LDFX-50BI立式壓力蒸汽滅菌鍋：蘭州方盛生物科技有限公司；APL-204電子天平、pH-3G pH計(jì)：陜西鼎盛儀器設(shè)備有限公司；MBS聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：上海普迪生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)肌氨酸氧化酶菌株的篩選

菌株初篩：取大連渤海海灣海泥10 g于100 mL富集培養(yǎng)基中，在20℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，每天測(cè)肌酸含量。待肌酸完全降解后，富集培養(yǎng)液經(jīng)10倍梯度稀釋至10-6，將稀釋液涂布于固體分離培養(yǎng)基，25℃條件下倒置培養(yǎng)24 h，挑取變?yōu)樗{(lán)綠色的菌落進(jìn)行分離、純化。將分離得到的菌株接種到新鮮的分離培養(yǎng)基中，20℃、150 r/min條件下培養(yǎng)72 h，測(cè)定肌酸的降解情況。

菌株復(fù)篩：將可降解肌酸的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，20℃、150 r/min條件下培養(yǎng)48 h，測(cè)定其肌氨酸氧化酶活力。

1.3.2 肌酸降解率的測(cè)定[19]

在0.5 mL的樣品中，加入1 mL含有1%α-萘酚的1.5 mol/L NaOH、0.5 mL 0.05%的雙乙酰，顯色30 min，再加入3 mL蒸餾水，于波長530 nm處測(cè)定吸光度值。計(jì)算肌酸降解率，計(jì)算公式如下：

1.3.3 肌氨酸氧化酶活力的測(cè)定[19]

將待測(cè)菌體進(jìn)行超聲破壁后，于4℃、8 000 r/min條件下離心15 min，取上清酶液0.1 mL于0.9 mL含有0.1 mol/L肌氨酸的焦磷酸鈉緩沖液（pH 7.4）中，37℃反應(yīng)10 min，再加入0.25 mL 0.1 mol/L的醋酸終止反應(yīng)，并加入1.5 mL含有0.04%乙酰丙酮的20%乙酸銨溶液，于37℃反應(yīng)40 min后，在波長410 nm處測(cè)定吸光度值。

肌氨酸氧化酶活力定義：在37℃、pH 7.0條件下每分鐘分解1μmol肌氨酸的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.4 菌株的鑒定

形態(tài)觀察：將試驗(yàn)菌株劃線于固體LB平板上，20℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌株的菌落形態(tài)特征，并挑取單菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌株的細(xì)胞形態(tài)。

生理生化試驗(yàn)[20]：對(duì)試驗(yàn)菌株進(jìn)行V-P反應(yīng)、接觸酶反應(yīng)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、產(chǎn)生吲哚試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠水解試驗(yàn)、含碳化合物的利用等試驗(yàn)。

分子生物學(xué)鑒定：將試驗(yàn)菌株接種于富集培養(yǎng)基中，20 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)48 h，8 000 r/min離心15 min后棄上清，加入100μL無菌重蒸水（ddH2O）中，混勻，沸水處理10 min，12 000 r/min離心10 min，以上清液為模板對(duì)試驗(yàn)菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[19]。正向引物為BSF8/20（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）；反向引物為BSR1541/20（5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'）。采用DNA純化試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，并送至北京諾禾致源生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交至美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中，與已知菌種的16S rDNA序列進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，選擇若干條同源性較高的模式菌株的16S rDNA序列，采用MEGA 5.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其分類地位。

1.3.5 肌氨酸氧化酶酶學(xué)性質(zhì)的初步研究

最適作用溫度：按照肌氨酸氧化酶活力的測(cè)定方法，分別在不同作用溫度條件下（5～70℃，梯度為5℃），測(cè)定肌氨酸氧化酶活力，確定酶的最適反應(yīng)溫度；將同組實(shí)驗(yàn)中最高酶活力設(shè)為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。

熱穩(wěn)定性：將粗酶液分別在不同溫度條件下（25℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）處理60 min，測(cè)定酶活力。

最適作用pH：分別在不同pH值條件下（4.0～11.0，梯度為0.5）測(cè)定肌氨酸氧化酶酶活力，確定酶的最適反應(yīng)pH。其中pH 4.0～6.0為0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；pH 6.0～8.5為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液；pH 8.5～9.5為0.05 mol/L硼砂-硼酸緩沖液；pH 9.5～11.0為0.05 mol/L硼砂-NaOH緩沖液。

pH穩(wěn)定性：將粗酶液分別于不同pH值（4.0～11.0，梯度為0.5）的緩沖液中，37℃保溫18 h，測(cè)定酶活力。

不同金屬離子對(duì)肌氨酸氧化酶活性的影響：將粗酶液分別加入含有1 mmol/L或10 mmol/L不同金屬離子（Co2+、Ca2+、K+、Fe2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+）的溶液中，37 ℃保溫30 min，測(cè)定酶活力。將未加入金屬離子的酶液活力設(shè)為100%，計(jì)算各組的相對(duì)酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)肌氨酸氧化酶菌株的初篩

通過初篩發(fā)現(xiàn)，27個(gè)菌落周圍變成藍(lán)綠色，其中10株菌株（LYH03、LYH09、LYH18、LYH36、LYH44、LYH45、LYH83、LYH106、LYH186、LYH221）可降解肌酸（對(duì)照菌株肌酸降解率為4.5%），結(jié)果見表1。由表1可知，菌株LYH18降解肌酸的能力最強(qiáng)，培養(yǎng)72 h后，肌酸降解率達(dá)75%。

表1 菌株的肌酸降解率Table 1 Creatine degradation rate of strains

2.2 產(chǎn)肌氨酸氧化酶菌株的復(fù)篩

將初篩獲得的10株菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測(cè)定其肌氨酸氧化酶活力，結(jié)果如表2所示。

表2 菌株產(chǎn)肌氨酸氧化酶的酶活比較Table 2 Comparison of enzyme activities of sarcosine oxidase produced by strains

由表2可知，菌株LYH18的肌氨酸氧化酶活力最高，為1.65 U/mL，與肌酸降解情況一致。因此，選取菌株LYH18為目標(biāo)菌株，對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定。

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察

菌株LYH18的菌落與細(xì)胞形態(tài)見圖1。由圖1a可知，菌株LYH18在LB固體培養(yǎng)基上，菌落呈圓形，隆起，表面光滑，濕潤，邊緣整齊，無色，易挑??；由圖1b可知，革蘭氏染色呈陽性，在LB固體培養(yǎng)基上生長3 d后形成芽孢，芽孢形狀為橢圓形，菌體呈桿狀。這些特征表明，菌株LYH18呈現(xiàn)出典型的細(xì)菌特征。

圖1 菌株LYH18的菌落（a）和細(xì)胞（b）形態(tài)Fig.1 Colony(a)and cell(b)morphology of strain LYH18

2.3.2 生理生化鑒定

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（第8版）[21]對(duì)菌株LYH18進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，生理生化特征結(jié)果見表3。

由表3可知，菌株LYH18在無氧條件下不能生長，接觸酶試驗(yàn)呈陽性，V-P反應(yīng)呈陰性，對(duì)氯化鈉有較強(qiáng)的耐受性，在10%NaCI條件下能夠生長；不能分解酪酛、明膠及淀粉；可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽；能利用多種碳水化合物，如D-半乳糖、L（+）-鼠李糖、纖維二糖、葡萄糖、蔗糖、松三糖，但不能利用D-木糖、棉子糖和D-甘露糖；不能產(chǎn)吲哚。結(jié)合形態(tài)觀察，根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（第8版）初步鑒定菌株LYH18為芽孢桿菌屬（Bacillus）。

表3 菌株LYH18的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain LYH18

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定

為了進(jìn)一步鑒定分離菌株LYH18，將其16S rDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對(duì)。結(jié)果表明，菌株LYH18與Bacillus的多個(gè)菌種的序列相似性＞97%，采用MEGA5.0軟件中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2。由圖2可知，菌株LYH18與海泥芽孢桿菌（Bacillus oceanisediminis）H2同源性（99%）較高，親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)結(jié)果，將菌株LYH18鑒定為海泥芽胞桿菌（Bacillus oceanisediminis）。

圖2 基于16S rDNA序列菌株LYH18的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain LYH18 based on 16S rDNA sequences

2.4 酶學(xué)性質(zhì)研究

2.4.1 肌氨酸氧化酶的最適作用溫度

不同作用溫度條件下測(cè)定肌氨酸氧化酶活力，結(jié)果見圖3。由圖3可知，當(dāng)作用溫度在10～15℃時(shí)，肌氨酸氧化酶的活性隨著作用溫度的升高而急劇增大；當(dāng)作用溫度為25℃時(shí)，肌氨酸氧化酶活力最高；當(dāng)作用溫度在15～45℃時(shí)，相對(duì)酶活力基本保持在80%以上，說明在室溫條件下，該酶即可保持較高酶活，這一特點(diǎn)可節(jié)省能源的消耗；當(dāng)作用溫度高于45℃后，酶活性急劇下降；當(dāng)作用溫度高于50℃后，相對(duì)酶活＜60%。結(jié)果表明，肌氨酸氧化酶的最適作用溫度為25℃，該酶對(duì)高溫條件比較敏感，更適合低溫條件。

圖3 肌氨酸氧化酶的最適反應(yīng)溫度Fig.3 Optimal reaction temperature of sarcosine oxidase

2.4.2 肌氨酸氧化酶的熱穩(wěn)定性

肌氨酸氧化酶的熱穩(wěn)定性如圖4所示。由圖4可知，肌氨酸氧化酶在25～40℃條件下處理60 min后，相對(duì)酶活＞80%，保持高酶活性，說明該酶在室溫條件下，較穩(wěn)定；當(dāng)處理溫度高于40℃以后，相對(duì)酶活力逐漸下降，符合海洋低溫酶的特性[23]；該酶在50℃處理60 min后，相對(duì)酶活力急速下降，僅保留30%的相對(duì)酶活力；在60℃、70℃處理60 min，相對(duì)酶活力均＜10%，說明該酶熱穩(wěn)定性較弱。

圖4 肌氨酸氧化酶的熱穩(wěn)定性Fig.4 Thermal stability of sarcosine oxidase

2.4.3 肌氨酸氧化酶的最適作用pH值

不同作用pH值條件下測(cè)定肌氨酸氧化酶活力，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，該肌氨酸氧化酶作用的最適作用pH為8.0，且pH值在7.5～9.0之間時(shí)，相對(duì)酶活性較高，可保持在80%以上；當(dāng)pH值≤7.0或≥9.0時(shí)，相對(duì)酶活性較低。

圖5 肌氨酸氧化酶的最適作用pH值Fig.5 Optimal reaction p H of sarcosine oxidase

2.4.4 肌氨酸氧化酶的pH穩(wěn)定性

肌氨酸氧化酶的pH穩(wěn)定性結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，該酶在pH值≤6.0時(shí)，相對(duì)酶活＜40%；在pH值7.0～10.0之間時(shí)，酶活可保持在80%以上，較穩(wěn)定；由此可以得出，在中性至弱堿性條件下，肌氨酸氧化酶活性較高，較穩(wěn)定，說明該酶耐弱堿性。

圖6 肌氨酸氧化酶的pH穩(wěn)定性Fig.6 pH stability of sarcosine oxidase

2.4.5 不同金屬離子對(duì)肌氨酸氧化酶活性的影響

不同金屬離子對(duì)肌氨酸氧化酶活力的影響見圖7。

圖7 不同金屬離子對(duì)肌氨酸氧化酶活性的影響Fig.7 Effect of different metal ions on sarcosine oxidase activity

由圖7可知，不同金屬離子對(duì)酶的作用不同；同種金屬離子在不同終濃度條件下對(duì)酶的作用也不同。其中Ca2+、Fe2+、Ni2+、Cu2+能使該酶失活，而K+對(duì)酶活性幾乎沒有影響；Co2+、Zn2+、Mg2+對(duì)酶活性有一定促進(jìn)作用，其中Co2+對(duì)酶活性促進(jìn)作用最強(qiáng)。

3 結(jié)論

本研究從渤海灣海泥樣品中分離到一株高產(chǎn)肌氨酸氧化酶的菌株LYH18，肌氨酸氧化酶活力為1.65 U/mL。通過形態(tài)觀察、生理生化分析和分子生物學(xué)技術(shù)鑒定菌株LYH18為海泥芽胞桿菌（Bacillus oceanisediminis）。經(jīng)初步探索其產(chǎn)肌氨酸氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果表明，該菌株所產(chǎn)的肌氨酸氧化酶的最適作用溫度和pH值分別為25℃和8.0，在溫度25～40℃和pH 7.0～10.0范圍內(nèi)，酶活性較穩(wěn)定，該酶屬于低溫酶類。菌株LYH18作為一株產(chǎn)肌氨酸氧化酶的新菌源，具有潛在的開發(fā)價(jià)值。