李秀博，劉 存，鄢明華，崔玉東，崔尚金

（1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶163319 ；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京1001931；3.農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)北京科學(xué)觀測實驗站，北京100193；4.天津畜牧獸醫(yī)研究所，天津300384）

A型塞內(nèi)卡病毒（Senecavirus A，SVA）又稱塞內(nèi)卡山谷病毒（Seneca valley virus，SVV），是單股正鏈RNA病毒，是小RNA病毒科、塞內(nèi)卡病毒屬唯一成員。2008年和2012年，加拿大和美國的研究人員分別報道了SVA相關(guān)的豬水皰性疾病，為SVA感染可引起豬水皰性疾病提供了證據(jù)[1-3]。到目前為止，SVA感染已在美國、巴西、中國、哥倫比亞、泰國等國暴發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了較大損失[4-10]。

SVA感染所致的豬水皰病為一種新發(fā)豬病毒性疾病，對養(yǎng)豬業(yè)的生產(chǎn)和經(jīng)濟效益具有很大地威脅。SVA可感染不同年齡的豬，以鼻、唇以及蹄部冠狀帶出現(xiàn)水皰病變?yōu)樘卣?。SVA可致新生仔豬死亡，1～4日齡的新生仔豬感染發(fā)病率可達70%，死亡率為15%～30%[5,11]。動物回歸試驗證實SVA感染可引起仔豬腹瀉[12-13]。SVA感染臨床癥狀與其他致水皰性疾病相關(guān)病原——口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV）、豬傳染性水皰病毒（Swine vesicular disease virus，SVDV）、水皰性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）和豬傳染性水皰皮疹病毒（Vesicular exanthema of swine virus，VESV）臨床癥狀相似，無法區(qū)分[12-13]，病原鑒定需要依靠實驗診斷方法。目前，RT-PCR方法、RNA雜交、免疫組織化學(xué)、電子顯微鏡等方法已應(yīng)用到SVA的檢測中；病毒中和試驗、競爭ELISA、間接ELISA方法等用于SVA感染的血清學(xué)檢測[14]。

2015年，我國首次報道了SVA感染引起的豬水皰性疾病，目前已在廣東、福建、湖南、河南、黑龍江省等地發(fā)現(xiàn)了SVA感染病例[7,14-16]。我國SVA感染以零星散發(fā)為主，危害較口蹄疫小，但并不能排除其形成流行的可能性，仍加強SVA的防控以及監(jiān)測。實時熒光定量PCR技術(shù)具有特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、快速等優(yōu)點，不僅成為病毒研究中常用的工具，在動物疫病防控與監(jiān)測中也具有廣泛應(yīng)用[17-18]。本研究針對SVA基因組序列保守區(qū)域設(shè)計了引物與探針，建立了SVA TaqMan 熒光定量RTPCR方法，為了解SVA的流行病學(xué)特征及致豬水皰性疾病相關(guān)病原的鑒別診斷提供了技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 病毒A型豬塞內(nèi)卡病毒SVA CH/FuJ/2017株（GenBank登錄號：MH490944）、豬偽狂犬病病毒JL株均由本實驗室保存；豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒及傳染性胃腸炎病毒cDNA均提取自市售疫苗毒；O型口蹄疫病毒cDNA由本實驗室保存。

1.2 主要試劑KAPA Probe Fast Universal qPCR 試劑盒購自北京普凱瑞生物技術(shù)有限公司；病毒RNA快速提取試劑盒和PCR Master Mix 購自北京艾德艾德萊生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV和pMD18-T載體購自TaKaRa公司。

1.3 引物及探針設(shè)計與合成參考SVA CH/FuJ/2017株全基因組序列，利用Primer Express 3.0設(shè)計1對特異性引物SVA-3D F/R及探針SVA-3D probe。同時，設(shè)計1對引物SVA-MF/R用于構(gòu)建標準品質(zhì)粒，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，引物序列見表1。

1.4 標準品質(zhì)粒的構(gòu)建參照病毒RNA快速提取試劑盒說明書提取SVA CH/FuJ/2017株RNA，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，并以此為模板利用SVA-MF/R進行PCR擴增。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共計35個循環(huán)；72℃延伸10 min。參照Omega膠回收試劑盒說明書對目的片段進行膠回收，并連接至pMD18-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18T-SVA-M。利用紫外分光光度計測定其質(zhì)量濃度，按照公式copies / μL=（6.02×1023copies/mol）×(濃度 g/mL) ×10-3/（分子質(zhì)量g/mol）計算拷貝數(shù)。

1.5 熒光定量PCR反應(yīng)條件優(yōu)化根據(jù)KAPA Probe Fast Universal qPCR 試劑盒說明書確定反應(yīng)體系為20 μL。以陽性標準品質(zhì)粒為模板，采用矩陣法，對熒光定量PCR的退火溫度（56℃、58℃、60℃、62℃、64℃）進行優(yōu)化，并利用矩陣法對引物（10 μmol/L）及探針（10 μmol/L）使用量（0.4、0.6、0.8、1.0 μL）依次進行優(yōu)化。

表1 本研究中應(yīng)用的引物及探針Table 1 The primers and probe sequences in this study

1.6 標準曲線繪制將重組質(zhì)粒標準品進行10倍系列稀釋，選用濃度為3.75×108～3.75×101copies/μL標準品為模板，以優(yōu)化的反應(yīng)條件進行熒光定量PCR檢測，每個濃度標準品做3個重復(fù)。以log（拷貝數(shù)）為縱坐標，CT值為橫坐標繪制標準曲線，并進行線性回歸分析。

1.7 特異性試驗以SVA CH/FuJ/2017株、豬偽狂犬病病毒JL株、口蹄疫病毒、豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒以及豬傳染性胃腸炎病毒的cDNA或DNA為模板，以最佳的反應(yīng)條件進行熒光定量PCR檢測，評價該方法的特異性。

1.8 敏感性試驗以3.75×108～3.75×100copies/μL標準品質(zhì)粒為模板進行熒光定量PCR檢測，確定該方法的檢測下限。同時，對使用的不同濃度的標準品質(zhì)粒作為模板進行普通PCR擴增，確定其檢測下限。比較熒光定量PCR與普通PCR兩種方法的敏感性。

1.9 重復(fù)性試驗選用3.75×105copies/μL、3.75×104copies/μL、3.75×103copies/μL標準品質(zhì)粒為模板進行3批重復(fù)試驗，每批次重復(fù)3次以檢驗其批內(nèi)重復(fù)效果。在不同時間進行3次重復(fù)試驗以檢驗該方法批間重復(fù)效果。

2 結(jié)果

2.1 標準品質(zhì)粒的構(gòu)建以SVA CH/FuJ/2017株cDNA為模板，利用引物SVA-MF/R進行PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，成功擴增出目的片段SVA-M。將PCR產(chǎn)物進行膠回收后，連接于pMD18T載體并進行轉(zhuǎn)化、篩選，經(jīng)雙酶切及測序鑒定，重組標準品質(zhì)粒pMD18T -SVA-M構(gòu)建成功。對獲得的重組質(zhì)粒測定質(zhì)量濃度后計算拷貝數(shù)為3.75×1010copies/μL。

2.2 TaqMan熒光定量PCR條件優(yōu)化及標準曲線的繪制根據(jù)KAPA Probe Fast Universal qPCR 試劑盒說明書確定反應(yīng)體系為20 μL，經(jīng)過優(yōu)化最終確定為qPCR Mix 10 μL、探針（10 μmol/L）0.6 μL、上/下游引物（10 μmol/L）0.8 μL、Rox 0.4 μL、模板1 μL，dd H2O 補至20 μL。經(jīng)過對反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性15 s，60℃退火30 s（收集熒光），共計40個循環(huán)。以標準品質(zhì)粒pMD18T -SVA-M進行10倍系列稀釋，選用3.75×108～3.75×101copies/μL標準品為模板進行熒光定量PCR檢測，繪制標準曲線。標準曲線為Y=-3.1013X+34.60，相關(guān)系數(shù)R2=0.9974，線性關(guān)系良好。

2.3 特異性檢驗以SVA CH/FuJ/2017株、口蹄疫病毒、豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒的cDNA及豬偽狂犬病病毒JL株的DNA為模板進行檢測。結(jié)果表明，該方法僅與SVA cDNA存在特異性反應(yīng)，與其他病毒不存在交叉反應(yīng)，特異性良好（圖1）。

2.4 敏感性試驗以3.75×108～3.75×100copies/μL重組質(zhì)粒標準品作為模板進行熒光定量PCR檢測。檢測結(jié)果顯示，所建立的TaqMan熒光定量PCR方法最低檢出下限為3.75拷貝。普通PCR檢出下限為3.75×103拷貝?？梢姡⒌腡aqMan熒光定量PCR方法比傳統(tǒng)PCR方法靈敏度更高。

2.5 重復(fù)性檢驗以3.75×105copies/μL、3.75×104copies/μL、3.75×103copies/μL標準品質(zhì)粒為模板進行批內(nèi)、批間重復(fù)性試驗。結(jié)果表明，批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均小于5%，說明該方法重復(fù)性良好（表2）。

圖1 SVA TaqMan 熒光定量PCR方法的特異性試驗Fig. 1 Specificity of TaqMan PCR for SVA

表2 SVA TaqMan熒光定量PCR方法的重復(fù)性試驗Table 2 The reproducibility test of TaqMan real-time PCR for SVA

3 討論

目前，SVA所致的水皰性疾病已經(jīng)在美國、加拿大、泰國、哥倫比亞、澳大利亞等國家報道，中國廣東、福建、河南、黑龍江等省也發(fā)現(xiàn)了SVA感染病例[4-10,14-16]。對SVA防控亟需了解其在我國豬群的流行與分布，因此建立SVA快速診斷方法具有重要意義。

本研究建立的TaqMan熒光定量PCR方法具有良好的特異性，與口蹄疫病毒、豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒以及豬偽狂犬病病毒等不存在交叉反應(yīng)。該方法靈敏度較普通PCR方法高且更為快速、方便，檢出下限為3.75拷貝。重復(fù)性試驗結(jié)果顯示，該方法批內(nèi)及批間的變異系數(shù)均小于5%，具有良好的重復(fù)性及穩(wěn)定性。

目前，已經(jīng)應(yīng)用于SVA檢測及診斷的技術(shù)包括原位雜交技術(shù)、血清學(xué)檢測技術(shù)和PCR檢測方法等。研究表明，ELISA方法更適合于血清學(xué)診斷及免疫診斷，而不適于SVA的早期診斷。Yang等[19]利用cELISA對SVA攻毒豬進行血清學(xué)診斷，在攻毒6 d后，所有攻毒豬均呈現(xiàn)抗體陽性，血清陽性抑制持續(xù)至試驗結(jié)束（攻毒后57 d）。可見，通過血清學(xué)診斷判定動物感染狀態(tài)不適于早期診斷，也不利于對該病早期防控措施的實施。在病原檢測方法中，Resende等[20]采用一種新型原位雜交技術(shù)（ISH）檢測不同組織中病毒RNA，具有高效高特異性。但該方法需要采集動物不同組織樣品，不適合活體動物的早期快速檢測。PCR檢測不受樣品限制，適合于動物活體檢測。國外已建立PCR、巢式PCR、SYBR Green RT-qPCR等方法并應(yīng)用于SVA感染診斷[21-23]。

我國多個地區(qū)已發(fā)現(xiàn)了SVA感染，雖尚未形成流行的趨勢，但不可排除其形成流行的可能。本研究建立的SVA TaqMan熒光定量PCR方法，特異性良好，敏感度比普通PCR更高，為SVA感染早期診斷及相應(yīng)防控措施的實施提供了技術(shù)支持。