邢萬金

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乳糖操縱子模型的建立與教學(xué)中若干問題的解析

邢萬金

內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010070

基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)調(diào)控機制是現(xiàn)代生命科學(xué)的研究熱點和焦點。乳糖操縱子是大腸桿菌()分解代謝乳糖的一簇基因，其基因組成與表達(dá)調(diào)控方式是最早被闡明的基因結(jié)構(gòu)與調(diào)控機制，因而成為微生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等多門專業(yè)課程講解基因調(diào)控機制的經(jīng)典教學(xué)案例和要求重點掌握的內(nèi)容，備受師生們的重視。該知識點雖然結(jié)論簡單，記憶容易，但由于觸及生命結(jié)構(gòu)與功能的核心機制，內(nèi)涵豐富，邏輯深奧，理解困難。教師要充分發(fā)揮該教學(xué)案例的效果并非易事，需要深入了解乳糖操縱子的基因結(jié)構(gòu)和工作原理，特別是科學(xué)家揭秘這些奧秘的科學(xué)背景和思維過程。本文通過回溯大腸桿菌乳糖操縱子發(fā)現(xiàn)和表達(dá)模式解析的歷程，追隨J. Monod和F. Jacob等前輩名家的腳印，聆聽他們對實驗結(jié)果的分析，學(xué)習(xí)他們的科研思想和創(chuàng)新思維，結(jié)合乳糖操縱子的DNA序列，深入分析和理解乳糖操縱子表達(dá)的若干奇特現(xiàn)象的原因，共同探討如何充分發(fā)揮遺傳學(xué)和分子生物學(xué)經(jīng)典案例的教學(xué)價值。

遺傳學(xué)；案例教學(xué)；乳糖操縱子；基因調(diào)控

從Jacques Monod觀察到細(xì)菌在糖混合培養(yǎng)基中的兩期生長模式，至確認(rèn)細(xì)菌產(chǎn)生b-半乳糖苷酶并非原有的前體酶“適應(yīng)”，而是受誘導(dǎo)后的“從頭合成”，到提出乳糖操縱子模型，法國巴斯德研究所的幾位科學(xué)家長期專注于一個科學(xué)問題，最終闡明了代謝乳糖的基因簇的結(jié)構(gòu)和誘導(dǎo)表達(dá)機制。

在當(dāng)今的高校本科教學(xué)中，限于學(xué)時數(shù)和掌握的原始文獻(xiàn)及了解的科學(xué)史，教師在講授乳糖操縱子模型時，往往只是簡單地介紹結(jié)論。教師的授課目標(biāo)局限于給學(xué)生介紹一種原核基因表達(dá)調(diào)控機制，學(xué)生的學(xué)習(xí)任務(wù)量化為記憶“調(diào)節(jié)基因”、“阻遏物”、“結(jié)構(gòu)基因”和“操縱子”等幾個名詞，以及乳糖、阻遏物與操縱子之間的簡單相互作用，而未能觸及針對乳糖操縱子模型的創(chuàng)新性科研思維，因而未能充分發(fā)揮乳糖操縱子案例的教學(xué)價值。

目前，全社會和教育主管部門都在提倡培養(yǎng)學(xué)生的科研素質(zhì)和創(chuàng)新能力，這就要求教師更新教學(xué)理念，改革授課方式。在課程教學(xué)過程中，在講解每個知識點的時候，不僅要介紹原理和結(jié)論，更要講解科學(xué)家發(fā)現(xiàn)原理和推出結(jié)論的科學(xué)思維過程[1,2]，而后者才是教學(xué)的重點。要了解創(chuàng)新知識點的來源、歷程及其研究思路與方法，只有系統(tǒng)梳理文獻(xiàn)，重現(xiàn)歷史。本文繼續(xù)秉承用科學(xué)史引導(dǎo)教學(xué)的理念[3]，系統(tǒng)梳理乳糖操縱子的發(fā)現(xiàn)過程與科學(xué)家們的解析思路，深入挖掘乳糖操縱子案例對于培養(yǎng)學(xué)生科研思維和分析能力的教學(xué)價值。

在講解乳糖操縱子模型時，通常會遇到幾個邏輯悖論。例如，乳糖操縱子模型認(rèn)為細(xì)菌合成b-半乳糖苷酶和透性酶需要先有乳糖進(jìn)入細(xì)胞才能誘導(dǎo)編碼這兩個酶的基因表達(dá)，但細(xì)菌細(xì)胞膜上先要有透性酶乳糖才能進(jìn)入細(xì)胞；進(jìn)入細(xì)胞的乳糖分子本身并不能誘導(dǎo)操縱子表達(dá)，必須先被b-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)化為異乳糖才能發(fā)揮誘導(dǎo)作用。即表達(dá)b-半乳糖苷酶和透性酶需要乳糖誘導(dǎo)，而乳糖反而需要先有這兩種酶才能進(jìn)入細(xì)胞并被轉(zhuǎn)化成異乳糖，由此就形成了邏輯上的怪圈，到底是細(xì)菌先攝入乳糖，后合成b-半乳糖苷酶和透性酶？還是先合成b-半乳糖苷酶和透性酶，后攝入乳糖以發(fā)揮其誘導(dǎo)能力呢？此外，乳糖操縱子模型認(rèn)為該操縱子應(yīng)該轉(zhuǎn)錄出一條完整的多順反子mRNA，那么翻譯出的3種酶應(yīng)該幾乎等量，但實際上人們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)乙酰酶遠(yuǎn)比b-半乳糖苷酶少，這是為什么呢？

上述若干疑問是乳糖操縱子案例教學(xué)中容易被忽略但又必須直面的問題。其實這些問題不僅僅是教學(xué)問題，也是深入研究基因調(diào)控分子機理的切入點，因而早已被眾多研究者所關(guān)注，并設(shè)計實驗進(jìn)行了解答，只是目前的教科書上鮮有對這些問題的提及和系統(tǒng)論述，這就要求任課教師在備課時對此有所鉆研。

深入挖掘教學(xué)案例涉及的科學(xué)問題和尋找問題的答案應(yīng)該成為研究型教學(xué)改革的抓手，惟其如此，才能體現(xiàn)教師授課的價值，也促使高校教師在教學(xué)過程中開展科研活動，不斷提升自身的學(xué)術(shù)修養(yǎng)，在課堂上培養(yǎng)學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題和解決問題的科研創(chuàng)新能力。本文以大腸桿菌K12基因組(LN832404.1)的乳糖操縱子基因序列為藍(lán)本，在DNA序列水平上分析了乳糖操縱子的工作原理和特點，通過廣泛查閱研究文獻(xiàn)，給出上述疑問的答案。

1 乳糖操縱子的發(fā)現(xiàn)

1.1 “酶適應(yīng)”假說

1882年，德國真菌學(xué)家Julius Wortmann[4]報道了細(xì)菌“”只有生長在含淀粉的培養(yǎng)基中才產(chǎn)生淀粉酶(amylase)。盡管文中同時報道了無論培養(yǎng)基中是否有蔗糖，酵母都始終產(chǎn)生蔗糖酶(invertase)，他發(fā)現(xiàn)的培養(yǎng)基成分會影響微生物產(chǎn)生某種酶的能力的現(xiàn)象還是引起了廣泛的關(guān)注和跟進(jìn)研究。如1899年，巴斯德研究所的Emile Duclaux發(fā)現(xiàn)灰綠曲霉()和灰綠青霉()兩種真菌能否產(chǎn)生蔗糖酶或酪蛋白酶(casease)，取決于培養(yǎng)基中是否含有蔗糖或牛奶[5]。赫爾辛基大學(xué)的Henning Karstrom觀察到大腸桿菌能否分解乳糖也取決于培養(yǎng)基中是否含有乳糖[6]。隨著研究案例的積累，人們逐漸形成共識：微生物能否產(chǎn)生某種酶在很大程度上受培養(yǎng)基中是否存在此酶的底物的影響。Henning Karstrom把這種現(xiàn)象稱為酶適應(yīng)(enzymatic adaptation)，并把細(xì)菌分解糖的酶分為兩類：一類為適應(yīng)型(adaptive)酶，只有在底物存在時才能在細(xì)菌細(xì)胞中檢測到該酶的活性；另一類為組成型(constitutive)酶，無論底物是否存在，在細(xì)菌細(xì)胞中都能檢測到該酶的活性[7]。

組成型酶可以理解為細(xì)菌生命活動所必需的代謝反應(yīng)催化劑。但適應(yīng)型酶似乎只針對環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)，這種現(xiàn)象的機理是什么呢？為了解釋酶適應(yīng)現(xiàn)象，劍橋大學(xué)的John Yudkin[8]提出了“mass action”假說，認(rèn)為細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的酶以兩種形式存在：一種是“無活性的前體形式”(precursor, P)，另一種是“有活性的酶形式”(enzyme, E)，二者處于化學(xué)平衡狀態(tài)。如果某種酶是適應(yīng)型酶，在無底物(substrates, S)時平衡傾向于P形式；有底物時，酶與底物形成“酶-底物復(fù)合物”(E-S)，使反應(yīng)平衡轉(zhuǎn)向E形式(圖1)。

圖1 適應(yīng)型酶活性改變的“mass action”假說

P：無活性前體；E：有活性的酶；S：酶的底物；E-S：酶-底物復(fù)合物；k1和k2代表不同的反應(yīng)速度常數(shù)。前體(P)與酶(E)處于化學(xué)平衡狀態(tài)。加入的底物(S)會與酶(E)結(jié)合，打破前體-酶(P-E)平衡，導(dǎo)致更多的前體(P)轉(zhuǎn)化為酶(S)。

1.2 Jacques Monod的發(fā)現(xiàn)與思考

1941年，巴斯德研究所的Jacques Monod[9]在博士畢業(yè)時報道，如果用兩種糖，如葡萄糖和木糖(xylose)、葡萄糖和鼠李糖(rhamnose)，作為碳源培養(yǎng)大腸桿菌，繪制的大腸桿菌生長曲線呈現(xiàn)出被一個明顯的靜止期分割開的兩個指數(shù)生長期(圖2)。Monod用“double growth”杜撰了一個名詞“diauxie”來描述這種現(xiàn)象。當(dāng)他就這個結(jié)果與導(dǎo)師André Lwoff討論時，Lwoff提醒他這種生長現(xiàn)象可能與酶適應(yīng)有關(guān)。

Monod當(dāng)時未曾注意過酶適應(yīng)。他隨即查閱文獻(xiàn)，認(rèn)真研究了前人關(guān)于酶適應(yīng)的論述，認(rèn)為Yudkin的“mass action”假說雖然有道理，但并不能完全解釋自己的實驗結(jié)果，因為隨著底物被適應(yīng)型酶分解的越來越少，細(xì)菌的生長也應(yīng)該越來越慢，而不應(yīng)該是S型曲線(先快速增加，后停止，后再快速增加)[10]。

另一方面，早在1900年，E. Duclaux的博士生Frédéric Diénert[11]在其博士論文中報道，當(dāng)在酵母培養(yǎng)基中加入兩種糖(如葡萄糖和半乳糖)時，酵母不能同時產(chǎn)生分解這兩種糖的酶，即一種糖的存在似乎會抑制酵母產(chǎn)生分解另一種糖的酶，Diénert把這種現(xiàn)象稱為葡萄糖效應(yīng)(glucose effect)。葡萄糖效應(yīng)提示細(xì)菌可能只產(chǎn)生一種酶，兩種底物在細(xì)胞內(nèi)競爭這種酶，這種酶分解不同的底物時就成為不同的酶。Monod的細(xì)菌實驗結(jié)果類似于這一現(xiàn)象，于是Monod[10]1942年在Diénert的底物競爭假說和Karstrom的酶適應(yīng)假說的基礎(chǔ)上，提出第一種糖是被細(xì)胞里已經(jīng)存在的“組成型酶”分解，第二種糖是被原先細(xì)胞內(nèi)不存在的“適應(yīng)型酶”分解。Diauxie曲線的靜止期可解讀為細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的某種酶在第一個指數(shù)生長期分解完第一種糖后，需要一個緩慢的適應(yīng)過程才能被第二種糖誘導(dǎo)去分解第二種糖。

圖2 生長在葡萄糖和木糖混合培養(yǎng)基中的大腸桿菌的兩期生長曲線

生長曲線的兩個指數(shù)期被一個靜止期分割。

但Monod的研究被德國入侵法國中斷了，他隨即投筆從戎。1945年秋天，二戰(zhàn)一結(jié)束，Monod就被Lwoff招回巴斯德研究所繼續(xù)解析大腸桿菌Diauxie生長曲線的生理生化機制[12]。

酶適應(yīng)現(xiàn)象可理解為微生物細(xì)胞為了利用環(huán)境中的新營養(yǎng)物質(zhì)分裂增殖而做出的生理生化改變。但華盛頓大學(xué)的Sol Spiegelman[13]發(fā)現(xiàn)二倍體酵母細(xì)胞即使不增殖，也有酶適應(yīng)現(xiàn)象，且酶活性以S型曲線模式增加。為了解釋這種S型曲線模式，Spiegelman在Yudkin的“mass action”假說的基礎(chǔ)上提出了一個“自我復(fù)制”(self-duplication)假說，認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)總是存在一定量的蛋白質(zhì)作為形成某種酶的前體(P)，P以速度常數(shù)k轉(zhuǎn)化為有活性的某種酶(E)，但E很不穩(wěn)定，會以更高的速度常數(shù)k￠轉(zhuǎn)變?yōu)镻，因而細(xì)胞內(nèi)的E很少。底物S能增加E的穩(wěn)定性，有過量的S進(jìn)入細(xì)胞，就會形成ES，從而抑制k￠，使P不斷地轉(zhuǎn)化為E。k的數(shù)量級受基因和E共同控制，無S時，k主要受基因控制，一旦有E生成，k就主要受E控制，加速把P轉(zhuǎn)化為更多的E，結(jié)果好像E(酶)能夠自我復(fù)制。

按照“自我復(fù)制”假說推導(dǎo)出的酶活性增加曲線確實是S型，與Monod觀察到的S型曲線模式相符。但這一假說要求承認(rèn)細(xì)胞質(zhì)中的酶一旦產(chǎn)生就可以脫離細(xì)胞核內(nèi)的基因控制而進(jìn)行自我增殖，即酵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在不受細(xì)胞核控制的“細(xì)胞質(zhì)基因”(plasmagenes)。Monod認(rèn)為這違背了孟德爾遺傳，因此強烈反對。Monod[14]認(rèn)為細(xì)菌“適應(yīng)”某種糖的現(xiàn)象可能并非由前體轉(zhuǎn)化為活性酶的過程，而是底物誘導(dǎo)酶蛋白從頭合成的過程。因為有些細(xì)菌雖然喪失了“適應(yīng)”某種糖的能力，但細(xì)胞內(nèi)仍然存在著分解這種糖的微弱酶活性。為了系統(tǒng)準(zhǔn)確地分析細(xì)胞內(nèi)的酶活性變化及其實質(zhì)，Monod首先需要一種能直觀地測量酶活性的方法。

1.3 β-半乳糖苷酶活性的測定

在1950年以前，人們用乳糖、麥芽糖、精氨酸和色氨酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)誘導(dǎo)細(xì)菌來研究“酶適應(yīng)”，但都缺乏測定酶活性的便利生化方法。其中測定β-半乳糖苷酶活性的方法是測定乳糖溶液吸光度的變化或者測定乳糖被分解后釋放的CO2量。1950年，威斯康星大學(xué)的Martin Seidman和Karl Paul Link[15]應(yīng)同校的Joshua Lederberg博士的請求，合成了鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷(o-nitrophenyl-β-D-galact-oside, ONPG)。β-半乳糖苷酶能水解ONPG，生成黃色的鄰硝基酚。Lederberg[16]建立了用ONPG作底物測定β-半乳糖苷酶活性的新方法，并發(fā)現(xiàn)在用乳糖培養(yǎng)的大腸桿菌中存在強烈的β-半乳糖苷酶活性，而在用其他糖類培養(yǎng)的大腸桿菌中卻只有非常微弱的β-半乳糖苷酶活性，說明乳糖會誘導(dǎo)β半乳糖苷酶的活性。那么，在用乳糖培養(yǎng)的大腸桿菌中，β-半乳糖苷酶活性激增的原因到底是原有的β-半乳糖苷酶前體被誘導(dǎo)產(chǎn)生了酶活性，還是在細(xì)胞內(nèi)重新合成了更多新的β-半乳糖苷酶呢？

1.4“酶適應(yīng)”假說的否定，“酶誘導(dǎo)”假說的提出

為了回答上述問題，1951年，Monod等[17]分離純化了大腸桿菌β-半乳糖苷酶，免疫家兔制備了兔抗β-半乳糖苷酶的抗血清，并結(jié)合ONPG法檢測了用乳糖培養(yǎng)的大腸桿菌的β-半乳糖苷酶含量和活性。他們發(fā)現(xiàn)如果培養(yǎng)基中的碳源只有乳糖，大腸桿菌的β-半乳糖苷酶活性確實非常高，是以其他糖為碳源的1000多倍！但同時用抗血清分析的結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)的β-半乳糖苷酶含量增加了，并非原有的無活性β-半乳糖苷酶前體適應(yīng)乳糖而成為有活性的β-半乳糖苷酶，這與Yudkin的“mass action”假說矛盾，說明細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶活性增加的原因是因為乳糖誘導(dǎo)大腸桿菌合成了新的β-半乳糖苷酶，即早先的“酶適應(yīng)”說法是錯誤的，應(yīng)該是“酶誘導(dǎo)”。于是，Monod用“誘導(dǎo)”(induction)一詞取代了“適應(yīng)”(adaptation)，來描述“受誘導(dǎo)劑激活的酶蛋白合成”(即早先的“酶適應(yīng)”)現(xiàn)象。

1.5 β-半乳糖苷酶與其誘導(dǎo)物的關(guān)系

既然細(xì)胞內(nèi)并非事先準(zhǔn)備了大量的前體等待著底物將其轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘拿?，而是?xì)胞本來就具備重新制造某種酶的能力，底物只是誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)揮這種制造能力，那么，必須是酶的底物才能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生這種酶嗎？乳糖(圖3A)是β-半乳糖苷酶的底物之一，確實能誘導(dǎo)大腸桿菌合成新的β-半乳糖苷酶。其他類似乳糖的半乳糖苷衍生物呢？Monod等[17]嘗試了手頭能找到的所有半乳糖苷衍生物，發(fā)現(xiàn)并非所有的β-半乳糖苷酶底物都能誘導(dǎo)該酶，能誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶的半乳糖苷衍生物也不都是該酶的底物。如苯酰半乳糖苷是β-半乳糖苷酶的底物之一，但無誘導(dǎo)能力；甲酰半乳糖苷不是該酶的理想底物，卻有誘導(dǎo)能力；而苯酰硫代半乳糖苷(thiophenyl- galactoside)不是該酶的底物，不僅無誘導(dǎo)能力，反而能抑制其他誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)作用。這些結(jié)果提示誘導(dǎo)劑并不與酶直接作用，可能是通過細(xì)胞內(nèi)某種其他組分間接發(fā)揮誘導(dǎo)作用，這也與Yudkin的“mass action”假說矛盾。

盡管誘導(dǎo)劑并非直接作用于所誘導(dǎo)的酶，比較幾種誘導(dǎo)劑的分子結(jié)構(gòu)和誘導(dǎo)能力，仍然可以看出誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)能力與其自身的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。如異丙基硫代b-D-半乳糖苷(IPTG) (圖3D)和苯酰硫代半乳糖苷都不是β-半乳糖苷酶的底物(因為糖苷鍵的O原子被S原子取代) (圖3E)，但I(xiàn)PTG是個強誘導(dǎo)劑，而苯酰硫代半乳糖苷不僅不能誘導(dǎo)，反而會抑制別的誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)作用。顯然糖苷類分子的糖苷配基參與了誘導(dǎo)作用[18]。盡管不同糖苷配基的空間構(gòu)象不同，但誘導(dǎo)作用可能相同，也說明誘導(dǎo)劑并不需要與其所誘導(dǎo)的酶直接結(jié)合。那么，誘導(dǎo)劑的空間構(gòu)象與誰嵌合？如何發(fā)揮作用呢？

1.6 β-半乳糖苷酶的遺傳控制

早在1903年，Lucien Cuenot就提出了“一個基因一個酶”假說[19]，后來斯坦福大學(xué)的George Beadle和Edward Tatum用X射線誘發(fā)鏈孢霉()突變，在鑒定突變體的生化性質(zhì)時也發(fā)現(xiàn)基因突變是影響了鏈孢霉?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)代謝途徑的某一步，于是在1945年也提出了“一個基因一個酶”假說[20]。按照這一假說，大腸桿菌的β-半乳糖苷酶也應(yīng)該有一個對應(yīng)的基因。實際上，1946年Monod和A. Audureau[21]研究一株從Lwoff的腸道中分離出的大腸桿菌時就發(fā)現(xiàn)這株菌不能在只有乳糖為碳源的培養(yǎng)基上生長(–)。但他們在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)一種突變導(dǎo)致它恢復(fù)了利用乳糖的能力(+)，而且這株+突變菌在葡萄糖和乳糖混合培養(yǎng)基中表現(xiàn)出典型的兩期生長曲線?！懊高m應(yīng)”表型可以由突變產(chǎn) 生，意味著這種現(xiàn)象也受基因控制。

圖3 幾種半乳糖苷衍生物的分子結(jié)構(gòu)

A：乳糖(lactose)；B：異乳糖(allolactose)；C：硫代甲基-β-D-半乳糖苷(thiomethyl-beta-D-galactoside, TMG)；D：異丙基硫代b-D-半乳糖苷(propyl-beta-D-thiogalactoside, IPTG)；E：苯酰硫代半乳糖苷(thiophenyl-galactoside)。

當(dāng)時對酶和基因的結(jié)構(gòu)、酶與基因的關(guān)系知之甚少。Monod[14]認(rèn)為酶的結(jié)構(gòu)應(yīng)該是個多聚體，包含一個特異性的模塊B、一個非特異性模塊i、以及一個所有酶或蛋白質(zhì)共有的組分，而基因的作用就是操作這些模塊，用它們搭建出酶的活性部位，即，酶活性問題本質(zhì)上應(yīng)該是個遺傳學(xué)問題，應(yīng)該用遺傳學(xué)方法進(jìn)行研究。但當(dāng)時的遺傳學(xué)研究方法主要是用二倍體有性生殖生物進(jìn)行雜交，然后分析雜交結(jié)果，推斷控制表型的基因和基因型，尚無法用單倍體細(xì)菌進(jìn)行雜交。

1.7 微生物遺傳學(xué)的興起

1946年，耶魯大學(xué)Lederberg與Tatum[22]合作發(fā)現(xiàn)大腸桿菌能被處理產(chǎn)生營養(yǎng)缺陷型突變，并能區(qū)分“雌雄性”，通過接合(conjugation)產(chǎn)生重組型后代。這一發(fā)現(xiàn)暗示可以用類似真核生物雜交的方法研究大腸桿菌的基因和基因型。

1954年，巴斯德研究所Lwoff實驗室的博士研究生Fran?ois Jacob與élie Léo Wollman[23]合作用高頻重組(Hfr)雄性溶原菌與雌性非溶原菌進(jìn)行雜交時發(fā)現(xiàn)將近一半的合子成為噬菌斑，他們稱之為合子誘導(dǎo)(zygotic induction)，提示溶原性大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)存在l原噬菌體(prophage)與細(xì)菌的平衡機制，而且這種平衡受溶原性細(xì)菌細(xì)胞中某種因子的維持，所以原噬菌體不會裂解溶原性細(xì)菌，但非溶原性細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)卻沒有這種調(diào)控因子，因而會被裂解。那么，溶原化調(diào)控因子的基因是什么？在接合的過程中何時傳到了雌性非溶原性細(xì)菌細(xì)胞中(從而導(dǎo)致非溶原性細(xì)菌裂解)呢？

為了揭示細(xì)菌接合過程中基因的傳遞細(xì)節(jié)，Wollman用廚房的攪拌器定時攪動雜交菌液以中斷它們的接合過程，然后根據(jù)噬菌斑出現(xiàn)的時間推斷控制溶原化的基因在什么時刻傳到了雌性非溶原性大腸桿菌中。他們發(fā)現(xiàn)用這種中斷雜交(interrupted mating)方法很容易分析大腸桿菌的遺傳結(jié)構(gòu)、基因組成和位置。特別是當(dāng)受體菌突然出現(xiàn)一種新表型時，就意味著它從供體菌中獲得了一個新基因，并能確定這個新基因相對于其他基因的位置。通過中斷雜交實驗，他們發(fā)現(xiàn)在接合過程中，雄性大腸桿菌會緩慢地把自己的染色體注射到雌性大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，而且對于任何一株雄性菌，注射的起點總是固定的。比較不同的Hfr菌株傳遞染色體基因的順序，Wollman等[24]推斷大腸桿菌染色體是環(huán)形的，并證實了在染色體外還存在有獨立的遺傳物質(zhì)—外質(zhì)體(episomes)，如性因子(F因子)。

1.8 其他乳糖代謝相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)

鑒于用生物化學(xué)手段再也無法進(jìn)一步解析大腸桿菌酶誘導(dǎo)原因了，而新興的微生物遺傳學(xué)研究已在巴斯德研究所展開，Monod意識到該求助于微生物遺傳學(xué)手段了。

Monod團隊的G. Cohen等[25]發(fā)現(xiàn)兩種不能利用乳糖的–突變菌株，一株不能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，因此不能代謝乳糖；而另株雖能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，但卻仍然不能代謝培養(yǎng)基中的乳糖，他們稱之為假突變體(cryptic mutant)。假突變體能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，為何不能利用培養(yǎng)基中的乳糖呢？

Monod認(rèn)為細(xì)菌要利用培養(yǎng)基中的乳糖，首先需要把乳糖攝入細(xì)胞內(nèi)部。而這個假突變體可能喪失了從培養(yǎng)基中攝取乳糖的能力。他們發(fā)現(xiàn)硫代甲基-β-D-半乳糖苷(thiomethyl-beta-D-galactoside, TMG) (圖3C)雖然不是β-半乳糖苷酶的底物，但是個強誘導(dǎo)劑。借助放射性同位素標(biāo)記，他們發(fā)現(xiàn)TMG能進(jìn)入野生型大腸桿菌并在細(xì)胞內(nèi)積累，但不能進(jìn)入假突變體大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，說明野生型大腸桿菌細(xì)胞膜上有一種特殊的蛋白能把TMG(或乳糖)運入細(xì)胞內(nèi)，他們稱之為透性酶(permease)，如果編碼透性酶的基因()突變了，大腸桿菌就不能把糖苷類分子運入細(xì)胞內(nèi)(-)。同時發(fā)現(xiàn)基因自身的表達(dá)也受β-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)。

Monod團隊的I. Zabin等[26]隨后在分析硫代半乳糖苷誘導(dǎo)前后大腸桿菌內(nèi)含物成份變化時發(fā)現(xiàn)少量的乙酰硫代半乳糖苷(6-0-acetyl-thiogalactoside)，說明細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了轉(zhuǎn)乙酰酶。同時發(fā)現(xiàn)半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶(Galac-toside transacetylase)也受β-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)。半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶可把乙酰輔酶A的乙?；D(zhuǎn)到半乳糖苷、葡萄糖苷和乳糖苷、IPTG及TMG等分子上。它們被乙酰化后排出細(xì)胞，無法再被攝入細(xì)胞，從而達(dá)到解毒目的[27]。

β-半乳糖苷酶、透性酶和轉(zhuǎn)乙酰酶共同受乳糖誘導(dǎo)，提示大腸桿菌乳糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控是個“模塊化”的開關(guān)模式，也進(jìn)一步證明誘導(dǎo)劑與所誘導(dǎo)的酶并無直接關(guān)系，而是通過某種類似開關(guān)的第三者發(fā)揮了誘導(dǎo)作用。因此解析β-半乳糖苷酶、透性酶和轉(zhuǎn)乙酰酶模塊的誘導(dǎo)機制，實質(zhì)上就是解析這些酶基因表達(dá)的調(diào)控機制。首要的工作是了解編碼這些酶的基因是以什么形式的“模塊”存在于細(xì)菌染色體上。

1.9 乳糖操縱子的組成

Monod與Jacob等[28]通過人工突變鑒定了大腸桿菌β-半乳糖苷酶、透性酶和轉(zhuǎn)乙酰酶基因及其響應(yīng)乳糖誘導(dǎo)的突變位點，并用中斷雜交法進(jìn)行了基因作圖。他們根據(jù)染色體作圖的結(jié)果和對突變體表型分析的結(jié)論于1960年提出了操縱子(operon)概念，把一組協(xié)同表達(dá)的基因稱為一個操縱子。

大腸桿菌的乳糖操縱子由編碼3個酶的基因()、()和()組成。操縱子的上游有1個基因和介于與之間的操縱區(qū)，共同構(gòu)成乳糖誘導(dǎo)模塊(圖4)。決定3種酶能否被誘導(dǎo)，稱為調(diào)節(jié)基因(regulatory gene)。、和分別決定能否產(chǎn)生有活性的3種酶，稱為結(jié)構(gòu)基因(structural genes)。lacI突變體不需要誘導(dǎo)劑也能產(chǎn)生大量的b-半乳糖苷酶、轉(zhuǎn)乙酰酶和透性酶，即結(jié)構(gòu)基因組成型表達(dá)(constitutive expression)。lacZ突變體不能被誘導(dǎo)產(chǎn)生有活性的b-半乳糖苷酶，但能被誘導(dǎo)產(chǎn)生正常的轉(zhuǎn)乙酰酶。lacA突變體不能被誘導(dǎo)產(chǎn)生有活性的轉(zhuǎn)乙酰酶，卻能被誘導(dǎo)產(chǎn)生正常的b-半乳糖苷酶。但lacY突變體類似于lacI突變體，不僅不能被誘導(dǎo)產(chǎn)生透性酶，而且也不能被誘導(dǎo)產(chǎn)生b-半乳糖苷酶，其中絕大部分突變體(并非全部)也不能被誘導(dǎo)產(chǎn)生轉(zhuǎn)乙酰酶！由此可見，調(diào)節(jié)基因的突變同時影響3個結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，而結(jié)構(gòu)基因突變則一般只影響其自身表達(dá)(突變體是個例外，導(dǎo)致誘導(dǎo)劑不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi))。顯然，調(diào)節(jié)基因并非分別直接控制3個結(jié)構(gòu)基因，而是通過一個“誘導(dǎo)機關(guān)”間接發(fā)揮控制作用，同時開關(guān)3個結(jié)構(gòu)基因。而且這個“誘導(dǎo)機關(guān)”顯然也不是3個結(jié)構(gòu)基因本身的組成部分。那么調(diào)節(jié)基因與“誘導(dǎo)機關(guān)”如何協(xié)作控制結(jié)構(gòu)基因表達(dá)呢？

1.10 調(diào)節(jié)基因控制乳糖操縱子的機制

基因在理論上可能通過兩種模式控制結(jié)構(gòu)基因表達(dá)：一種是“正控制”(positive control)模式，即野生型lacI是結(jié)構(gòu)基因表達(dá)必需的激活元件之一，但需要誘導(dǎo)劑的輔助才能激活結(jié)構(gòu)基因表達(dá)，而突變型lacI則不需要誘導(dǎo)劑輔助，獨自即可激活結(jié)構(gòu)基因表達(dá)。另一種是“負(fù)控制”(negative control)模式，即野生型lacI抑制結(jié)構(gòu)基因表達(dá)，而誘導(dǎo)劑的作用是解除lacI的抑制作用，使結(jié)構(gòu)基因表達(dá)；突變型lacI則不能抑制結(jié)構(gòu)基因表達(dá)，所以結(jié)構(gòu)基因不需要誘導(dǎo)劑即可表達(dá)。大腸桿菌采用了那種模式呢？在一次學(xué)術(shù)演講后，核物理學(xué)家Leo Szilard建議Monod考慮“負(fù)控制”機制。

其實Monod還想過lacI的另一種作用方式，即誘導(dǎo)劑才是激活結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的主角，通過誘導(dǎo)劑輔助控制結(jié)構(gòu)基因表達(dá)：野生型lacI抑制大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生“內(nèi)源性誘導(dǎo)劑”，因而需要外源誘導(dǎo)劑進(jìn)入細(xì)胞才能開啟結(jié)構(gòu)基因表達(dá)，而突變型lacI的大腸桿菌細(xì)胞能源源不斷地產(chǎn)生“內(nèi)源性誘導(dǎo)劑”，因而不需要外源誘導(dǎo)劑即可開啟結(jié)構(gòu)基因表達(dá)。

圖4 大腸桿菌K12的乳糖位點圖譜及乳糖操縱子的基因組成

上：包含乳糖位點的大腸桿菌K12部分染色體圖譜。下：乳糖操縱子的3個結(jié)構(gòu)基因：(，編碼b半乳糖苷酶)、(，編碼透性酶)和(，編碼硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶)，以及位于緊鄰結(jié)構(gòu)基因上游的操縱區(qū)()和調(diào)節(jié)基因(，編碼阻遏物)。根據(jù)文獻(xiàn)[29]繪制。

上述3種模式均難以用生物化學(xué)方法鑒定。不過，深受孟德爾遺傳學(xué)理論影響的Monod意識到，如果是二倍體生物的雜合體(lacIlacI)，在“正控制”模式下，等位基因lacI對lacI顯性，“負(fù)控制”模式下，則lacI對lacI顯性。無論誰顯性，都將說明“內(nèi)源性誘導(dǎo)劑”的想法是錯誤的，即不存在假想中的“內(nèi)源性誘導(dǎo)劑”?？墒牵竽c桿菌是單倍體生物，不存在天然的雜合體，怎么才能證明lacI和lacI誰是顯性基因呢？

加州大學(xué)伯克利分校的Edward Adelberg[30]曾到巴斯德研究所訪學(xué)，1959年報道了在分離Hfr大腸桿菌菌株的過程中發(fā)現(xiàn)一種新形式的F因子，帶有染色體上的部分基因，稱為sfa (sex factor atta-chment)，后被稱為F￠。Jacob和Adelberg[31]發(fā)現(xiàn)在接合過程中F￠能攜帶包含操縱子在內(nèi)的幾個供體染色體的基因轉(zhuǎn)移到受體大腸桿菌細(xì)胞。由于F￠能獨立于染色體穩(wěn)定地存在于細(xì)菌細(xì)胞中，導(dǎo)致其上所攜帶的供體染色體基因在受體細(xì)胞內(nèi)與受體細(xì)胞原有的相同基因同時存在，類似二倍體真核生物的等位基因，被稱為部分二倍體(merozygote) (圖5)。Jacob等[32]把這種借助F￠因子傳遞若干染色體基因的過程稱為F-duction或sex-duction (性導(dǎo))。

性導(dǎo)形成的部分二倍體類似于高等生物的同源染色體，其上攜帶的基因可形成雜合體(如圖5的F￠+–/–+)，可用于鑒定大腸桿菌野生型基因與突變型基因的顯隱性關(guān)系并研究其功能。于是Mond和Jacob合作，與來巴斯德研究所訪學(xué)的美國學(xué)者Arthur Pardee一起，用性導(dǎo)方法研究了β-半乳糖苷酶基因及其誘導(dǎo)表達(dá)模式，史稱“PaJaMo (Pardee, Jacod, Monod)”實驗[33]。他們用性導(dǎo)和部分二倍體實驗鑒定了lacI和lacI的顯隱性。帶有lacIlacZ和lacIlacZ部分二倍體的大腸桿菌乳糖操縱子(圖5)表現(xiàn)誘導(dǎo)型表達(dá)，說明lacI對lacI顯性。即，一條染色體上的lacI基因能抑制另一條染色體上的lacI基因的作用。提示在野生型(lacI)大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，結(jié)構(gòu)基因確實是被某種物質(zhì)抑制著(負(fù)調(diào)控)，需要外源誘導(dǎo)劑進(jìn)入細(xì)胞解除抑制；而在突變型(I)細(xì)胞內(nèi)，抑制劑(repressor)消失，抑制解除，不需要外源誘導(dǎo)劑，結(jié)構(gòu)基因得以組成型表達(dá)。

圖5 lacI和lacZ部分二倍體

帶有+–基因的F￠進(jìn)入基因型為–+基因大腸桿菌細(xì)胞中，導(dǎo)致和基因成為二倍體。

那么，這種抑制劑是lacI基因本身呢，還是lacI基因的表達(dá)產(chǎn)物呢？如果是lacI基因本身，即lacIDNA直接抑制其相鄰的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)(順式作用)，就不應(yīng)該抑制位于另一條染色體上與lacI基因相鄰的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，即不會表現(xiàn)顯性性狀。如果lacI基因是通過其產(chǎn)物抑制結(jié)構(gòu)基因表達(dá)(反式作用)，由于基因產(chǎn)物游離在細(xì)胞質(zhì)中，既可以抑制同一條染色體上的結(jié)構(gòu)基因，也可以抑制另一條染色體上的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)，就能表現(xiàn)顯性性狀?！癙aJaMo”實驗結(jié)果顯示基因lacI對lacI顯性，說明基因lacI起反式作用，是借助某種游離在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的阻遏物(suppressor)來抑制結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。因而，對lacI菌株中結(jié)構(gòu)基因組成型表達(dá)的最簡單解釋就是lacI突變導(dǎo)致不能產(chǎn)生阻遏物或者阻遏物喪失了抑制功能。即“負(fù)控制”模式是正確的，不存在“內(nèi)源性”誘導(dǎo)劑，外源誘導(dǎo)劑的作用實質(zhì)上是進(jìn)入細(xì)胞后解除阻遏物對結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的抑制。

lacI基因產(chǎn)物在何處同時關(guān)閉3個結(jié)構(gòu)基因表達(dá)呢？除了lacI隱性突變，Jacob和Monod[34]還分離到一種組成型表達(dá)的顯性突變c(operator，操縱區(qū))，即使部分二倍體有野生型基因+和野生型基因，c染色體上的基因和基因仍然是組成型表達(dá)，表明是順式作用元件，即DNA本身，只能控制與其在同一條DNA上的相鄰結(jié)構(gòu)基因。這說明基因與組成了一個抑制b-半乳糖苷酶表達(dá)的二元系統(tǒng)，二者缺一不可，其中一個基因突變(lacI或c)都將破壞抑制效應(yīng)，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)基因組成型表達(dá)。c突變能同時抑制b-半乳糖苷酶和轉(zhuǎn)乙酰酶兩個基因表達(dá)，說明元件也不是結(jié)構(gòu)基因本身，而是結(jié)構(gòu)基因之外的獨立區(qū)域。

根據(jù)Francis Crick[35]1958年提出的中心法則，儲存在基因里的遺傳信息需要傳到RNA中，然后再傳到蛋白質(zhì)里才能發(fā)揮作用。那么lacI基因是通過RNA還是通過蛋白質(zhì)發(fā)揮作用呢？

1.11 調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)

為了回答上述問題，Monod和Jacob[34]根據(jù)早先人們發(fā)現(xiàn)的序列像DNA的RNA (DNA-like RNA)，提出了“信使”RNA (messenger RNA, mRNA)概念，認(rèn)為DNA模板像復(fù)制自身一樣按照堿基互補原則在細(xì)胞核內(nèi)合成一條mRNA，藉此把DNA中的遺傳信息轉(zhuǎn)錄到mRNA中。mRNA到細(xì)胞質(zhì)中與核糖體結(jié)合，用所攜帶的遺傳信息指導(dǎo)合成蛋白質(zhì)。即DNA先轉(zhuǎn)錄出mRNA，mRNA再指導(dǎo)合成蛋白質(zhì)。

因此lacI基因應(yīng)該是通過mRNA或蛋白質(zhì)抑制結(jié)構(gòu)基因表達(dá)。進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌交配形成部分二倍體之前先給受體菌培養(yǎng)基中加入5-甲基色氨酸或氯霉素抑制受體菌合成蛋白質(zhì)，形成的部分二倍體仍能被誘導(dǎo)產(chǎn)生b-半乳糖苷酶。因此Jacob和Monod[34]1961年提出操縱子模型的時候認(rèn)為lacI基因所控制的阻遏物(aporepressor)應(yīng)該是它所轉(zhuǎn)錄的mRNA。他們[36]堅信阻遏物不會是小分子化合物，雖然沒有證據(jù)表明是核酸，但也不太可能是蛋白質(zhì)。

然而，俄勒岡大學(xué)的Tadao Horiuchi和Aaron Novick[37]隨后發(fā)現(xiàn)了溫度敏感型lacI突變。以往的研究表明，對溫度敏感的大分子一般是蛋白質(zhì)，而不是核酸，說明基因產(chǎn)物更有可能是蛋白質(zhì)。Jacob和Monod[38]也意識到如果阻遏物是mRNA，難以解釋它與小分子誘導(dǎo)劑的相互作用。后來哈佛大學(xué)的Walter Gilbert和Benno Muller-Hill[39]用IPTG分離了阻遏物并鑒定了其化學(xué)性質(zhì)，確認(rèn)與IPTG結(jié)合的阻遏物是蛋白質(zhì)而不是核酸。

1.12 調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物的別構(gòu)效應(yīng)

lacI基因產(chǎn)生的阻遏蛋白與元件如何同時抑制3個結(jié)構(gòu)基因表達(dá)呢？阻遏物與元件同時抑制3個緊密連鎖的結(jié)構(gòu)基因，且這種抑制效應(yīng)能被糖苷類小分子誘導(dǎo)劑解除，意味著阻遏物既能與元件相互作用，又能與糖苷類誘導(dǎo)劑相互作用，且兩種相互作用存在競爭性抑制。這就要求阻遏物本身具有特殊的空間構(gòu)象。什么類型的蛋白質(zhì)具有這樣特殊的空間結(jié)構(gòu)呢？

巴斯德研究所的Jean-Pierre Changeux[40]發(fā)現(xiàn)蘇氨酸脫氨酶(threonine-deam-inase)在酶活性不受影響的情況下可以失去抑制劑的結(jié)合位點，說明抑制劑的結(jié)合位點可以不是酶的活性位點，Monod和Jacob[36]稱之為別構(gòu)抑制(allosteric inhibition)，并把這類酶稱為別構(gòu)酶(allosteric enzyme)。這類酶應(yīng)該有兩個位點，一個是酶活性位點，另一個是與抑制劑結(jié)合的位點。受此啟發(fā)，Monod和Jacob[41]提出乳糖代謝的阻遏物應(yīng)該至少具有兩個不重疊的結(jié)合位點：一個是與DNA結(jié)合的活性位點(active site)；另一個是與小分子別構(gòu)效應(yīng)物(allosteric effector)結(jié)合的別構(gòu)位點(allosteric site)。與DNA結(jié)合的活性位點會因別構(gòu)位點與誘導(dǎo)劑結(jié)合而發(fā)生變構(gòu)(allosteric tran-sition)，Monod和Jacob稱之為別構(gòu)蛋白(allosteric protein)。

1.13 乳糖操縱子的調(diào)控模型

Monod和Jacob根據(jù)別構(gòu)蛋白理論，提出了乳糖操縱子的調(diào)控機制(圖6)：組成型表達(dá)，產(chǎn)生一種可變構(gòu)的阻遏物，與DNA結(jié)合，阻止RNA聚合酶與啟動子結(jié)合，從而抑制操縱子的3個結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄。當(dāng)培養(yǎng)基中有乳糖(且沒有葡萄糖)時，乳糖被細(xì)胞膜上的透性酶(編碼)運入細(xì)胞內(nèi)，與阻遏物結(jié)合，引起阻遏物變構(gòu)，不能再與DNA結(jié)合，從上脫落，RNA聚合酶得以與結(jié)合，轉(zhuǎn)錄操縱子的3個結(jié)構(gòu)基因。其中編碼的b-半乳糖苷酶可不斷分解進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的乳糖，生成葡萄糖，供細(xì)胞代謝。當(dāng)培養(yǎng)基和細(xì)胞內(nèi)的乳糖被分解完后，阻遏物又與DNA結(jié)合，阻止RNA聚合酶與結(jié)合，關(guān)閉操縱子。

乳糖操縱子模型第一次闡明了環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)控細(xì)菌基因表達(dá)的分子機制，與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型一起引導(dǎo)遺傳學(xué)乃至生物學(xué)整體研究進(jìn)入了分子水平，成為生命科學(xué)發(fā)展史上的一個里程碑，并作為經(jīng)典案例被載入遺傳學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等多門學(xué)科的教科書中，是遺傳學(xué)課程必講的案例。然而，粗淺地介紹Jacob和Monod模型容易，結(jié)合后來對大腸桿菌乳糖代謝各個環(huán)節(jié)的精細(xì)研究結(jié)果精準(zhǔn)講解該模型并非易事，師生都必須面對若干難以解釋的現(xiàn)象甚至悖論。下文將分享回答這些問題的思路。

圖6 大腸桿菌乳糖操縱子的組成結(jié)構(gòu)及其調(diào)控原理

大腸桿菌乳糖操縱子由緊密連鎖的3個結(jié)構(gòu)基因(編碼b-半乳糖苷酶)、(編碼透性酶)和(編碼硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶)，以及位于緊鄰結(jié)構(gòu)基因上游的2個調(diào)控元件，(啟動子)和(操縱區(qū))組成。它們共同受臨近上游的一個調(diào)節(jié)基因(編碼阻遏物)的控制。A：當(dāng)培養(yǎng)基中無乳糖時，阻遏物與結(jié)合，阻止RNA聚合酶(RNAP)與結(jié)合。RNAP不能轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)基因。B：當(dāng)培養(yǎng)基中有乳糖時，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的乳糖(實際上轉(zhuǎn)變?yōu)楫惾樘?與阻遏物結(jié)合，使阻遏物不能再與結(jié)合，RNAP可以與結(jié)合，轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)基因。

2 乳糖操縱子教學(xué)中的若干問題解析

2.1 乳糖操縱子調(diào)控模型的悖論

上述調(diào)控模型揭示，大腸桿菌進(jìn)化出了一種巧妙的誘導(dǎo)機制，用代謝的靶標(biāo)分子作為啟動代謝通路的鑰匙，形成了一個自動啟閉回路。環(huán)境中有乳糖時自然啟動表達(dá)分解乳糖的基因，當(dāng)乳糖被分解完后，分解乳糖的基因也隨即被關(guān)閉，既能利用靶標(biāo)，又能最大限度地節(jié)約自身的資源。

但大腸桿菌這一自動啟閉回路似乎并不完美，因為Monod等從測定大腸桿菌的b-半乳糖苷酶活性開始就發(fā)現(xiàn)即使培養(yǎng)基中沒有乳糖等糖苷類化合物，大腸桿菌也并非完全不表達(dá)b-半乳糖苷酶，只是表達(dá)水平很低而已。當(dāng)培養(yǎng)基中有乳糖等誘導(dǎo)劑時，表達(dá)量會上千倍地增加。

既然是誘導(dǎo)型調(diào)控，當(dāng)培養(yǎng)基中沒有乳糖時，大腸桿菌應(yīng)該徹底關(guān)閉乳糖操縱子才是最節(jié)省的模式，為什么它允許操縱子低水平表達(dá)呢？原來，水溶性的乳糖并不能自由擴散穿過細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，而是需要膜上的透性酶蛋白幫助才能進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)(IPTG進(jìn)入細(xì)胞不依賴于透性酶)。由于編碼透性酶的基因()自身也是乳糖操縱子的成員，所以無論培養(yǎng)基中是否有乳糖，大腸桿菌都得先合成少量的透性酶裝配到細(xì)胞膜上，隨時準(zhǔn)備把外界的乳糖運入細(xì)胞內(nèi)。

其次，盡管乳糖能誘導(dǎo)野生型大腸桿菌的乳糖操縱子表達(dá)，Monod等[42]1965年發(fā)現(xiàn)乳糖并不能誘導(dǎo)–突變株大腸桿菌產(chǎn)生轉(zhuǎn)乙酰酶，說明乳糖自身并不能誘導(dǎo)乳糖操縱子，需要b-半乳糖苷酶的幫助才能成為該操縱子的誘導(dǎo)劑。那么b-半乳糖苷酶到底對乳糖進(jìn)行了何種改造使其成為誘導(dǎo)劑？

印第安納大學(xué)的Müller-Hill等[43]1964年報道乳糖的異構(gòu)體異乳糖(allolactose) (圖3B)也是乳糖操縱子的有效誘導(dǎo)劑之一。乳糖與異乳糖的區(qū)別是糖苷鍵的位置不同，乳糖是b-1,4糖苷鍵，而異乳糖是b-1,6糖苷鍵。索爾克研究所的Alan Jobe和Suzanne Bourgeois[44]意識到乳糖在細(xì)胞內(nèi)可能被b-半乳糖苷酶催化變成異乳糖才能發(fā)揮作用，于1972年證實乳糖操縱子的天然誘導(dǎo)劑其實是異乳糖，且誘導(dǎo)效率優(yōu)于IPTG。即b-半乳糖苷酶有3種功能：(1)把一個乳糖分子直接水解為一個半乳糖和一個葡萄糖分子；(2)催化乳糖發(fā)生轉(zhuǎn)糖基作用(transgly-cosylation)形成異乳糖[45]；(3)把異乳糖也進(jìn)一步分解為半乳糖和葡萄糖[46]。被透性酶運入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的一部分乳糖還要被b-半乳糖苷酶催化變成異乳糖才能誘導(dǎo)乳糖操縱子大量表達(dá)，因此無論培養(yǎng)基中是否有乳糖，大腸桿菌都得先合成少量的b-半乳糖苷酶，在細(xì)胞質(zhì)中隨時準(zhǔn)備把透性酶運入的乳糖轉(zhuǎn)變?yōu)楫惾樘恰?/p>

上述兩個事件要求至少兩個乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)基因必須是低水平的組成型表達(dá)，當(dāng)被迫以乳糖為生時才能誘導(dǎo)產(chǎn)生更多代謝乳糖的酶。因此，乳糖操縱子實際上是組成型表達(dá)基礎(chǔ)上的誘導(dǎo)型表達(dá)，盡管能在很大程度上避免資源浪費，但還無法做到在不利用乳糖時徹底關(guān)閉乳糖操縱子。假如大腸桿菌細(xì)胞表面有個乳糖受體，接收到培養(yǎng)基中的乳糖信號后才能激活細(xì)胞內(nèi)的乳糖操縱子表達(dá)，可能更為經(jīng)濟。

大腸桿菌如何實現(xiàn)組成型和誘導(dǎo)型的統(tǒng)一呢？理解乳糖操縱子表達(dá)特點的關(guān)鍵在于該操縱子的調(diào)控序列結(jié)構(gòu)。

2.2 乳糖操縱子調(diào)控區(qū)的結(jié)構(gòu)特點

在大腸桿菌K-12基因組(LN832404)中，乳糖代謝基因簇位于基因與之間(圖7)。從編碼區(qū)的最后17 bp至基因起始密碼子前的141 bp DNA (圖7，左下)中包含了3個啟動子[47]()和一個“隱蔽啟動子”() ()[48]；2個操縱區(qū)(、)和一個分解代謝激活蛋白(CAP-cAMP)結(jié)合位點。、和均位于CAP-cAMP結(jié)合位點與之間，將受制于葡萄糖和阻遏物雙重抑制。其中[49]和的活性很差[47,50]，與大腸桿菌啟動子的一致序列(consensus sequence)同源性最高(圖7，右上)，是最強的啟動子，是教科書里列舉的。

“隱蔽啟動子”位于CAP-cAMP結(jié)合位點上游，不受葡萄糖影響。其?35 box位于上游基因的3￠端編碼區(qū)內(nèi)，?10 box雖然與重疊，但與阻遏物結(jié)合非常弱[51]，因此也幾乎不受阻遏物影響，可以驅(qū)動乳糖操縱子組成型表達(dá)，但核心序列與一致序列相差較大(圖7，右上)，因而啟動活性并不強，這是大腸桿菌乳糖操縱子低水平組成型表達(dá)的原因之一。

其次，與之間的123 bp DNA內(nèi)應(yīng)該有個轉(zhuǎn)錄終止子()，以結(jié)束轉(zhuǎn)錄，但實際上這段序列中并無典型的不依賴于rho終止子(rho-independent terminator)序列。耶魯大學(xué)的Heidi Horowitz和Terry Platt[52]在這段DNA中鑒定出一個轉(zhuǎn)錄終止子(圖7，左下箭頭下的序列)，所轉(zhuǎn)錄的RNA能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，但其后不帶一串U (圖7，右下)。體外實驗顯示這個終止子只有20%~90%的轉(zhuǎn)錄終止效率，但不受rho或nusA蛋白的影響。由此可見的終止效率不很強，可能導(dǎo)致RNA聚合酶在轉(zhuǎn)錄完基因后偶爾繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，把其后的等結(jié)構(gòu)基因也轉(zhuǎn)錄出來，這可能是乳糖操縱子低水平組成型表達(dá)的另一個原因。

圖7 大腸桿菌乳糖操縱子的調(diào)控區(qū)序列特點

序列來自GenBank LN832404。基因上方的數(shù)字是各基因起始密碼到終止密碼的核苷酸序號，下面的數(shù)字是對應(yīng)區(qū)段的長度(核苷酸數(shù))。小寫字母表示編碼區(qū)的堿基，大寫字母表示上一個基因的終止密碼至下一個基因的起始密碼之間的堿基。4個啟動子的核心元件分別用?35(c) ?10(c)、?35(2) ?10(2)、?35(3) ?10(3)和?35(1) ?10(1)表示。雙下劃線和方框內(nèi)字母表示啟動子的?35 box和?10 box序列，虛下劃線表示、和及CAP-cAMP結(jié)合位點的回文序列，波浪下劃線表示SD序列。箭頭下面的序列是基因的終止子()，其轉(zhuǎn)錄物能形成右側(cè)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。

2.3 lacI基因自身的表達(dá)調(diào)控

在大腸桿菌染色體上只有一個乳糖操縱子?；蛑恍瓒糁谱∵@一個操縱子轉(zhuǎn)錄即可，因此基因既要組成型表達(dá)，又不需要表達(dá)很多。大腸桿菌如何做到恰如其分地表達(dá)基因呢？

野生型的啟動子()雖然是個組成型啟動子，但核心序列中GC含量太高，且與一致序列差異較大(圖7，右上)，因此它的啟動效率確實非常弱，在每一代細(xì)胞中只轉(zhuǎn)錄1~2次，每個細(xì)胞只有約10個阻遏蛋白分子[39]。

那么，如此少的阻遏蛋白分子如何高效地抑制了操縱子轉(zhuǎn)錄呢？

2.4 阻遏蛋白高效抑制操縱子轉(zhuǎn)錄的機制

阻遏蛋白分子與操縱區(qū)的親和力很高。位于的?10 box下游，與轉(zhuǎn)錄起始位點重合(圖7，左下)[53]，因此，如果阻遏物結(jié)合到上，則很可能阻止RNA聚合酶與啟動子結(jié)合或者阻止已經(jīng)結(jié)合的RNA聚合酶向下轉(zhuǎn)錄操縱子。

不僅如此，乳糖操縱子DNA中另有2個能與阻遏物結(jié)合的位點，分別稱為[54]和[55]。位于下游，在基因內(nèi)部的互補鏈上，距的起始密碼子370 bp (圖7，上中)，距約140 nm，與方向相反；位于的上游，在CAP-cAMP結(jié)合位點之前。的序列特點是回文序列(AATTGTgagcggataACAATT)，因此每個DNA可以結(jié)合兩個阻遏蛋白分子。序列(AATTGT agcgagtaACAACC)與同源性較高，與阻遏物的親合力約相當(dāng)于的50%。由于阻遏蛋白能互相結(jié)合成4聚體，結(jié)合在上的兩個阻遏蛋白分子與結(jié)合在上的兩個阻遏蛋白分子[56]能互相結(jié)合成4聚體，使乳糖操縱子DNA彎曲成為一個小環(huán)[57]更有效地阻止環(huán)內(nèi)的RNA聚合酶前進(jìn)[58]。此外，借助阻遏蛋白的4聚化作用，結(jié)合到上的兩個阻遏蛋白分子將大大提高鄰近的吸引阻遏蛋白分子的機會。因此，10個阻遏蛋白分子即可有效地與和結(jié)合，抑制操縱子轉(zhuǎn)錄。序列(GGCAGTgagcg-caacGCAATT)與同源性較差，與阻遏物的親和力很低，對乳糖操縱子的調(diào)控作用不大。

用盡可能少量的阻遏物去關(guān)閉操縱子也有利于誘導(dǎo)劑快速移除阻遏物，開啟轉(zhuǎn)錄。一旦結(jié)合在和上的阻遏蛋白被誘導(dǎo)劑移除，RNA聚合酶就會按順序轉(zhuǎn)錄乳糖操縱子的3個結(jié)構(gòu)基因[59]。

在最后一個結(jié)構(gòu)基因的下游有一段DNA，其轉(zhuǎn)錄物會形成兩個莖環(huán)結(jié)構(gòu)[60]，UGUUU緊隨第2個莖環(huán)(圖8)，構(gòu)成了典型的不依賴rho的轉(zhuǎn)錄終止子，能有效地終止結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄出一條帶有3個開放閱讀框(ORF)的多順反子(polycistronic) mRNA。

2.5 乳糖操縱子的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控

由于、和的起始密碼子前均有SD序列，因此核糖體可以分別獨立翻譯多順反子mRNA上的3個ORF，產(chǎn)生3條獨立的多肽，且理論上產(chǎn)量相等。但人們發(fā)現(xiàn)乳糖操縱子的表達(dá)實際上具有自然極性(natural polarity)[61]，即第一個結(jié)構(gòu)基因的產(chǎn)物b-半乳糖苷酶的分子數(shù)是最后一個結(jié)構(gòu)基因的產(chǎn)物轉(zhuǎn)乙酰酶分子數(shù)的3~5倍。華盛頓大學(xué)的David Kennell和Howard Riezman[62]測定和計算了乳糖操縱子的表達(dá)量，也得出結(jié)論類似的結(jié)果。理論上同時轉(zhuǎn)錄和翻譯的乳糖操縱子為何不能產(chǎn)生等量的b-半乳糖苷酶和轉(zhuǎn)乙酰酶呢？

b-半乳糖苷酶分子數(shù)遠(yuǎn)多于轉(zhuǎn)乙酰酶分子數(shù)的原因在理論上可能有3方面：(1) RNA聚合酶可能并非總能把操縱子完整地轉(zhuǎn)錄出來，而是在轉(zhuǎn)錄到基因后的某處提前終止了，導(dǎo)致包含的mRNA比包含的mRNA多；(2)核糖體翻譯mRNA的起始效率比翻譯mRNA高；(3)mRNA比mRNA降解的更快。究竟是哪種原因呢？

圖8 lacA基因終止密碼與下游CynX基因(位于互補鏈上)之間的序列及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物

小寫字母為基因的3￠端，下劃線為基因終止密碼的互補序列。方框內(nèi)的序列轉(zhuǎn)錄的RNA可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)(下)，右面的莖環(huán)結(jié)構(gòu)為典型的不依賴rho轉(zhuǎn)錄終止子。

首先想到的原因就是轉(zhuǎn)錄提前終止，而乳糖操縱子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)基因間隔區(qū)內(nèi)確實有回文序列，轉(zhuǎn)錄出的mRNA可能形成轉(zhuǎn)錄終止子樣的莖環(huán)結(jié)構(gòu)(圖9)。美國國立癌癥研究所的Benoit De Crom-brugghe等[63]的體外轉(zhuǎn)錄實驗發(fā)現(xiàn)，添加高濃度rho因子會導(dǎo)致乳糖操縱子轉(zhuǎn)錄提前終止，暗示乳糖操縱子內(nèi)部有依賴于rho因子的轉(zhuǎn)錄終止子。但華盛頓大學(xué)的Louis Lim和Kennell[64]發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶在細(xì)胞內(nèi)總能把乳糖操縱子完整地轉(zhuǎn)錄出來。加州大學(xué)舊金山分校的George Murakawa等[65]分析了細(xì)胞內(nèi)乳糖操縱子轉(zhuǎn)錄出來的mRNA，也發(fā)現(xiàn)90%以上的mRNA長度完整。他們還鑒定了與基因之間的回文序列(圖9B)在細(xì)胞內(nèi)終止轉(zhuǎn)錄的能力。盡管這個回文序列轉(zhuǎn)錄出的RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)之后緊隨4個U，非常像不依賴rho的轉(zhuǎn)錄終止子，但在細(xì)胞內(nèi)卻不能有效地終止轉(zhuǎn)錄。因此，mRNA和mRNA形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)(圖9)并非轉(zhuǎn)錄終止子，可能是防止3￠外切核酸酶攻擊mRNA的3￠端[65]。因此轉(zhuǎn)乙酰酶產(chǎn)量低的原因并非乳糖操縱子轉(zhuǎn)錄提前終止。

另一種原因可能是mRNA的穩(wěn)定性，即包含lacA密碼的mRNA部分被降解。mRNA的失活機制可能有3種：(1)游離末端被外切核酸酶進(jìn)攻，如色氨酸操縱子mRNA的5￠外切核酸降解(5'exonucleolytic breakdown)[66,67]；(2)mRNA被從內(nèi)切酶從中切斷；(3)mRNA內(nèi)部的特定位點被切斷，如多順反子mRNA上每個基因的核糖體結(jié)合位點[68]。巴斯德研究所的A. Kepes[59]分析了乳糖操縱子的轉(zhuǎn)錄、翻譯和mRNA降解(mRNA decay)順序，并測定了lac mRNA的降解速率，發(fā)現(xiàn)編碼轉(zhuǎn)乙酰酶的mRNA的半衰期比編碼b-半乳糖苷酶的短，認(rèn)為這可能是轉(zhuǎn)乙酰酶產(chǎn)量低的原因。后來華盛頓大學(xué)的Martin Blundell等[69]也研究了mRNA降解的 機制，發(fā)現(xiàn)mRNA的半衰期比mRNA短約2倍。

圖9 乳糖操縱子內(nèi)部的基因間隔區(qū)序列及轉(zhuǎn)錄出的RNA可能形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)

A：終止密碼與起始密碼之間的DNA序列(上)和轉(zhuǎn)錄出的RNA可能形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)(下)；B：終止密碼與起始密碼之間的DNA序列(上)和轉(zhuǎn)錄出的RNA可能形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)(下)。方框表示回文序列，下劃線表示SD序列。

Lim和Kennell[64]、Blundell和Kennell[70]在分析乳糖操縱子的轉(zhuǎn)錄物時還發(fā)現(xiàn)lac多順反子mRNA在細(xì)胞內(nèi)被切割成大約單個基因長度的mRNA片段，然后各自以不同的速率按5￠?3￠方向降解。結(jié)合核糖體少的mRNA片段(mRNA)比結(jié)合核糖體多的mRNA片段(mRNA)更易被降解[71]。mRNA的降解模型說明mRNA降解更快是轉(zhuǎn)乙酰酶產(chǎn)量低的原因之一。

mRNA片段的翻譯效率也應(yīng)該是影響轉(zhuǎn)乙酰酶蛋白產(chǎn)量的原因之一。Kennell 和Riezman[62]分析了乳糖操縱子mRNA上的核糖體密度，發(fā)現(xiàn)lacA mRNA上的核糖體只有l(wèi)acZ mRNA上的約1/5，說明轉(zhuǎn)乙酰酶的翻譯效率低。此外基因的起始密碼子是UUG而不是AUG，可能也會導(dǎo)致翻譯起始效率差。總之，轉(zhuǎn)乙酰酶產(chǎn)量遠(yuǎn)低于b-半乳糖苷酶可能是由lac mRNA降解模式和效率及mRNA翻譯效率的差異共同引起的。

3 結(jié)語

本文梳理了乳糖操縱子的發(fā)現(xiàn)過程，總結(jié)了乳糖操縱子表達(dá)研究的部分結(jié)果，結(jié)合乳糖操縱子的DNA序列結(jié)構(gòu)，回答了乳糖操縱子教學(xué)過程中可能遇到的若干問題。限于篇幅，本文未涉及葡萄糖影響乳糖操縱子表達(dá)的分子機制。全文沿科學(xué)史脈絡(luò)，用原始文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)，以乳糖操縱子為案例，力圖真實地再現(xiàn)科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)問題和解決問題的科研思想和歷程，讓這個遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的經(jīng)典教學(xué)案例在培養(yǎng)本科生的科學(xué)素養(yǎng)和創(chuàng)新能力中發(fā)揮更大的作用。作者也希望通過對乳糖操縱子科研背景的深入挖掘引導(dǎo)讀者自覺挖掘其他案例的科研背景和教學(xué)價值。

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The establishment process of lac operon model and the analysis of several teaching problems

Wanjin Xing

Gene structure and expression regulation mechanism are the research hotspots and focus of modern life sciences. The lac operon is a cluster of genes through whichcatabolizes lactose. It was first proposed by F. Jacob and J. Monod, who were also awarded the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1965 for their contributions. Thereafter, the lac operon has become the classic teaching case of the gene regulation mechanism in microbiology, genetics and molecular biology, and been highly valued by teachers and students alike. Although the conclusion is easy to follow and memorize, its rich connotation and esoteric reasoning has rendered it difficult to understand, neither is it easy for teachers to fully exploit the advantages of this teaching case. Therefore it is necessary to have an in-depth understanding of the genetic structure and working principle of the lac operon, especially the scientific background and thinking process through which scientists revealed these mysteries. In this paper, the historical discovery and analysis process of thelac operon was reviewed by following their footprints, listening to their analysis of experimental results. Based on the DNA sequences, the reasons for several unusual phenomena of lac operon expression were also discussed to exemplify the teaching value of the classic cases in genetics and molecular biology.

genetics; case teaching; lac operon; gene regulation

2019-03-27;

2019-05-13

遺傳學(xué)課程群教學(xué)團隊建設(shè)項目，內(nèi)蒙古大學(xué)精品資源共享課程建設(shè)項目，混合式教學(xué)課程建設(shè)項目和研究生精品課程建設(shè)項目資助[Supported by the Teaching Team Construction Project of Genetics Course Group and the Curriculum Construction Projects of Inner Mongolia University]

邢萬金，博士，教授，研究方向：細(xì)胞分子生物學(xué)。E-mail: xwanjin@imu.edu.cn

10.16288/j.yczz.19-084

2019/5/24 7:27:00

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190524.0726.002.html

(責(zé)任編委: 謝建平)